Часть Ⅰ Хелатор железа, PBT434, модулирует трансцеллюлярный транспорт железа в эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга.

Абстрактный

Железо и другие переходные металлы, такие как медь и марганец, необходимы для поддержания функции мозга, однако их избыточное накопление является цитотоксическим. Это избыточное накопление металлов, особенно железа, характерно для некоторых неврологических расстройств; к ним относятся болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, атаксия Фридриха и другие расстройства, проявляющиеся нейродегенерацией и связанным с ней накоплением железа в головном мозге. Управление потоком железа через гематоэнцефалический барьер обеспечивает первую линию защиты от избыточного накопления железа в нормальных физиологических условиях и при этих патологических состояниях. В этом исследовании мы определили, что хелатор железа PBT434, который в настоящее время разрабатывается для лечения болезни Паркинсона и множественной системной атрофии, модулирует поглощение железа эндотелиальными клетками микрососудов головного мозга человека (hBMVEC) путем хелатирования внеклеточного железа.^{2 плюс}. Обработка hBMVEC с помощью PBT434 приводит к увеличению содержания транскриптов рецептора трансферрина (TfR) и церулоплазмина (Cp). Вестерн-блоттинг и анализ ELISA также показывают соответствующее увеличение количества белков. Внутри клетки PBT434 увеличивает обнаруживаемый уровень благотворительного, лабильного Fe.^{2 плюс}; данные показывают, что это Fe^{2 плюс}освобождается от ферритина. Кроме того, PBT434 потенцирует отток железа, вероятно, из-за увеличения цитозольного двухвалентного железа, субстрата для экспортера железа, ферропортина. PBT434 быстро и двунаправленно уравновешивается через гематоэнцефалический барьер hBMVEC. Эти результаты показывают, что комплекс железа PBT434- не является субстратом для поглощения hBMVEC, и, таким образом, подтверждают модель, в которой PBT434 будет хелатировать интерстициальное железо и ингибировать повторное поглощение железа эндотелиальными клетками гематоэнцефалического барьера, как а также ингибировать его поглощение другими клетками сосудисто-нервной единицы. В целом, это представляет собой новый и многообещающий механизм терапевтического хелатирования железа.

Нажмите здесь, чтобы получитьв чем польза цистанхе

Введение

Металлохелатирующая терапия (МХТ) уже давно используется для лечения отравлений переходными металлами и генетических нарушений метаболизма ионов незаменимых металлов, что приводит к их избыточному накоплению [1–3]. Двумя примерами последнего являются гипераккумуляция меди при болезни Вильсона [4] и железа при наследственном гемохроматозе [5]. И медь, и железо являются катализаторами окислительного стресса и, таким образом, цитотоксичны в концентрациях, превышающих способность клетки и организма «сопровождать» эти редокс-активные переходные металлы [6, 7]. Накопление железа, в частности, в целом носит идиопатический характер; действительно, увеличение содержания железа является признаком старения мозга [8–10]. Патологически такое накопление железа в мозге является признаком мутаций в генах, не связанных с метаболизмом железа [11-15], а также множества других нейродегенеративных заболеваний, некоторые из которых не имеют специфической генетической связи, например, старение [16], болезнь Альцгеймера [16]. 17], атаксия Фридрейха [18] и болезнь Паркинсона [19]. Как группу такие расстройства можно рассматривать как нейродегенерацию с накоплением железа в мозге (NBIA), хотя эта аббревиатура обычно ограничивается теми, для которых была идентифицирована генетическая связь [11, 13, 14].

В случае перегрузки железом цель состоит в том, чтобы «очистить» организм от избыточного железа из-за дефекта поглощения или оттока железа клетками. Здесь цель состоит в том, чтобы превзойти физиологические хелаторы железа с лекарством; целевым лекарственным средством является соединение с хорошей фармакокинетикой и высоким сродством к двухвалентному железу. Поскольку тело перенасыщено необходимым металлом, не стоит беспокоиться о том, что в процессе лечения может возникнуть его дефицит. Лечение церебрального заболевания с помощью терапии хелаторами железа требует другой стратегии. Это не проблема системной перегрузки железом, а проблема накопления железа в областях патологии с повреждающими последствиями. Связанное с возрастом накопление железа при болезни Паркинсона (БП), например, потенциально способствует повреждению клеток, связанному с окислительным стрессом [20]. Избыток лабильного железа способствует неправильному свертыванию -синуклеина в нейронах черной субстанции. Использование высокоаффинного хелатора может привести к некоторому снижению нагрузки железом на головной мозг, но, безусловно, вызовет дефицит железа, который, по крайней мере, для пожилых людей противопоказан, учитывая системный дефицит железа, характерный для этой возрастной группы [21]. . Хелатор с оптимальным сродством может уменьшить накопление железа, а также сопутствующий окислительный стресс из-за избытка лабильного железа и лежащих в его основе патологических процессов.

Цистанхе трубчатаяиЭффекты Цистанхе

Одним из хелаторов, одобренным для лечения перегрузки железом, вызванной переливанием крови, у пациентов с талассемией, является деферипрон (DFP, торговая марка Ferriprox) [5, 22]. ДФП также применялся для лечения атаксии Фридрейха [23] и болезни Паркинсона [24, 25]. В метаанализе было показано, что ДФП обеспечивает значительное снижение содержания железа в миокарде, а также большую защиту сердца у пациентов с талассемией, чем дефероксамин, классический железохелатирующий агент [5]. С другой стороны, DFP быстро метаболизируется в печени [26], и более поздняя работа показала, что он хелатирует Fe2 plus в активном центре железозависимых гистон-лизин-деметилаз, активность, которая коррелирует с ранее неизвестной цитотоксичностью [27]. Это открытие подчеркивает ключевое ограничение в использовании железохелатирующей терапии, а именно конкуренцию препарата за физиологически необходимое железо, будь то в запасах железа или белке, содержащем протезы железа. Тем не менее, DFP, например, продемонстрировал эффективность в испытании лечения болезни Паркинсона фазы 2, о чем свидетельствуют как аналитические (снижение нагрузки на головной мозг железом по T{14}} взвешенной МРТ), так и поведенческие показатели (когнитивная функция и функция двигательных нейронов) [1]. 24, 25].

Однако сродство DFP к Fe3 plus остается проблемой. Стабильная форма DFP-железа представляет собой трис-комплекс [Fe(DFP)3] 0 [28]. Хотя нейтральность этого комплекса идеальна для выведения железа из клетки, его константа стабильности ~1037 делает DFP настоящим поглотителем железа; в этом контексте предсказуемо его ингибирование фермента железа, такого как лизиндеметилаза [27]. Это беспокойство отражает необходимость разработки хелаторов железа, обладающих мембранной проницаемостью DFP, но значительно более слабым сродством как к Fe2 plus, так и к Fe3 plus. Эта последняя особенность ограничивает поглощение лекарственными препаратами протезного металла и термодинамический потенциал хелатирующего агента для катализа автоокисления двухвалентного железа, что приводит к образованию активных форм кислорода. По сути, сильные хелаторы трехвалентного железа катализируют прооксидантное свойство Fe2 plus [29]. В этом исследовании мы сообщаем, как такой хелатор железа с умеренным сродством к трехвалентному и двухвалентному железу модулирует поток железа в эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга, которые образуют гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Цистанхе таблетки

Этот препарат, PBT434 [5,7-дихлор-2-((метиламино)метил)-8-гидрокси-3-метилхиназолин-4 (3H)-он, рис. 1A] , образует комплекс бис-железа с логарифмическими константами стабильности ~ 11 и ~ 15 для Fe^{2 плюс}и Fe^{3 плюс}соответственно [30]. PBT434 предотвращал потерю нейронов компактной части черной субстанции (SNpc), снижал накопление ниграл-синуклеина, уменьшал содержание железа в среднем мозге, связанное с моделью болезни Паркинсона, и восстанавливал двигательную активность у двух моделей мышей с болезнью Паркинсона без какого-либо явного истощения системных запасов железа. [30]. PBT434 также эффективен в мышиных моделях множественной системной атрофии (MSA) [30, 31], двигательного расстройства, похожего на болезнь Паркинсона, но характеризующегося неправильным сворачиванием -синуклеина и последующим накоплением, вызывающим образование глиальных цитоплазматических включений, которые являются отличительной чертой патологии заболевания [32]. В значительной степени PBT434 снижал маркеры оксидативного стресса в моделях БП у мышей [30], что указывает на то, что 1) PBT434 нацелен на запасы железа, которые в противном случае были бы задействованы в качестве прооксидантов, и 2) PBT434 не усиливал эту зарождающуюся цитотоксичность, основанную на окислении. PBT434 удовлетворительно завершил исследование фазы 1 [33].

Представленная здесь работа была разработана для изучения влияния PBT434 на перенос железа в барьерные клетки головного мозга, эндотелиальные клетки микрососудов, которые вместе с лежащей в основе глией образуют гематоэнцефалический барьер. В этих исследованиях использовалась хорошо проверенная линия иммортализованных эндотелиальных клеток как в монослое, так и в культуре транслункционной культуры [34–37]. Основная цель этих исследований состояла в том, чтобы определить кинетику поглощения и оттока железа из этих клеток и их модуляцию с помощью PBT434. Модель Transwell BBB также использовалась для демонстрации двунаправленного трансклеточного потока PBT434 через эндотелиальный клеточный барьер. Модель продемонстрировала на молекулярном уровне, что PBT434 ингибирует поглощение железа путем хелатирования, одновременно стимулируя отток железа. Исследования визуализации клеток показывают, что PBT434 получает доступ к тому же пулу лабильного железа, что и классический Fe.^{2 плюс}хелатирующий агент, 2,2'-бипиридин или бипиридил и флуоресцентный зонд для двухвалентного железа. Результаты предполагают возможный механизм действия PBT434, который включает ингибирование поглощения системного железа в ГЭБ и последующую секвестрацию железа в головном мозге в интерстициальном пространстве.

Полученные результаты

1. PBT434 не оказывает цитотоксического действия на эндотелиальные клетки микрососудов головного мозга.

Чтобы определить подходящий диапазон рабочих концентраций для PBT434 в нашей культуре клеток in vitro, мы использовали анализ MTT для мониторинга митохондриальной функции hBMVEC в ответ на PBT434. Основываясь на предыдущих отчетах [30], их лечили РВТ434 в диапазоне концентраций до 100 мкМ в течение 24 часов. Мы не наблюдали значительных изменений в жизнеспособности hBMVEC при любой тестируемой концентрации (рис. 2).

2. PBT434 быстро поглощается и проникает через барьер hBMVEC.

PBT434 является перорально биодоступным лекарственным средством, которое может легко проникать через ГЭБ, как показано в исследованиях, проведенных на мышах и людях [30, 38, 39]. Мы отслеживали накопление PBT434 в hBMVEC, выращенных в монослоях, используя 14C-меченый PBT434 в качестве радиоактивного индикатора. Данные показали, что в первой фазе 14C-PBT434 быстро уравновешивается между средой поглощения и клеткой. За этим начальным поглощением последовало дополнительное медленное накопление в течение 3 часов со скоростью 30,1 ± 9,8 пмоль/мг/ч (рис. 3А). В протоколе поглощения поглощение гасят и клетки промывают при 4°C перед обработкой для накопления 14C-PBT434 (методы). В отдельном эксперименте мы исследовали отток 14C-PBT434 из hBMVEC после 30-минутного периода загрузки. В протоколе оттока клетки промывают при 25°С. Данные на рис. 3B показывают, что при промывке при 25°C было потеряно примерно 92% накопленного клетками 14C-PBT434 (сравните от 550 пмоль 14C-PBT434/мг белка в 3A через 30 мин до 43 пмоль 14C-PBT434/мг). белок в точке t=0 на 3B). Произошла дальнейшая медленная потеря оставшегося 14C-PBT434 (фиг. 3B). Данные предполагают два аспекта накопления и оттока PBT434 с помощью hBMVEC. Поток через плазматическую мембрану быстро достигает равновесия, будь то поглощение или отток. Однако в обоих процессах появляется другой, более медленный процесс. Это предполагает, что внутри клетки некоторая часть клеточного PBT434 находится в месте/состоянии, которое находится в кинетической стационарной связи с фракцией, находящейся в равновесии с внеклеточной средой. Кинетический анализ, показанный на фиг. 3B, показал, что этот пул PBT434 был представлен 27±4 пмоль/мг белка в лизате клеток, когда клетки обрабатывали 20 мкМ реагента.

Чтобы изучить трансцеллюлярный поток PBT434, мы использовали хорошо проверенную модель ГЭБ in vitro, выращенную на апикальной стороне трансвелловой мембраны [35, 36, 40, 41]. Барьерные свойства этих трансвелловых культур были подтверждены количественным определением их трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) и непроницаемости для меченого FITC декстрана (S1 Fig). Мы сравнили поглощение 14C-PBT434 на люминальной (или апикальной, со стороны крови) (рис. 4А) с поглощением на аблюминальной (или базолатеральной, со стороны мозга) (рис. 4С) мембране. В том же эксперименте соответствующий отток (трансцеллюлярный поток) определяли количественно по появлению 14C-PBT434 в отточной камере (рис. 4, панели B и D). Скорости этих процессов представлены в таблице 1. Массовые данные, показанные на фиг. 4 (панели B и D), показывают, что чистый поток PBT434 через эту модель гематоэнцефалического барьера был одинаковым в двух направлениях. В основной камере было накоплено 976 ± 185 пмоль 14C-PBT434 (рис. 4B), а в основной камере было количественно определено 1033 ± 210 пмоль (рис. 4D). Эта почти эквивалентность отражалась также в близкой скорости оттока PBT434 через две барьерные мембраны (таблица 1). Однако в этой барьерной модели наблюдалось значительно большее поглощение PBT434 базолатеральной мембраной, что иллюстрируется примерно на 50% большей потерей соединения из базальной камеры (рис. 4C), что соответствовало примерно на 40% большей скорости кажущегося поглощения клетками. (Таблица 1). Можно предсказать, что более сильное поглощение приведет к большему накоплению. Анализ клеток через 3 часа показал, что они сохраняли ~ 6 мкМ PBT434 независимо от направления потока. Значения составляли 8,1 ± 1,3 мкМ (от апикального до базального) и 4,7 ± 1,2 мкМ (от базального до апикального). Как отмечалось выше, этот анализ следует за промывкой клеток перед лизисом и количественным определением общего клеточного белка и 14C-PBT434. Кроме того, среда в апикальной камере содержала RPMI плюс 10% FBS и 10% NuSerum, тогда как базальная, «мозговая» камера содержала только RPMI (методы). Разумным выводом было то, что большее «поглощение» базальной мембраной отражало адсорбцию PBT434 клеточной поверхностью, которая была ограничена в апикальной камере присутствием белковых компонентов в сыворотке. После промывания клеток для накопления PBT434 этот адсорбированный материал (который регистрировался как «поглощение») удалялся. Повторение этого эксперимента с потоком, но с сывороткой в ​​базальной камере, показало, что действительно сыворотка подавляла эту вероятную адсорбцию PBT434 клеточной поверхностью (S2 Fig).

3. PBT434, в отличие от бипиридила, не ограничивает внутриклеточную доступность лабильного железа.

Поскольку PBT434 имеет более умеренное сродство к железу по сравнению с классическими хелаторами железа, такими как деферипрон или бипиридил, мы исследовали, как это различие отражается на влиянии PBT434 на клеточный лабильный пул железа (LIP) hBMVEC. Для этого мы воспользовались проницаемостью Fe^{2 плюс}специфического флуоресцентного красителя FerroOrange, который реагирует с немалым цитоплазматическим железом. Мы наблюдали значительное уменьшение флуоресценции в клетках при обработке бипиридилом, что согласуется с хелатированием LIP этим высокоаффинным хелатором двухвалентного железа и, таким образом, блокирует действие флуоресцентного индикатора железа (рис. 5А). Напротив, PBT434 не конкурировал с FerroOrange за Fe.^{2 плюс}, поведение, согласующееся с его более умеренным сродством [30]. Результаты показали, что PBT434, но не PBT434-вместе с неактивным производным, индуцирует 34 ± 9-процентное увеличение Fe, доступного для FerroOrange.^{2 плюс}предполагая, что этот хелатирующий агент мобилизовал железо внутри клетки без сопутствующей токсичности. Данные, представленные ниже, предполагают, что это железо было получено из ферритина.

Ранее было показано, что PBT434 восстанавливает истощенную экспрессию белка ферропортина у мышей, получавших MPTP, до уровня, аналогичного таковому у неповрежденных мышей [30]. Этот результат, наряду с увеличением внутриклеточного окрашивания двухвалентным железом в ответ на PBT434, предполагает потенциальное влияние на систему клеточного ответа на железо и функцию нижестоящих белков, связанных с железом. Чтобы оценить это, мы сначала провели количественный ПЦР-анализ влияния PBT434 на количество транскриптов для нескольких белков, обрабатывающих железо (рис. 6). В то время как транскрипты белка оттока железа, ферропортина (Fpn), и двух цитоплазматических шаперонов железа, PCBP1 и 2, не изменились, обилие мРНК рецептора трансферрина (TfR) и ферроксидазы, церулоплазмина (Cp), не изменились. изменять. Транскрипты TfR и Cp увеличились в 2,8 и 3,{13}} раза соответственно. Экспрессия рецептора трансферрина (TfR) связана с системой железочувствительный элемент (IRE)/железо-регуляторный белок (IRP) [42-44]. Увеличение мРНК TfR предполагает, что PBT434 конкурирует с PCBP1-зависимой доставкой железа за сборку кластера Fe, S, который превращает регуляторный IREBP из РНК-связывающего белка в цитозольную аконитазу [45]. Таким образом, PBT434 смещает эту регуляторную модуляцию в сторону связывания РНК и соответствующего ингибирования деградации мРНК TfR. При дефиците клеточного железа экспрессия ЦП частично регулируется HIF-1 [46]. Увеличение функции HIF-1 следует из нокдауна его гидроксилирования пролилгидроксилазной активностью в железозависимой реакции [47]. Как и в случае IREBP, PBT434, по-видимому, уменьшает пул железа, который служит кофактором гидроксилирования и деградации HIF-1. В этой модели увеличение стационарного уровня этого активатора транскрипции увеличивает транскрипцию Cp.

Используя комбинацию анализа ELISA и вестерн-блоттинга, мы исследовали экспрессию белков, связанных с железом, в hBMVEC, обработанных PBT434 или PBT434-met; примеры анализа ВБ приведены на рис. 7А. Данные показали, что количество мономера и димера TfR значительно увеличилось к 24 часам, как и ЦП (фиг. 7B и 7C). Оба повышения происходили параллельно PBT434-зависимому увеличению соответствующих транскриптов (рис. 6). Напротив, экспрессия белка оттока железа, Fpn, была нечувствительна к обработке PBT434 (рис. 7D).

Мы использовали ELISA в качестве дополнительного метода для количественной оценки изменений кратности, показанных данными вестерн-блоттинга. Таким образом, hBMVEC обрабатывали PBT434 в течение 24 часов, а клеточные лизаты анализировали с помощью ELISA на TfR (фиг. 8A). Кратность увеличения TfR в ответ на обработку PBT434, количественно определенная с помощью ELISA, была эквивалентна увеличению, полученному при анализе вестерн-блоттинга (фиг. 7B). ELISA использовали также для оценки количества секретируемого и GPI-связанного белка Cp, используя клетки HepG2 в качестве положительного контроля. Что касается Cp, секретируемого в среду для выращивания, этот подход был ограничен тем, что содержание sCp в средах, кондиционированных HepG2 и hBMVEC, было на уровне или ниже нижнего предела чувствительности этого анализа (S3 Fig). Однако это позволило оценить содержание GPI-Cp. В этом методе клетки обрабатывали фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазой С (PI-PLC), которая расщепляет якорь GPI; кондиционированную таким образом среду концентрировали и анализировали с помощью Cp-ELISA. Хотя этот подход продемонстрировал, что PBT434 увеличивает количество GPI-Cp в клетках HepG2, он снова не смог обнаружить какой-либо Cp, высвобождаемый PI-PLC (фиг. 8B). ELISA также обеспечивает прямой метод количественного определения ферритина. Для этого hBMVEC нагружали 1 мкМ цитрата Fe в течение 24 часов с последующей обработкой в ​​отсутствие или в присутствии PBT434 в течение дополнительного 1 часа. Полученные клеточные лизаты подвергали анализу ELISA на ферритин (фиг. 8C). В отличие от увеличения TfR, обработка PBT434 снижала уровень белка ферритина (Ft) примерно на 18 процентов. Действительно, эта потеря белка Ft была очевидна уже после 1-часовой обработки реагентом. Временной характер этого результата можно коррелировать с отмеченным выше увеличением благотворительного Fe2 plus после 30-минутной обработки PBT434. Как обсуждалось позже, нокдаун ферритина был продемонстрирован после обработки другими проникающими в клетку Fe2 плюс хелатирующие агенты [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 плюс}поглощение ингибируется комплексообразованием с PBT434

Учитывая быстрое уравновешивание PBT434 в hBMVEC в течение 30 минут по сравнению с медленным двухфазным поглощением и уравновешиванием Fe2 plus в течение 24 часов [49], мы предположили, что PBT434 и Fe2 plus не имеют одного и того же механизма поглощения. Чтобы проверить это, монослои инкубировали с радиоактивно меченым 55Fe2 plus в отсутствие или в присутствии PBT434 или PBT434-met, и отслеживали поглощение 55Fe2 plus в течение 3 часов (рис. 9A). PBT434 значительно снижал скорость поглощения 55Fe2 plus, а также уменьшал общее накопление 55Fe2 plus в клеточных лизатах (рис. 9C). Этот эффект не наблюдался при434-соответствии с PBT. Сравнение скоростей поглощения PBT434 и 55Fe показывает, что PBT434 и Fe2 plus поглощаются разными транспортными путями. Кроме того, ингибирование поглощения 55Fe в присутствии PBT434, но не PBT434-met, предполагает, что внеклеточный комплекс железа PBT434-не является лигандом для переносчиков двухвалентного железа в hBMVEC, а именно ZIP8, и ZIP14.

Цистанхе добавки

Чтобы дополнительно изучить роль PBT434 в накоплении железа, мы проверили влияние его предварительного воздействия на поглощение 55Fe2 плюс. Клетки, предварительно обработанные PBT434, которые после промывки подвергались воздействию 55Fe2 plus, показали увеличение скорости поглощения и накопления 55Fe2 plus через 3 часа (рис. 9, панели B и D). Это повышенное накопление сохранялось в течение по крайней мере 24 часов. Эти данные свидетельствуют о том, что предварительное воздействие PBT434 на клетки временно усиливает поглощение железа. Неожиданно, что PBT434-соответствовал предварительной обработке, также показал увеличение как поглощения, так и накопления (рис. 9B), но этот эффект не был таким значительным или стойким, как у PBT434.

Мы показали, что поглощение железа из 59Fe-трансферрина поддерживается за счет ферри-восстановления и ферро-проницаемости плазматической мембраны ГА [50, 51]. Одним экспериментальным результатом в поддержку этой модели поглощения железа TBI был нокдаун этого поглощения путем ингибирования внецитоплазматической активности ферредуктазы; другим результатом было 60-процентное ингибирование поглощения железа TBI феррозином, сильным хелатирующим агентом двухвалентного железа [50]. Эта последняя стратегия была использована для демонстрации того, что PBT434, но не PBT434-met, также ингибирует поглощение железа TBI (рис. 10).

5. PBT434 стимулирует Fpn-зависимый 55Fe2 плюс отток

PBT434 обладает примерно 20-процентной способностью деферипрона вызывать очевидную стимуляцию Fe2 плюс отток из нейрональных клеток [30]. Мы оценили отток 55Fe2 plus из hBMVEC в отсутствие или в присутствии PBT434 в контрольных клетках или клетках, обработанных мини-гепсидином, PR73. Гепсидин представляет собой пептидный гормон, обнаруживаемый как системно, так и в интерстиции головного мозга, который связывается с Fpn и нацеливает переносчик для деградации. Эффекты гепсидина на функцию экспорта железа Fpn широко изучались [52–54]. Ранее мы показали, что отток Fe2 plus из hBMVEC зависит от Fpn [35, 49]. PR73 имеет EC50 ~ 4 нМ для деградации Fpn в репортерном анализе GFP [55]. hBMVEC в монослоях загружали 55Fe2 плюс в течение 24 ч в отсутствие или в присутствии PR73. Затем определяли отток 55Fe в течение 5-часового периода при продолжающемся отсутствии или присутствии PR73 в сочетании с отсутствием и присутствием PBT434 (рис. 11). В то время как PR73 подавлял отток 55Fe как из контрольных, так и из 434-обработанных ФБТ культур, РВТ434 частично подавлял ингибирование, вызванное мини-гепсидином. В отсутствие PBT434 отток железа из культур, 73-обработанных PR, снижался примерно на 75%, тогда как в культурах, обработанных PBT{37}}, отток железа составлял только ~50% (рис. 11 и таблица 2). Из этих результатов можно сделать два вывода. Во-первых, нокдаун Fpn с помощью PR73 подавляет отток 55Fe как в присутствии, так и в отсутствие PBT434. Во-вторых, в любом случае PBT434 поддерживает значительную, хотя и небольшую стимуляцию оттока железа.

Рекомендации

1. Хэтчер Х.К., Сингх Р.Н., Торти Ф.М., Торти С.В. Синтетические и натуральные хелаторы железа: терапевтический потенциал и клиническое применение. Future Med Chem. 2009 г.; 1 (9): 1643–1670.

2 . Нуньес М.Т., Чана-Куэвас П. Новые перспективы железохелатной терапии для лечения нейродегенеративных заболеваний. Фармацевтика (Базель). 2018; 11(4):109.

3. Тосато М., Ди Марко В. Металлохелатная терапия и болезнь Паркинсона: критический обзор термодинамики комплексообразования между соответствующими ионами металлов и многообещающими или известными лекарствами. Биомолекулы. 2019; 9(7).

4. Хедера П. Новые данные о клиническом лечении болезни Вильсона. Приложение Clin Genet. 2017; 10:9–19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Сравнительная эффективность и безопасность дефероксамина, деферипрона и деферазирокса при тяжелой талассемии: метаанализ 16 рандомизированных контролируемых исследований. ПЛОС Один. 2013; 8(12):e82662.

6. Бюттнер Г.Р., Юркевич Б.А. Каталитические металлы, аскорбат и свободные радикалы: комбинации, которых следует избегать. Радиационное разрешение 1996 год; 145(5):532–41. PMID: 8619018

7. Сингх А., Кукрети Р., Сасо Л., Кукрети С. Окислительный стресс: ключевой модулятор нейродегенеративных заболеваний. Молекулы. 2019; 24(8).

8. Ашраф А., Кларк М., Со П.В. Старение Железного человека. Front Aging Neurosci. 2018; 10:65.

9. Гадери С., Пирпамер Л., Хофер Э., Лангкаммер С., Петрович К., Лойтфельдер М. и др. Картирование R2 * для железа в головном мозге: связь с когнитивными функциями при нормальном старении. Нейробиол Старение. 2015 г.; 36 (2): 925–32.

10. Зекка Л., Юдим М.Б.Х., Ридерер П., Коннор Дж.Р., Крайтон Р.Р. Железо, старение мозга и нейродегенеративные расстройства. Нат Рев Нейроски. 2004 г.; 5(11):863–73.

11. Ди Мео И., Тиранти В. Классификация и молекулярный патогенез синдромов NBIA. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.

12. Леви С., Финацци Д. Нейродегенерация с накоплением железа в головном мозге: обновленная информация о патогенетических механизмах. Фронт Фармакол. 2014; 5:99–.

13. Леви С., Тиранти В. Нейродегенерация с нарушениями накопления железа в головном мозге: ценные модели, направленные на понимание патогенеза отложения железа. Фармацевтика (Базель). 2019; 12(1).

14. Мейер Э., Куриан М.А., Хейфлик С.Дж. Нейродегенерация с накоплением железа в мозге: генетическое разнообразие и патофизиологические механизмы. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015 г.; 16: 257–79.

15. Тонекабони С.Х., Молламохаммади М. Нейродегенерация с накоплением железа в головном мозге: обзор. Иран Дж. Чайлд Нейрол. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Моделирование нейроферритинопатии стволовыми клетками показывает, что железо является детерминантой старения и ферроптоза при старении нейронов. Отчеты о стволовых клетках. 2019; 13(5):832–46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Железо и болезнь Альцгеймера: от патогенеза к терапевтическим последствиям. Фронтальные нейроски. 2018; 12:632.

18. Льоренс Дж. В., Сориано С., Калап-Кинтана П., Гонсалес-Кабо П., Молто М.Д. Роль железа в атаксии Фридрейха: результаты исследований тканей человека, клеточных и животных моделей. Фронтальные нейроски. 2019; 13:75.

19. Пушманн А. Новые гены, вызывающие наследственную болезнь Паркинсона или паркинсонизм. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Ориентация на метаболизм железа при разработке и доставке лекарств. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.

21. Гуральник Дж.М., Эйзенштадт Р.С., Ферруччи Л., Кляйн Х.Г., Вудман Р.С. Распространенность анемии среди лиц в возрасте 65 лет и старше в Соединенных Штатах: свидетельство высокой частоты необъяснимой анемии. Кровь. 2004 г.; 104 (8): 2263–8.

22. Пепе А., Мелони А., Капра М., Чианчулли П., Проссомарити Л., Малавентура С. и другие. Лечение деферасироксом, деферипроном и десфериоксамином у пациентов с тяжелой талассемией: сравнение сердечного железа и функции, определяемое количественной магнитно-резонансной томографией. Гематология. 2011 г.; 96(1):41–7.

23. Пандольфо М., Арпа Дж., Делатицки М.Б., Ле Куан Санг К.Х., Мариотти С., Миних А. и др. Деферипрон при атаксии Фридрейха: рандомизированное контролируемое исследование продолжительностью 6- месяцев. Энн Нейрол. 2014; 76 (4): 509–21.

24. Мартин-Бастида А., Уорд Р.Дж., Ньюбоулд Р., Пиччини П., Шарп Д., Кабба С. и др. Хелирование железа в головном мозге деферипроном в фазе 2 рандомизированных двойных слепых плацебо-контролируемых клинических испытаний при болезни Паркинсона. Научный представитель 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Ориентация на хелатное железо как терапевтическое средство при болезни Паркинсона. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал. 2014; 21(2):195–210. https://дои. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Сингх С., Эпемолу Р.О., Доббин П.С., Тилбрук Г.С., Эллис Б.Л., Дамани Л.А. и соавт. Профили метаболизма 1,2-диметил- и 1,2-диэтилзамещенных 3-гидроксипиридин-4-онов в моче у людей и крыс. Метаболизм и распределение лекарств. 1992 год; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Ходавердян В., Тападар С., Макдональд И.А., Сюй Ю., Хо П.Ю., Бриджес А. и др. Деферипрон: панселективное исследование ингибирующей активности гистон-лизин-деметилазы и структурной активности. Научный представитель 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. Недавние разработки сосредоточены на перорально активных хелаторах железа. Отчеты о талассемии. 2014; 4 (2).

29. Косман Д.Дж. Метаболизм железа у аэробов: управление гидролизом трехвалентного железа и самоокислением двухвалентного железа. Coord Chem Rev. 2013; 257 (1): 210–7.

30. Финкельштейн Д.И., Биллингс Дж.Л., Адлард П.А., Эйтон С., Седжахтера А., Мастерс С.Л. и соавт. Новое соединение PBT434 предотвращает опосредованную железом нейродегенерацию и токсичность альфа-синуклеина в различных моделях болезни Паркинсона. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.

31. Эрас-Гарвин А., Рефоло В., Шмидт С., Брэдбери М., Стамлер Д., Стефанова Н., редакторы. PBT434 сохраняет дофаминергические нейроны, снижает олигомеризацию альфа-синуклеина и улучшает двигательную функцию в модели мультисистемной атрофии трансгенных мышей. Анналы неврологии; 2020: Wiley 111 River St, Хобокен 07030–5774, Нью-Джерси, США.

32. Герас-Гарвин А., Стефанова Н. MSA: от основных механизмов к экспериментальной терапии. Расстройство, связанное с паркинсонизмом. 2020; 73:94–104.

33. Доусон В.Л., Доусон Т.М. Перспективная модифицирующая болезнь терапия болезни Паркинсона. Научная трансляционная медицина. 2019; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Сравнительное исследование четырех иммортализованных линий эндотелиальных капилляров головного мозга человека, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 и BB19, и оптимизация условий культивирования для модель гематоэнцефалического барьера in vitro для исследований проницаемости лекарств. Жидкости и барьеры ЦНС. 2013; 10(1):33.

35. Маккарти Р.С., Косман Д.Дж. Церулоплазмин глиальных клеток и гепсидин по-разному регулируют отток железа из эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга. ПЛОС Один. 2014; 9(2):e89003.

36. Стеймле Б.Л., Смит Ф.М., Косман Д.Дж. Растворенные носители ZIP8 и ZIP14 регулируют накопление марганца в эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга и контролируют уровни марганца в головном мозге. Дж. Биол. Хим. 2019; 294 (50): 19197–208.

37. Стинс М.Ф., Бэджер Дж., Сик Ким К. Бактериальная инвазия и трансцитоз в трансфицированных эндотелиальных клетках микрососудов головного мозга человека. Микроб Патог. 2001 г.; 30(1):19–28.

38. Стамлер Д., Брэдбери М., Вонг С., Оффман Э. Первое исследование на людях PBT434, нового низкомолекулярного ингибитора агрегации -синуклеина (S4.001). Неврология. 2019; 92 (дополнение 15): S4.001.

39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Исследование фазы 1 PBT434, нового низкомолекулярного ингибитора агрегации -синуклеина, у взрослых и пожилых добровольцев (4871). Неврология. 2020; 94 (дополнение 15): 4871.

40. Маккарти Р.С., Косман Д.Дж. Активация экспрессии церулоплазмина в клетках глиобластомы C6 соседними интерлейкинами, происходящими из эндотелия головного мозга человека, в системе модели гематоэнцефалического барьера in vitro. Сотовая связь и сигнализация: CCS. 2014; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP модулирует отток железа из эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга путем стабилизации экспортера двухвалентного железа ферропортина. Отчеты ЕМБО. 2014; 15(7):809–15. https://дои. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. От двух до танго: регуляция метаболизма железа у млекопитающих. Клетка. 2010 г.; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Чжоу З.Д., Тан Э.К. Железорегуляторный белок (IRP)-железочувствительный элемент (IRE) сигнальный путь при нейродегенеративных заболеваниях человека. Молекулярная нейродегенерация. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/с13024-017-0218-4 PMID: 29061112

44. Крайтон Р.Р., Декстер Д.Т., Уорд Р.Дж. Метаболизм железа в головном мозге и его нарушения при неврологических заболеваниях. J Neural Transm. 2011 г.; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Патель С.Дж., Фрей А.Г., Паленчар Д.Дж., Ачар С., Буллоу К.З., Вашишт А. и др. Шапероновый комплекс PCBP1-BolA2 доставляет железо для сборки цитозольного кластера [2Fe-2S]. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Мухопадхьяй С.К., Мазумдер Б., Фокс П.Л. Роль индуцируемого гипоксией фактора -1 в активации транскрипции церулоплазмина при дефиците железа. Дж. Биол. Хим. 2000 г.; 275 (28): 21048–54.

47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Гидроксилирование белков гидроксилазами фактора, индуцируемого гипоксией (HIF): уникально или повсеместно? Клетки. 2019; 8(5).

48. Де Доменико И., Вон М.Б., Ли Л., Бэгли Д., Муски Г., Уорд Д.М. и др. Опосредованная ферропортином мобилизация железа ферритина предшествует деградации ферритина протеасомой. Эмбо Дж. 2006 г.; 25 (22): 5396–404.

49. Маккарти Р.С., Косман Д.Дж. Ферропортин и активность экзоцитоплазматической ферроксидазы необходимы для оттока железа из эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга. Журнал биологической химии. 2013; 288(24):17932–40.

50. Маккарти Р.С., Косман Д.Дж. Механистический анализ накопления железа эндотелиальными клетками ГЭБ. Биометаллы. 2012 г.; 25(4):665–75.

51. Косман Д.Дж. Телос металловосстановления и металлоокисления в эукариотических перевозках железа и меди. Металломика. 2018; 10 (3): 370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Ашемейер С., Цяо Б., Стефанова Д., Валоре Э.В., Сек А.С., Руве Т.А. и соавт. Структурно-функциональный анализ ферропортина определяет сайт связывания и альтернативный механизм действия гепсидина. Кровь. 2018; 131 (8): 899–910.

53. Ганц Т., Немет Э. Гепсидин и гомеостаз железа. Биохим Биофиз Акта. 2012 г.; 1823 (9): 1434–1443.

54. Цяо Б., Сугианто П., Фунг Э., Дель-Кастильо-Руэда А., Моран-Хименес М.Дж., Ганц Т. и др. Индуцированный гепсидином эндоцитоз ферропортина зависит от убиквитинирования ферропортина. Клеточный метаб. 2012 г.; 15(6):918–24.

55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Минигепсидины, производные тиола, сохраняют биологическую активность. Bioorg Med Chem Lett. 2015 г.; 25 (4): 763–6.

Даниэль К. БейлиID, Уитни Кларк, Дэниел Дж. Косман

Кафедра биохимии, Школа медицины и биомедицинских наук Джейкобса, Университет штата Нью-Йорк в Буффало, Буффало, штат Нью-Йорк, Соединенные Штаты Америки