Часть Ⅱ: Сверхэкспрессия PKD1 вызывает поликистозную болезнь почек
Mar 16, 2022
Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com
Каролин Тивьерж, Альмира Курбегович, Мартен Куйяр, Ришар Гийом, Оливье Коте и Мари Трудель
Патогенетические механизмы, лежащие в основеаутосомно-доминантный поликистоз почек(АДПКБ) еще предстоит выяснить. Хотя есть данные, что PKD1 (поликистоз почек 1) гаплонедостаточность гена и потеря гетерозиготности могут вызывать образование кист у мышей, парадоксально высокие уровни PKD1 (поликистоз почек 1) экспрессия была обнаружена в почках пациентов с АДПБП (аутосомно-доминантным поликистозом почек). Чтобы определить, является ли PKD1 (поликистоз почек 1) усиление функции может быть патогенетическим процессом, PKD1 (поликистоз почек 1) бактериальная искусственная хромосома PKD1 (поликистоз почек 1)-ВАС) модифицировали путем гомологичной рекомбинации, чтобы нацелить исключительно на устойчивую PKD1 (поликистоз почек 1) экспрессия преимущественно во взрослую почку. Было создано несколько трансгенных линий, которые специфически сверхэкспрессировали PKD1 (поликистоз почек 1) трансген в почках 2- 15-складывается по сравнению с PKD1 (поликистоз почек1) эндогенные уровни. У всех трансгенных мышей воспроизводимо развились тубулярные и гломерулярные кисты и почечная недостаточность, и они умерли от почечной недостаточности. Эта модель демонстрирует, что сверхэкспрессия PKD1 дикого типа (поликистоз почек 1) достаточно, чтобы вызвать цистогенез, напоминающий АДПКП человека (аутосомно-доминантныйполикистоз почек). Наши результаты также выявили поразительно повышенную экспрессию c-Myc в почках у мышей из всех трансгенных линий, что указывает на то, что c-Myc является критическим нижестоящим эффектором PKD1 in vivo.поликистоз почек 1) молекулярный путь. Это исследование не только произвело неоценимую и первую PKD（поликистоз почек）модель для оценки молекулярного патогенеза и терапии, но также предоставляет доказательства того, что усиление функции может быть патогенетическим механизмом при АДПБП (аутосомно-доминантный поликистоз почек).
НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ЧАСТЬ Ⅰ
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Производство ПКД1 (поликистоз почек 1)-Ac-BAC путем гомологичной рекомбинации. Чтобы определить, является ли PKD1 (поликистоз почек 1) одного только усиления функции достаточно, чтобы вызвать фенотип ADPKD (аутосомно-доминантный поликистоз почек), мы сначала выделили геномный клон, содержащий полную PKD1 (поликистоз почек 1) в векторной библиотеке BAC 129/Sv. Эту библиотеку скринировали с помощью ПЦР с двумя наборами праймеров для PKD1 (поликистоз почек 1) ген, который охватывает экзон 1 на 5'-конце и экзоны с 39 по 40 ближе к 3'-концу (рис. 1). Положительный клон BAC для PKD1 (поликистоз почек 1) был идентифицирован ген, включающий все соседнее тело гена Tsc2. Вставка PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) была подробно охарактеризована, чтобы убедиться, что геномная структура соответствует эндогенной PKD1 (поликистоз почек1) ген мышиной линии 129/Sv, от которой была получена вставка, и от инбредной линии C57BL/6J. Геномные карты PKD1 (поликистоз почек 1) локуса в BAC и в этих инбредных штаммах с помощью Саузерн-блоттинга с четырьмя расщеплениями рестрикционными ферментами и семью зондами, охватывающими всю PKD1 (поликистоз почек 1) оказались идентичными без признаков перестроек (рис. 1). Этот BAC содержал вставку -121-kb, включая ~37 kb восходящей и -39 kb нижестоящей последовательности PKD1 (поликистоз почек1) ген, определенный с помощью электрофореза и секвенирования.
ИНЖИР. 2.Получение конструкций SBPkdlrAc и трансгенных мышей. ( а ) На мышином Pkdl-ВАС были проведены последовательные события гомологичной рекомбинации для введения двух модификаций: регуляторные элементы SB, вставленные непосредственно перед кодоном инициации Pkdl, и молчащая точечная мутация EcoRI (RI *), введенная в экзон (ex) 10. Вектор рекомбинации ВАС содержит точку начала репликации R6Ky, ген устойчивости к ампициллину, ген SacB, ген RecA и уникальный сайт клонирования Smal, в котором были клонированы регуляторные элементы "SB" (или мутация точки молчания в экзоне 10). с фланкирующими плечами гена Pkd1. Вектор рекомбинации ВАС подвергали электропорации в клетки E, coli (DH10B), содержащие Pkd1-ВАС дикого типа, и после селекции происходило первое событие гомологичной рекомбинации через одно из двух плеч Pkd1 с получением коинтегратов ВАС. Вектор рекомбинации и дублированные области Pkd1 коинтегратов ВАС удаляли на втором этапе селекции. Разрешенные Pkdl-ВАС могут либо возвращаться к дикому типу, либо включать предполагаемую модификацию. Затем может быть проведена последующая гомологичная рекомбинация во вновь модифицированный ВАС. (b) (Иеномная ДНК SBPkd l-eтрансгенного mxce была проанализирована с помощью Саутерн-блоттинга. - к хвосту и/или хвост к хвосту. 5'-конец анализировали путем расщепления геномной ДНК с помощью HindIII и гибридизовали со специфическим трансгенным зондом SB (левая панель). Все три линии трансгенных мышей генерировали ожидаемые 10 полоса .9-kb для вставки "голова к хвосту"; дополнительная полоса, наблюдаемая в линии 39, скорее всего, представляет собой фрагмент соединения между SB и геномом мыши. Внутренняя целостность трансгена отслеживалась с помощью нескольких расщеплений рестрикционными ферментами, и показан один репрезентативный блот геномной ДНК, расщепленной с помощью EcoRI и гибридизованной с зондом Pkdl (экзон 7-15) (средняя панель).
Этот СБПКД1 (поликистоз почек 1)-ВАС-клон был модифицирован двумя последовательными событиями гомологичной рекомбинации в E. coli. Ген PKD1 (поликистоз почек 1) был помечен в экзоне 10 путем замены нуклеотида (G на A) для создания нового сайта EcoRI в положении 2355 на карте кДНК. Эта молчащая точечная мутация была произведена для того, чтобы отличить PKD1 (поликистоз почек 1) ген и транскрипт ВАС эндогенного происхождения. Кроме того, мы заменили 5'-регуляторные элементы PKD1 (поликистоз почек 1)-ВАС, используя преимущества ранее идентифицированных "SB" специфичных для почечного эпителия элементов из конструкции-трансгена SBM (связанной с c-Myc) или SBF, связанной с c-fos), для ограничения экспрессии в почках (36, 38) (рис. 2а).
Этот новый SBPkdlrAG-BAC был расщеплен с помощью NotL, уникального сайта, расположенного непосредственно перед элементами SB, и ClaI в теле гена Tsc2, усекая регуляторные элементы Tsc2 и 5'-половину тела гена, чтобы гарантировать отсутствие T'sc2. экзогенной экспрессии во всех тканях и для удаления прокариотических ВАС-векторных последовательностей (фиг.1 и 2). Этот линеаризованный фрагмент 70-kb NotI-ClaI был выделен и очищен. и количественный анализ для микроинъекции ооцитов (36).
ПРЕИМУЩЕСТВА CISTANCHE: ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЧЕК
Получение и анализ трансгенных мышей SBPkdl-ac. Четыре трансгенных основателя, несущие несколько копий трансгена SBPkdlrAc, постоянно развивали PKD. Из четырех СБПКД1 (поликистоз почек 1) Мыши-основатели RAC, определенные Саузерн-анализом, три SBPKD1 (поликистоз почек 1) TAG-трансгенные линии были созданы с двумя-девятью копиями трансгена (рис. 2b). Характеристика целостности трансгена в этих линиях контролировалась с помощью 5'-, внутренних и 3'-зондов, как показано в репрезентативных примерах на рис. 2b. В трансгенных линиях с помощью зонда 5'"SB" была обнаружена полоса длиной 10,9 т.п.н., соответствующая SBPkdlrAc. трансген интегрируется в ориентации «голова к хвосту» и с помощью 3'-зонда выявляется полоса размером 7,1-kb (рис. 2b). Кроме того, внутренний зонд обнаружил полосу 9,4-kb эндогенной PKD1 (поликистоз почек 1), а также полосы 6,9-kb и 2,5-kb трансгена. за счет сайта вставки EcoRI в экзоне 10 (рис. 2б). Эти мыши содержали полные копии трансгена на основании анализа перекрывающейся структуры генома.
ПКД1 (поликистоз почек 1) усиление функции у взрослых трансгенных мышей SBPkdl-Ac. Экспрессия SBPkdl-AG. трансген и PKD1 (поликистоз почек 1) ген исследовали в различных органах. Количественную оценку уровней транскриптов трансгенного и/или эндогенного гена проводили с помощью нозерн-блоттинга (рис. 3а). Как и ожидалось, трансгенные и эндогенные транскрипты генов были одинаковой длины (14,2 т.п.н.). Основываясь на контрольной экспрессии GAPDH, в почках всех линий мышей SBPkd 1 A наблюдалась постоянно повышенная экспрессия транскриптов по сравнению с нормальной PKD1 (поликистоз почек 1) уровни в почках взрослых (n=3) того же возраста. Почечный трансген и эндогенная экспрессия для различных трансгенных линий демонстрируют диапазон от 2- до 15-кратного превышения контрольной почечной эндогенной PKD1.(поликистоз почек 1)уровни (рис. 3а). В частности, трансгенная линия 39 (n=4) показала более высокую PKD1 (поликистоз почек 1) выше, чем строки 3 (n=3) и 41 (n=4). Кроме того, PKD1 (поликистоз почек 1) уровни экспрессии, измеренные с помощью нозерн-блоттинга, коррелировали с уровнями, полученными с помощью ПЦР в реальном времени с использованием праймеров в экзонах 1 и 2 (рис. 3b).
РИС.3.Анализ почечной экспрессии мышей SBPkdlrA. ( а ) Анализ экспрессии транскриптов эндогенного (эндо) Pkd1 и трансгена SBPkdlrA (Tg) в почках трех трансгенных линий с помощью Нозерн-блоттинга. Два образца из каждой трансгенной линии, 3, 39 и 41, сравнивали с эндогенным почечным транскриптом Pkd1 мышей нормального контроля того же возраста из того же генетического фона (C5BI 6I ×CBA/DE, образцы почечной РНК были получены от трансгенных мышей до терминальная стадия почечной недостаточности. Транскрипты из endo и Tg имеют длину -14.2 т.п.н. Систематическая сверхэкспрессия транскриптов наблюдалась в почках всех трансгенных мышей по сравнению с нетрансгенными контролями. GAPDH использовали в качестве внутреннего контроля для загрузки.Количественная оценка почечной экспрессии у этих трансгенных мышей варьировалась от 2- до 15-кратной по сравнению с эндогенными уровнями Pkd1 у контрольных мышей, произвольно установленными на уровне 1. (b) Схематическое изображение трансгена SBPkdl- и праймеров использовали для амплификации всего Pkdl, включая эндогенный и трансгенный (экзон 1 и экзон 2), и только трансген Pkd1 (B. экзон 2) с помощью ПЦР в реальном времени и полуколичественной ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР-анализ экспрессии трансгена SBPkdlAc количественно определяли в почках. и дополнительно ткани почек. Показана репрезентативная полуколичественная оценка трансгена SBPkdl.Ac (Tg), которая включает образец почечной ткани (К) от одной мыши всех трех трансгенных линий (3, 39 и 41) и внепочечных тканей. Н, сердце; Лу, легкое; Б. мозг; Ли, печень; и S. spleen от мыши линии 39. Экспрессия трансгена легко обнаруживается в почках всех трансгенных мышей, тогда как во внепочечных тканях она слаба или не обнаруживается. Экспрессия трансгена SBPkd1rAc давала специфический ампликон 307-bp, тогда как внутренний контроль S16 генерировал ампликон 102-bp. М, 100-маркер п.н.; H, O, отрицательный контроль для ПЦР-амплификации. (c) Анализ экспрессии SBPkdlr методом ПЦР в реальном времени. Трансген был определен у нескольких независимых мышей. Трансген SBPkdl.Ac из трех линий трансгенных мышей 3 (n=5), 39 (n =7) и 41 (n=5) показал, что линии 39 и 41 имели самые высокие уровни почечной экспрессии. Экспрессию трансгена SBPkdlrAc во внепочечных тканях мышей (n=3) трех трансгенных линий оценивали с помощью ПЦР в реальном времени. По сравнению с почками каждой трансгенной линии (100 %), анализ внепочечных тканей показал, что уровни экспрессии трансгенов были постоянно ниже в 10-–1,000-кратах в головном мозге, сердце, печени, поджелудочной железе. , селезенка и легкие. (d) Экспрессия эндогенного гена c-mc в почках SBPkdl.Ac с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР. Схематическая иллюстрация показывает праймеры, используемые для амплификации c-Myc. Как и ожидалось, экспрессия c-Myc минимальна во взрослых нетрансгенных почках (контроль). Напротив, повышенная экспрессия c-Mye обнаружена во всех взрослых почках SBPkdlrAc трех линий, как это наблюдается в трансгенных почках взрослых SBM, используемых в качестве положительный контроль. Ампликон c-Myc составлял 250 п.н.; ампликон S16, внутренний контроль, был 102 п.н. M, маркер 100-п.н.
Конкретно количественную оценку уровней экспрессии трансгена проводили с помощью ПЦР в реальном времени и полуколичественной ОТ-ПЦР в трех трансгенных линиях во взрослом возрасте с использованием праймеров в 5'-нетранслируемой области (промотор B, -globin) и в экзоне 2 PKD1. (поликистоз почек 1)(рис.3б). СБПКД1 (поликистоз почек 1) Экспрессию RAC у трансгенных мышей сравнивали с продуктом гена рибосомного белка S16 в качестве внутреннего стандарта. Условия, использованные для полуколичественной амплификации ОТ-ПЦР, находились в пределах линейного диапазона. Экспрессия трансгена с помощью ПЦР в реальном времени и полуколичественной ОТ-ПЦР последовательно и специфически показала самую высокую экспрессию в почках всех трансгенных линий по сравнению с другими органами (рис. 3b и c). Уровни почечной экспрессии для отдельного образца были воспроизводимы любым из используемых методов обнаружения. Самый высокий уровень PKD1 (поликистоз почек 1) экспрессию трансгена в почках измеряли для линий 39 и 41. Чтобы отслеживать, является ли повышенная экспрессия PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) результатом трансгена или эндогенного гена, ту же группу мышей из трех трансгенных линий сравнивали на PKD1 в почках ( поликистозная болезнь почек 1) экспрессия трансгена и для почечной PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) общая (трансгенная и эндогенная) экспрессия с помощью ПЦР в реальном времени. Интересно. линии 39 и 41 по сравнению с линией 3 показали, что повышенная PKD1 (поликистоз почек 1) экспрессия трансгена в почках была аналогична или выше, чем экспрессия в почках PKD1 (поликистозная болезнь почек 1), что указывает на то, что трансген специфически ответственен за эту индуцированную экспрессию. В различных органах (включая сердце, легкие, головной мозг, печень, поджелудочную железу и селезенку) SBPKD1 (поликистоз почек 1) РАК; трансген показал очень слабую экспрессию, иногда обнаруживаемую в селезенке и легких, с незначительной или неопределяемой экспрессией в других органах (Fig. 3b). Количественная оценка с помощью ПЦР в реальном времени продемонстрировала от 10-до 1,000-кратного снижения уровня экспрессии трансгена во внепочечных тканях по сравнению с почечной экспрессией (рис. 3c). Регуляторные элементы "SB" трансгена SBPkdlrAc обеспечивают предпочтительную экспрессию в почках; это конкретное распределение органов было также определено при использовании трансгенов, сцепленных с c-Myc (SBM) и c-fos(SBF) (36, 38). c-Mye, нижестоящий эффектор PKD1 (поликистоз почек 1) сигнальные пути в SBPkdlrAc: мыши. Чтобы получить представление о внутриклеточном патогенетическом механизме трансгенных мышей SBPkdlrAc, мы затем попытались контролировать уровень экспрессии c-Myc в почках, основываясь на наших предыдущих наблюдениях дерегуляции c-Myc в почках человека с ADPKD (аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек) (22). Анализ почек проводили от всех трех трансгенных линий 3(n=4),39(n=7) и 41 (n=4), а также контрольных (n=4) }}). Как показано на фиг.3d, у мышей SBPkdlrAa индуцирована значительная экспрессия эндогенного c-Mye по сравнению с контрольными мышами того же возраста. Интересно, что уровень экспрессии c-Myc в некоторых почках SBPkdlrAG, в частности в линии 39, достиг уровней, сравнимых с уровнями, наблюдаемыми в модели трансгенных мышей PKD SBM, продуцируемых почечной экспрессией c-Myc.
Почечные аномалии при SBPKD1 (поликистоз почек 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 для каждой линии), развились множественные тубулярные (Т) и клубочковые кисты (Г) (рис. 4г, е, ж). Кисты наблюдались в канальцах кортикальной и мозговой областей, а также в собирательных трубочках сосочка (рис. 4d и e). У трансгенных мышей обнаружена тубулярная эпителиальная гиперплазия (стрелка), вовлекающая как кистозные, так и некистозные канальцы, и частая гипертрофия (рис. 4g и h). но тяжесть варьировалась между отдельными мышами. Интерстициальный фиброз (F). Часто наблюдались периваскулярные лимфоидные инфильтраты и белковые цилиндры (P) (рис. 4d и e).
Рис. 4
Для более точного определения места локализации повышенной PKD1 (поликистоз почек 1)экспрессии в почках, мы провели гибридизацию in situ с использованием зонда экзона 36-45, использовавшегося ранее (16). Сигнал гибридизации был локализован специфически в эпителиальных клетках, выстилающих кисты и гиперпластические канальцы, а также в гломерулярных кистах. Кроме того, над эпителием некистозных или слегка расширенных канальцев наблюдался некоторый сигнал, вероятно, идентифицирующий канальцы, предопределенные к будущим кистозным изменениям (рис. 4i и j). Гистологический анализ почек также проводили на трансгенных мышах при рождении (n=8), на 10-й день после рождения (P10) (n=3), P20 (n=5), P35 (n{ {10}}) и P45(n= 3) по сравнению с отрицательными однопометниками той же возрастной группы (от n =2 до 4). контрольные отрицательные однопометники (рис. 4k и 1), что указывает на то, что почечные аномалии возникают внутриутробно, как это наблюдается у мышей SBM и при ADPKD (аутосомно-доминантный поликистоз почек) пациентов. Тубулярная и клубочковая дилатация увеличивалась в размерах и количестве с возрастом. К P35 у трансгенных мышей наблюдалась более выраженная гиперплазия и признаки гломерулосклероза. Изменены физиологические функции почек у мышей SBPkdlrsc. Почечные физиологические функции всех трансгенных мышей проявляли черты, сходные с PKD, в то время как у нетрансгенных однопометников заболевание никогда не развивалось. В течение нескольких месяцев после рождения у больных животных развилась хроническая почечная недостаточность. У этих животных контролировали функциональные параметры почек путем измерения уровней в сыворотке и моче. азот мочевины крови (АМК) и креатинин, осмоляльность мочи, белок мочи и экскреция ионов (таблица 1). У всех мышей из трех линий по сравнению с контрольной группой обнаруживались дефекты концентрации, что является обычным признаком АДПБП.аутосомно-доминантный поликистоз почек). и, следовательно, показал снижение мочи BUN. концентрации креатинина, белка и железа. Трансгенный SBPKD1 (поликистоз почек 1)rAc.основателей и потомков (n=6) из каждой линии качественно отслеживали на наличие протеинурии в образцах мочи с помощью SDS-PAGE (фиг. 5). У мышей старше 2 месяцев наблюдалась неселективная протеинурия, которая прогрессировала с возрастом. Кроме того, уровни сывороточного азота мочевины и сывороточного креатинина были повышены, что свидетельствовало о почечной недостаточности (таблица 2). Поскольку хроническая почечная недостаточность обычно приводит к изменениям гематологических параметров, их исследовали на трансгенных мышах SBPkdlAc в возрасте от 3 до 14 месяцев (таблица 2). Эти трансгенные мыши страдали анемией, о чем свидетельствовало значительно сниженное количество эритроцитов, при этом гемоглобин и гематокрит достигали половины нормальных уровней. Другие параметры эритроцитов, такие как процентное содержание ретикулоцитов, не изменились, как и ожидалось, при индуцировании почечной недостаточностью. Эти животные постоянно умирали от почечной недостаточности в возрасте -5,9±2,8 месяцев (n {{12}). }) для трансгенной линии 39 и в более позднем возрасте -14,6±3,1 мес (n= 20) и -11,7 ±6,5 мес (n=7) , для строк 3 и 41 соответственно.
ЭФФЕКТЫ ЦИСТАНХЕ: ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЧЕК
ОБСУЖДЕНИЕ
Здесь мы сообщаем о выделении и характеристике мышиной PKD1 (поликистоз почек 1)-БАК. Этот ПКД1 (поликистоз почек 1) ген был помечен, и регуляторные элементы были заменены для целевой экспрессии конкретно в почках посредством двух последовательных событий гомологичной рекомбинации. Трансгенные мыши, полученные с этим новым геном SBPkdlrAG, показали от 2-до 15-кратного увеличения экспрессии PKD1 (поликистоз почек 1) и воспроизводимо развили ранние морфологические изменения почек, типичные для PKD. Почечная недостаточность проявляется в среднем возрасте, и мыши преждевременно умирают от почечной недостаточности. Наши результаты также показывают, что механизм сверхэкспрессии PKD1 (поликистозная болезнь почек 1), ответственный за этот фенотип, опосредован сигнальной активацией c-Myc in vivo. Это исследование демонстрирует, что у мышей PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) усиление функции в почках достаточно для возникновения почечного фенотипа PKD.
Поскольку мышиная PKD1 (поликистоз почек 1) не дублируется, как у людей (27), мы напрямую идентифицировали и выделили клон BAC, который содержал всю PKD1 (поликистоз почек 1) ген. Полная характеристика мышиной PKD1 129/Зв (поликистоз почек 1)-БАК. непрямое сравнение с двумя другими линиями инбредных мышей подтвердило целостность локуса PKD1 (поликистозная болезнь почек 1). ПКД1 (поликистоз почек 1)-BACinsert содержал -37 до 39 т.п.н. последовательностей выше и ниже по течению от гена PKD1 (поликистоз почек 1). Наш анализ показал, что PKD1 (поликистоз почек 1) в этом BAC был добросовестным мышиным локусом дикого типа, который мог служить для дальнейших исследований.
Хотя есть убедительные доказательства того, что образование кист при АДПБП (аутосомно-доминантный поликистоз почек) может быть результатом потери гетерозиготности после соматической инактивации нормальной PKD1 (поликистоз почек 1) аллель (3.21.32), имеются также наводящие на размышления доказательства устойчивой или даже повышенной экспрессии polycystin-1 в эпителии кистозных канальцев (22.29). Последнее наблюдение поднимает вопрос о том, является ли гиперэкспрессия PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) сама по себе достаточной непосредственной причиной кистогенеза. У трансгенных мышей, несущих PKD1 человека (поликистоз почек 1), ТСК2. РАБ26. NTHL1 и SLC9A3R2, только у меньшинства мышей развились кисты, и ни у одной из них не было заметной экспрессии трансгена во взрослом возрасте, несмотря на 30 копий трансгена (31). У этих трансгенных мышей. было трудно установить четкую роль сверхэкспрессии PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) в цистогенезе. Наша модель отличается тем, что от двух до девяти копий PKD1 дикого типа (поликистозная болезнь почек 1) отдельно, без смежных генов, были интегрированы в трансгенных мышей. Поскольку ген PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) выполняет важные функции в различных органах и тканях, как описано для многочисленных мышей с удалением гена PKD1 (поликистозная болезнь почек 1), системная сверхэкспрессия PKD1 (поликистоз почек 1) может привести к дополнительным искажающим эффектам. Следовательно, мы обратились к роли PKD1 (поликистоз почек 1) усиление функции с использованием подхода, нацеленного на PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) конкретно в почках. С помощью гомологичной рекомбинации мы сначала заменили вышестоящую регуляторную область PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) регуляторными элементами «SB», ограниченными в почках, тем самым предотвратив снижение экспрессии гена, обычно наблюдаемое для PKD1.поликистоз почек 1) во взрослом возрасте, а также потенциальное регулирование вторичной петли обратной связи (36,38). Во-вторых, мы пометили мышиную PKD1 (поликистоз почек 1) трансген (Pkdlr) с молчащей точечной мутацией в экзоне 10, но без вставки эпитопной метки, чтобы гарантировать получение полностью функционального белка «дикого типа» с консервативной структурой и целостностью. Из этого модифицированного BAC фрагмент SBPkdlrAG был очищен от гена Tsc2 и вектора BAC, чтобы предотвратить вмешательство гена Tsc2, который также может индуцировать кистозный фенотип (8.20.28). а также избежать ингибирующего действия прокариотических последовательностей (5).
Были получены четыре разные мыши-основатели SBPkdlrActransgenic и три независимые линии со специфической почечной PKD1 (поликистоз почек 1)-расширенное выражение. Особенно поражает полная пенетрантность фенотипа у этих трансгенных мышей. СБПКД1 (поликистоз почек 1) Линии основателя rAc и линии мышей имеют несколько общих физиопатологических признаков с ADPKD (аутосомно-доминантным поликистозным заболеванием почек). К ним относятся развитие кист в коре, мозговом веществе и клубочках вместе с гиперплазией эпителия, интерстициальным фиброзом и очаговым интерстициальным воспалением.
Поскольку фенотип PKD постоянно наблюдался у всех различных трансгенных мышей-основателей, а интеграция трансгена в геном мыши является случайным явлением, фенотип не может быть результатом влияния хромосомного положения, а только результатом увеличения PKD1.поликистоз почек 1)выражение. Действительно, было показано, что экспрессия трансгена PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) во всех линиях ограничена почками. как ранее наблюдалось для других трансгенов, регулируемых элементами «SB» (36, 38). Более того, эта повышенная экспрессия PKD1 (поликистоз почек 1) была вызвана трансгеном, а не непрямой эндогенной PKD1.поликистоз почек 1) активация. Следовательно, наши результаты предоставляют четкие доказательства того, что усиление функции функциональной PKD1 дикого типа (поликистозная болезнь почек 1) может вызывать множественные почечные кисты. Важно отметить, что эти практики SBPKD1 (поликистозная болезнь почек 1) представляют собой первую мышиную модель, созданную единственной сверхэкспрессией мышиного ортолога PKD1 человека.поликистоз почек 1) ген.
Мыши SBPkdl-Ac демонстрируют, что PKD1 (поликистоз почек 1) гиперэкспрессия является основным патогенетическим механизмом почечного кистогенеза. Важно отметить, что самые высокие уровни экспрессии трансгена в почках коррелируют с прогрессированием и тяжестью фенотипа. Мы также обнаружили, что гиперэкспрессия PKD1 (поликистозная болезнь почек 1) при развитии SBPKD1 (поликистоз почек 1Фенотип )-Ac, вероятно, сигнализирует об активации c-Myc in vivo. Предположительно, эта активация может быть даже непосредственной через С-концевой хвост полицистина -1, подвергающийся протеолитическому расщеплению и ядерной транслокации (7). было бы очень последовательно поддерживать c-Myc в качестве основного нижестоящего эффектора PKD1 (поликистоз почек 1) сигнальные пути Этот результат также коррелирует с нашими предыдущими данными о повышенной экспрессии c-Myc в почках всех проанализированных ADPKD (аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек) человека (22). В целом эти результаты показывают, что c-Mye является основным медиатором PKD1. (поликистоз почек 1)цистогенез.
Наши результаты PKD1 (поликистоз почек 1) модель с приобретением функции вместе с мышиной PKD1 (поликистозная болезнь почек 1), гаплонедостаточностью и потерей функции указывают на то, что любая PKD1 (поликистоз почек 1) нарушение регуляции может привести к цистогенезу (2.19.23-26.31.40). Тяжелый дисбаланс PKD1 (поликистоз почек 1) у мышей, индуцированный PKD1 (поликистоз почек 1) абляция или трансгенная гиперэкспрессия вызывали раннее начало и быстрое прогрессирование почечных кист и поражали большую часть канальцев. Напротив, более мягкий PKD1 (поликистоз почек 1) дисбаланс, такой как гаплонедостаточность, приводил к более медленному прогрессированию поликистозной болезни с более очаговыми кистами. Явное парадоксальное развитие сходного фенотипа посредством противоположной дисрегуляции полицистина-1 может быть объяснено общим результатом, а именно дисбалансом относительной концентрации белка, который может изменить формирование или функцию активного мультибелкового комплекса полицистина. В совокупности наши результаты и результаты других исследователей доказывают, что механизм образования кист при АДПБП (аутосомно-доминантный поликистоз почек), вероятно, возникает из-за трех патогенетических механизмов: усиление функции, потеря функции и эффекты дозировки генов.
Роман SBPkdlrAc; мыши представляют собой мощную модель почечного кистогенеза, которая может пролить свет на патофизиологию поликистозной болезни почек, поликистозной болезни 1 типа.поликистоз почек 1) пути передачи сигнала и взаимодействующие партнеры. Изучение этой модели может также привести к разработке новых терапевтических стратегий для восстановления нормального белкового баланса в PKD1.поликистоз почек 1) мультимерный комплекс.
Цистанхе лечит заболевания почек и улучшает функцию почек
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Блуэн, М.Дж., Х.Бичмин, А.Райт, М.Е.Де Паэпе, М.Сурретт, А.М. Бо. Б. Накамото, Китай. Оу, Г. Стаматояннопулос и М. Трудель. 2000. Генетическая коррекция серповидно-клеточной анемии: выводы с использованием моделей трансгенных мышей Nat. Мед.17-182.
2 Боултер, К., С. Малрой, С. Уэбб, С. Флеминг, К. Бриндл и Р. Сэндфорд. 2001. Сердечно-сосудистые, скелетные. и дефекты почек у мышей с целенаправленным разрушением PKD1 (поликистоз почек 1)ген. проц. Нац.акад. науч. США 9812174-12179.
3. Бразиер Дж. Л. и Э. П. Хенске. 1997. Потеряполикистоз почек(PKD1）область хромосомы 1φp13 в клетке почечной кисты поддерживает модель потери функции патогенеза кисты. J. Clin. Investig.99:194-199.
4. Берн, Т.С., Т.Д. Коннарс, В.Р. Даковски, Л.Р.Петри, Т.Дж.Ван Раай, Дж.М.Милхалланд, М. Венет, Г. Милкер, Р.М.Л. Хаким, Г. М. Л. Ландес, К. В. Клингер, Ф. Киам, Л.Ф. Onuchic, T. Watnick GGGermino, and N.A Doggett. 1995. Анализ геномной последовательности дляаутосомно-доминантный поликистоз почекген предсказывает наличие богатого лейцином повтора. Hum Mol, Genet.4-575-58.
5. Чада, К., Дж.Маграм, К.Рафаэль, Г.Радис, Э.Лейси и Ф.Константини. 1985. Специфическая экспрессия чужеродного гена -глобина в эритроидных клетках трансгенных мышей Nature 337-380.
6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst, GG Germino и M.-C. Гублер. 2002. Экспрессия транскриптов и белков PKDI и PKD2 в человеческом эмбрионе и во время нормального развития почек. Являюсь. Дж. Патол. 160973-983.
7. Чаурвет, В., X Тиан, Х. Хассон, Д. Х. Гримм, Т. Ван, Т. Хисбергер, П. Игараши, А. М. Беннетт, О. Брагимов-Бескровная, С. Сомло и М. Дж. Каплан. транслокация pobeystin-1 C конца. J. Cin.Investig 114: 1433-1443.
8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson, and DJ Kwiatkowski 2000. Молекулярно-генетические достижения в лечении туберозного склероза. Гум. Жене10797-114.
9. Консорциум, ЭПКД1993. Идентификация и характеристика гена туберозного склероза на хромосоме 16.Cell75:1305-1315.
10. Консорциум, ЭПКД1994.поликистоз почек 1ген кодирует все транскрибируемые в пределах дуплицированной области на хромосоме 16 клетки 7781-894.
11. Консорциум, Л ПК Д 1995.Поликистоз почек: полная структура PKD1 (поликистоз почек1) ген и его белок. 81 лет:289-298
12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V.DAgati, and M. Trudel.2002. c-Myc-индуцированный апоптоз вполикистоз почекне зависит от взаимодействия FasL/Fas. Рак рез. 62:2210-2214.
13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Модель серповидноклеточной гломерулопатии человека. почки инт. 46:1337-1345.
14. GengL,Y, Segal B.PekseL, N.Den Y. Pei, F.Carone, HG. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders, and J.Zhou. 1996. Идентификация и локализация полиэфира, PKD1 (поликистоз почек 1) генный продукт. Дж. Клин. расследование 98-2674-2682