Часть Ⅱ Дефицит Smad3 улучшает основанную на островках терапию диабета и диабетического повреждения почек, способствуя пролиферации клеток посредством E2F3-зависимого механизма

Методы

1. Животные

Мыши Smad3-null (Smad3KO) являются любезным подарком профессора Chuxia Deng и содержатся в гетерозиготах (Smad3 plus /-) на фоне C57BL/6 [20]. Мышей Smad3KO получали скрещиванием мышей Smad3 plus/-. Мыши db/db с мутацией Lepr (рецептор лептина) на фоне C57BLKS были приобретены в Экспериментальном центре животных Китайского университета Гонконга (CUHK). Все животные содержались в отдельном помещении, свободном от патогенов (SPF), со свободным доступом к пище и воде при дневном/ночном цикле 12/12 часов. Все манипуляции с животными в этом исследовании проводились в соответствии с правилами и одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных CUHK с исх. № 18-177-ИСУ.

2. Мышиная модель диабета, индуцированного стрептозоцином (STZ).

Самцам мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель вводили внутрибрюшинно 50 мг/кг/день STZ ежедневно в течение 5 дней подряд. Через 5 дней после последней инъекции STZ мышей со стабильным случайным уровнем глюкозы в крови более 16 мМ в течение 2 дней подряд расценивали как успешное установление диабета и использовали в качестве мышей-реципиентов для трансплантации островков.

3. Изоляция островков, трансплантация и оценка диабетического фенотипа

Островки выделяли у самцов или самок мышей с нокаутом Smad3 (KO) или мышей дикого типа (WT) в возрасте 8-10 недель, как описано ранее [21]. Для выполнения трансплантации островков несколько указанных островков трансплантировали под капсулу почки самцам мышей db/db в возрасте 4 недель или мышам с диабетом, индуцированным STZ, на 7-й день после последней инъекции STZ в соответствии с протоколом, описанным Szot et al. 22]. Вкратце, реципиентную мышь анестезировали с помощью анестезии Combo (1,5% кетамина и 0,15% ксилазина, 6 мкл/г массы тела). После потери сознания произведен разрез кожи левой почки длиной 1 см. Аккуратно вытащите почку и держите ее влажной стерильным физиологическим раствором во время операции. Иглой 25G сделайте небольшую царапину на капсуле, чтобы создать надрез. Указанное количество островков доставляли в почечную капсулу с помощью трубки PE50. После того, как островки были пересажены, заклейте надрез путем прижигания слабым нагревом. Замените почку и закройте брюшину швами. Закрепите кожу скобами. 100 мкл раствора пенициллин-стрептомицин (Gibco, № по каталогу 15140122, США) вводили внутрибрюшинно для предотвращения инфекции. 100 мкл Tegmic вводили внутримышечно для облегчения боли. Животное помещали в теплую среду до полного выздоровления. Такую же процедуру операции также проводили на ложных контрольных мышах, но без инфузии островков. Как случайный, так и 6-часовой уровень глюкозы в крови натощак (RBG и FBG) в крови кончика хвоста еженедельно проверяли с помощью портативного глюкометра (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Тест на инсулинорезистентность (IPITT), тест на толерантность к глюкозе (IPGTT), уровни HbA1c и сывороточного инсулина измеряли, как описано ранее [9].

Нажмите здесь, чтобы получитьПреимущества Цистанхе

4. Общий белок мочи и креатинин сыворотки.

24-часовая моча собиралась в метаболической клетке. Общий белок мочи за 24 часа рассчитывали путем умножения объема мочи и концентрации белка в моче, которые количественно определяли с помощью набора для анализа белка Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, № по каталогу 5000201, США). Креатинин сыворотки определяли с помощью набора для количественного определения креатинина (Stanbio Laboratory, кат. № 0430-120, США).

5. Гистопатология

Гистопатологические изменения в почках исследовали в фиксированных параформальдегидом и залитых парафином срезах (4 мкм) с реагентом периодической кислоты-Шиффа (PAS), как описано ранее [23]. Расширение мезангиальной матрицы оценивали с использованием программы количественных изображений (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics), как описано ранее [23].

6. Иммуногистохимия

Почку или поджелудочную железу с островками фиксировали в 4-процентном параформальдегиде, заливали в парафин и делали срезы толщиной 4 мкм. После регидратации срезы обрабатывали микроволновым извлечением антигена в 0.01 М цитрате (pH 6.0) в течение 10 минут и блокировали в 5% BSA в течение 1 часа. . Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°С. Для флуоресцентного окрашивания наносили флуоресцентное вторичное антитело при комнатной температуре (КТ) на 1 час. Для DAB-опосредованного термогенеза перед извлечением антигена был включен дополнительный этап 3-процентного блокирования H2O2 в течение 15 минут. После инкубации с первичными антителами добавляли HRP-конъюгированный полимер (Envision plus System, Dako, USA). Для окрашивания E2F3 определение антигена проводили в растворе ЭДТА-Трис (pH 9,0). Антитела, используемые в иммуногистохимии, подробно описаны в таблице S2. Область с положительным окрашиванием была количественно оценена с помощью программного обеспечения Image J (v1.47, NIH, США).

Экстракт цистанхе

7. Измерение массы трансплантированных клеток в почке с островками

Показатель средней площади клеток на срез использовали для полуколичественного определения клеточной массы в островковом трансплантате. Вкратце, почку с островками (залитую парафином) последовательно разрезали на 4 мкм вдоль сагиттальной оси. Непрерывные срезы с интервалами 160 мкм подвергали флуоресцентному иммуноокрашиванию на инсулин. По крайней мере, 6 срезов с инсулин-положительным окрашиванием использовали для расчета площади клеток на срез у каждой мыши. Площадь инсулин-позитивных клеток в каждом срезе определяли количественно с помощью программного обеспечения Image J (v1.47, NIH, США). Показатель средней площади клеток на срез у каждой мыши рассчитывали путем деления общей инсулин-позитивной площади всех срезов на количество инсулин-позитивных срезов.

8. Первичная культура островковых клеток

Выделенные островки диссоциировали на отдельные клетки и высевали в 96-луночный планшет в 200 мкл RPMI 1640 (Gibco, США) плюс 10% FBS (Gibco, США) плюс 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco, США). с добавлением 20 мМ глюкозы. Островковые клетки культивировали в течение указанного времени в инкубаторе при температуре 37°С, 5% СО2 и 100% влажности. Для опосредованного аденовирусом нокдауна E2F3 диссоциированные островковые клетки культивировали в среде, содержащей аденовирус, сверхэкспрессирующий короткошпилечную РНК (shRNA), нацеленную на мышиный E2F3 (shE2F3) или контрольную неспецифическую shРНК (показана) при титре 10 БОЕ на клетку в течение 2 дней с последующей заменой среды. Стволовая последовательность дуплекса shE2F3 представляла собой 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Дисперсные клетки из 50 островков высевали на лунку для иммуноокрашивания и ОТ-ПЦР и по 100 островков на лунку для вестерн-блоттинга, которые проводили, как описано ранее [9].

9. Маркировка BrdU in vivo и in vitro.

Для мечения BrdU in vivo мышам внутрибрюшинно вводили 50 мг/кг/сут BrdU (в PBS) в течение 7 дней, начиная со 2-го дня после трансплантации островков, и умерщвляли через 2 ч после последней инъекции. Для мечения BrdU in vitro диспергированные островковые клетки культивировали в течение 48 часов с последующей заменой на свежую среду, содержащую 10 мкМ BrdU, и культивировали в течение дополнительных 24 часов. Флуоресцентное иммуноокрашивание против BrdU в ткани и культивируемых клетках проводили, как описано ранее [9].

Цистанхе порошок

10. РНК-Seq

Островки выделяли у мышей Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m и Smad3KO-db/m. Для каждого генотипа островки от более чем 5 мышей объединяли для выделения РНК. РНК готовили с помощью набора miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия). РНК-секвенирование и последующий анализ данных были описаны ранее [9]. Уровень экспрессии данного гена был представлен как количество фрагментов на тысячу оснований транскрипта на миллион картированных прочтений (FPKM). Дифференциально экспрессируемый ген (DEG) определяли как двукратную дисперсию FPKM между двумя группами или равную ей. DEG с повышенной и пониженной экспрессией были объединены и использованы для анализа обогащения пути Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) с онлайн-ресурсами биоинформатики DAVID (v6.8) с настройками по умолчанию. Подкатегория GOTERM_BP_DIRECT использовалась для анализа GO.

11. Иммунопреципитация

Для проведения иммунопреципитации островков мышей около 500 свежевыделенных островков лизировали в 500 мл RIPA-буфера. Добавляли кроличье антитело против Smad3 (2 мкг) или кроличий изотип IgG и инкубировали при 4 градусах в течение ночи при осторожном вращении. Затем добавляли 20 мкл гранул агарозы с протеином А (Beyotime, кат. № P2051, Китай) и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. После тщательной промывки свежим RIPA-буфером связанный белок высвобождали путем денатурации в буфере для загрузки 1xSDS и подвергали вестерн-блоттингу. Чтобы избежать влияния тяжелой цепи IgG, для распознавания осажденного белка Smad3 использовали специфический для легкой цепи IgG мыши против кроличьего IgG (конъюгированный с HRP, Abmart, кат. № M21006, Китай).

12. Иммунопреципитация хроматина-ЧИП

Для проведения ChIP в островках мышей было собрано около 2000 островков у мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель и использовано в качестве одного препарата ChIP. Свежевыделенные островки стимулировали 10 нг/мл TGF- 1 (Gibco, США) в течение 15 минут в RPMI 1640 плюс 1% FBS плюс 1% пенициллин-стрептомицин. ЧИП проводили с помощью набора SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, США) в соответствии с рекомендованной инструкцией. Антитела и праймеры, используемые в анализе ChIP, подробно описаны в таблицах S1 и S2.

Стандартизированный цистанхе

13. Репортерный анализ двойной люциферазы

Мышиный промотор E2F3 (от -1000 до плюс 451 п.н.) был клонирован в базовый вектор pGL3-(pGL3-E2F3.Pro). Параллельно проводили точечную мутацию сайта связывания Smad3 для получения pGL3- E2F3.Pro. Мут. Для выполнения репортерного анализа с двумя люциферазами клетки HEK293T высевали в 24-луночный планшет с плотностью 5 x 104 клеток/лунку. На следующий день клетки трансфицировали 500 нг pGL3-Basic или pGL3-E2F3.pro или pGL3-E2F3.pro.mut в сочетании с pcDNA3.1-Smad3, который сверхэкспрессирует мышиный Smad3 или нет (как показано на фиг. 10F) методом с фосфатом кальция. Вектор pEGFP-C1 добавляли, чтобы сбалансировать дозу трансфекции при каждой обработке. 10 нг вектора pGL4.73.huc/SV40, экспрессирующего люциферазу рениллы, включали в каждую обработку для нормализации эффективности трансфекции. Через 6 ч после трансфекции среду заменяли с последующим инкубированием в течение дополнительных 48 ч. Клетки лизировали и определяли активность люциферазы с помощью системы анализа Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, США) и количественно определяли на люминометре (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, США). Транскрипционную активность клонированного промотора E2F3 представляли как отношение значений люциферазы светлячка к люциферазе renilla. Каждую обработку проводили в трехкратной повторности.

14. Статистика

Данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение и проанализированы с помощью программного обеспечения SPSS (16.0). Нормальность данных проверяли одновыборочным критерием Колмогорова-Смирнова. Однородность дисперсии среди групп проверялась статистикой Левена. Для сравнения двух групп использовали критерий Стьюдента. Для сравнения между несколькими группами использовался однофакторный дисперсионный анализ с критерием LSD, если предполагалась равная дисперсия. Для равной дисперсии, которая не предполагалась, использовалась альтернативная статистика критерия Уэлча с последующим множественным сравнением с критерием Т2 Тамхейна. P < 0.05 считалось статистически значимым.

Цистанхе добавки

Выводы

Дефицит Smad3 в значительной степени улучшает заместительную терапию островков при СД1 и СД2 и защищает от диабетического повреждения почек. Усиленная E2F3-зависимая пролиферация клеток может быть ключевым механизмом терапии островков Smad3KO как при СД1, так и при СД2. Таким образом, заместительная терапия клетками Smad3KO может быть лучшей клинической терапевтической стратегией диабета.

Рекомендации

1 Шапиро А.М., Покривчинска М., Рикорди С. Клиническая трансплантация островков поджелудочной железы. Нат Рев Эндокринол. 2017; 13: 268-77.

2. Якобсон Э.Ф., Цанакакис Э.С. Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток человека в функциональные клетки поджелудочной железы для лечения диабета: инновации, проблемы и будущие направления. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Тосо С., Иссе К., Деметрис А.Дж., Диньяри П., Кох А., Имес С. и др. Гистологическая оценка трансплантата после клинической трансплантации островков. Трансплантация. 2009 г.; 88: 1286-93.

4. Лан ХИ. Различные роли TGF-бета/Smads в почечном фиброзе и воспалении. Int J Biol Sci. 2011 г.; 7: 1056-67.

5. Мэн С.М., Тан П.М., Ли Дж., Лан Х.И. Передача сигналов TGF-бета/Smad при почечном фиброзе. Фронт Физиол. 2015 г.; 6: 82.

6. Эль-Гохари Ю., Тулачан С., Вирш Дж., Го П., Уэлш С., Прасадан К. и др. Сигнальная сеть smad регулирует пролиферацию островковых клеток. Диабет. 2014; 63: 224-36.

7. Дхаван С., Дирис Э., Кулкарни Р.Н., Бхушан А. Ингибирование передачи сигналов TGF-бета способствует репликации бета-клеток поджелудочной железы человека. Диабет. 2016 г.; 65: 1208-18.

8. Ван П., Каракосе Э., Лю Х., Шварц Э., Акейфи С., Златанич В. и др. Комбинированное ингибирование путей DYRK1A, SMAD и Trithorax синергизирует, чтобы вызвать надежную репликацию в бета-клетках взрослого человека. Клеточный метаб. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH и другие. Дефицит Smad3 способствует пролиферации и функционированию бета-клеток у мышей db/db за счет восстановления экспрессии Pax6. Тераностика. 2021; 11: 2845-59.

10. Змуда Э.Дж., Пауэлл К.А., Хай Т. Способ выделения мышиных островков и субкапсулярной трансплантации почки. J Vis Exp. 2011.

11. Чой М.Ю., Лим С.Дж., Ким М.Дж., Ви Ю.М., Квон Х., Юнг Ч. и др. Трансплантация островкового изотрансплантата улучшает чувствительность к инсулину в мышиной модели диабета 2 типа. Эндокринный. 2021; 72: 660-71.

12. Виджаячандра К., Хиггинс В., Ли Дж., Глик А. Индукция p16ink4a и p19ARF с помощью TGFbeta1 способствует остановке роста и реакции старения кератиноцитов мыши. Мол Карциног. 2009 г.; 48: 181-6.

13. Дайер М.А., Цепко В.Л. Регуляция пролиферации во время развития сетчатки. Нат Рев Нейроски. 2001 г.; 2: 333-42.

14. Дайсон Н. Регуляция E2F белками семейства pRB. Гены Дев. 1998 год; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Временное подавление передачи сигналов рецептора TGFbeta облегчает трансплантацию островков человека. Эндокринология. 2016 г.; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Нарушение SMAD2 в бета-клетках поджелудочной железы мыши приводит к гиперплазии островков и нарушению секреции инсулина из-за ослабления активности АТФ-чувствительных каналов K+. Диабетология. 2014; 57: 157-66.

17. Рэди Б., Чен И., Вака П., Ван К., Ван И., Салмон П. и др. Сверхэкспрессия E2F3 способствует пролиферации функциональных бета-клеток человека без индукции апоптоза. Клеточный цикл. 2013; 12: 2691-702.

18. Чжан Ю, Александр П.Б., Ван Х.Ф. Передача сигналов семейства TGF-бета в контроле пролиферации и выживания клеток. Колд Спринг Харб Перспект Биол. 2017; 9.

19. Ван П., Фиаски-Таеш Н.М., Васавада Р.К., Скотт Д.К., Гарсия-Окана А., Стюарт А.Ф. Сахарный диабет--прогрессирует и затрудняет пролиферацию бета-клеток человека. Нат Рев Эндокринол. 2015 г.; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Целенаправленное нарушение SMAD3 приводит к нарушению иммунитета слизистых оболочек и снижению чувствительности Т-клеток к TGF-бета. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Ли Д.С., Юань Ю.Х., Ту Х.Дж., Лян К.Л., Дай Л.Дж. Протокол выделения островков из поджелудочной железы мыши. Нат Проток. 2009 г.; 4: 1649-52.

22. Сот Г.Л., Кудриа П., Блюстоун Дж.А. Трансплантация островков поджелудочной железы в капсулу почки мышей с диабетом. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q и др. Делеция Smad3 предотвращает почечный фиброз и воспаление при диабетической нефропатии 2 типа. Метаболизм. 2020; 103: 154013.

Хун-Лянь Ван1,2, Бяо Вэй2, Хуэй-Цзюнь Хе2, Сяо-Ру Хуан2,3, Цзин-И Шэн2,4, Сяо-Цуй Чен2,5, Ли Ван1, Жуй-Чжи Тань1, Цзянь-Чунь Ли1, Цзянь Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 и Hui-Yao Lan2,7

1 Научно-исследовательский центр комплексной медицины и отделение нефрологии, аффилированная больница традиционной китайской медицины Юго-Западного медицинского университета, Лучжоу, Сычуань, 646000, Китай.

2. Департамент медицины и терапии и Институт наук о здоровье им. Ли Ка Шинга Китайского университета Гонконга, Гонконг, 999077, Китай.

3. Совместная лаборатория Гуандун-Гонконг по иммунологическим и генетическим заболеваниям почек, Народная больница провинции Гуандун, Академия медицинских наук Гуандун, Гуанчжоу, Гуандун, 510080, Китай.

4. Государственная ключевая лаборатория биоэлектроники, Ключевая лаборатория биоматериалов и устройств Цзянсу, Школа биологических наук и медицинской инженерии, Юго-Восточный университет, Нанкин, Китай.

5. Ключевая лаборатория профилактики и лечения хронической болезни почек города Чжаньцзян, Институт нефрологии, дочерняя больница Гуандунского медицинского университета, Чжаньцзян, Гуандун, 524001, Китай.

6. Национальная база клинических исследований традиционной китайской медицины, аффилированная больница традиционной китайской медицины Юго-Западного медицинского университета, Лучжоу, Сычуань, 646000, Китай.

7. Совместная исследовательская лаборатория иммунологических и генетических заболеваний почек CUHK-провинциальной народной больницы провинции Гуандун, Китайский университет Гонконга, Гонконг, 999077, Китай.