Часть 1: 3-Гидроксифенилуксусная кислота: метаболит флавоноидов, снижающий кровяное давление

Контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный: регулярное потребление продуктов, богатых полифенолами, связано с широким спектром полезных эффектов для здоровья, включая профилактикусердечно-сосудистые заболевания. Тем не менее, родительфлавоноиды в основном имеют низкую биодоступность, и, следовательно, предполагается, что их метаболиты являются биологически активными. Ранее сообщалось, что один из этих метаболитов, 3-гидроксифенилуксусная кислота (3-HPAA), образованный микробиотой кишечника, оказывает сосудорасширяющее действие ex vivo. Цель этого исследования состояла в том, чтобы пролить больше света на этот эффект in vivo и выяснить механизм действия. 3-HPAA вызывала дозозависимое снижение артериального давления при внутривенном введении как в виде болюса, так и в виде инфузии крысам со спонтанной гипертензией. Напротив, никаких существенных изменений в частоте сердечных сокращений не наблюдалось. В экспериментах ex vivo, где свиные сердца с бойни использовались для уменьшения потребности в лабораторных животных, 3-HPAA расслаблял предварительно сокращенные сегменты коронарных артерий свиньи с помощью механизма, частично зависящего от целостности эндотелия. Эта релаксация была значительно нарушена после ингибирования эндотелиальной синтазы оксида азота. Напротив, блокада каналов SKCa или IKCa или мускариновых рецепторов не влияла на расслабление 3-HPAA. Точно так же не наблюдалось влияния 3-HPAA на циклооксигеназу и кальциевые каналы L-типа. Таким образом, 3-HPAA уменьшаетсякровяное давлениеin vivo посредством релаксации сосудов, и этот механизм может быть основан на высвобождении оксида азота эндотелиальным слоем.

Ключевые слова: флавоноиды; микробиота кишечника; метаболиты; 3-гидроксифенилуксусная кислота; артериальное давление; вазорелаксация; коронарный; артерия; крыса; свинья

1. Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смерти во всем мире, и, по оценкам, число смертей приближается к 18 миллионам в год. Ишемическая болезнь сердца и инсульт являются причиной примерно 85% этих фатальных сердечно-сосудистых событий [1]. Глобальная смертность и заболеваемость побудили к внедрению рекомендаций по профилактике сердечно-сосудистых рисков [2]. Выявление стойкого высокого артериального давления с последующим лечением является одной из основных стратегий [34]. Действительно, артериальная гипертензия классифицируется как основной фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. Чаще всего это связано с повышением системного сосудистого сопротивления, что часто связано с различными структурными и функциональными изменениями в сосудистой сети, нарушающими сосудистый гомеостаз. В частности, нарушена функция интимы сосудов, образованной одним слоем эндотелиальных клеток. Кроме того, гладкомышечные клетки сосудов часто кажутся более сокращенными и менее чувствительными к эндотелиальным расслабляющим факторам [5].

Несколько исследований предоставили доказательства защитного действия богатой полифенолами диеты против сердечно-сосудистых заболеваний. Действительно, диета, богатая фруктами, овощами, орехами, шоколадом или чаем, которые являются богатыми источникамифлавоноиды, был связан со снижением риска сердечно-сосудистых заболеваний [6]. Помимо антиоксидантных, противовоспалительных, антиагрегантных и антимикробных свойств,флавоноидытакже обладают значительными сосудорасширяющими свойствами [7,8]. Однако потребление флавоноидов во всем мире сильно варьируется, и после приема внутрь эти соединения сложным образом взаимодействуют с желудочно-кишечным трактом. Вкратце, флавоноиды встречаются в растениях в основном в видегликозиды. После введения в виде пищи они гидролизуются во время пищеварения, что позволяет высвобождать агликоновую форму в тонком кишечнике. Агликоны, в свою очередь, могут подвергаться метаболизму в эпителии тонкой кишки и позднее в печени. Это приводит к очень плохой биодоступности исходных флавоноидов, что неоднократно подтверждалось [9,10]. Однако неабсорбированная фракция проходит из тонкой кишки в дистальный отдел, где она расщепляется микробиотой толстой кишки, что приводит к продукции малых фенольных соединений, включая фенилпропионовую, фенилуксусную, бензойную кислоты и гидроксибензолы, которые впоследствии всасываются. 9]. Примечательно, что за последние несколько десятилетий стало ясно, что защитные эффекты пищевых флавоноидов связаны с их метаболитами, а не с исходными формами [10-12]. Несмотря на это, Бут и его коллеги задокументировали еще в начале 1950-х годов присутствие различных метаболитов флавоноидов, а именно 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DHPA), 3-гидроксифенилуксусной кислоты (3-HPAA) и гомованилиновой кислоты. в моче различных видов животных после перорального приемакверцетин[13]; исследования биологического действия малых фенольных метаболитов флавоноидов проводятся гораздо позже. В частности, в последние годы исследования метаболической судьбы флавоноидов, а также исследования, сообщающие о биологической активности их метаболитов микробного происхождения, стали горячей и интенсивно изучаемой темой в этой области. Наша исследовательская группа показала, что несколько микробных метаболитов, включая DHPA, 4-метилкатехин и 3-(3-гидроксифенил)пропионовую кислоту, расслабляют аорту крыс, вероятно, в физиологически достижимых концентрациях [14,15]. ]. Насколько нам известно, 3-HPAA является одним из наименее изученных метаболитов. Документально подтверждено, что он является метаболитом ряда фенольных соединений, включая различные классы флавоноидов, таких как флавонолы (кверцетин с его гликозидом рутином, кемпферол), изофлавоны и флаванолы (как олигомерные процианидины, так и их мономерные единицы, катехин и эпикатехин) (рис. 1) [16-20].

Поскольку 3-HPAA расслабляет клетки гладкой мускулатуры ex vivo [14], это исследование было направлено на то, чтобы проверить, способен ли этот метаболит вызывать снижение артериального давления in vivo, и определить его механизм действия в серии механистических экспериментов. .

2. Материалы и методы

2.1. Животные

Эксперименты in vivo проводились на спонтанно гипертензивных крысах (SHR), полученных от Чешской академии наук, Прага, Чехия. Животных разводили в виварии фармацевтического факультета и содержали при постоянной температуре 23-25 градусов с 12-часовым циклом темнота/свет. Крысам давали стандартную диету и водопроводную воду ad libitum. Исследование (рег. № 4937 2019-9) было одобрено Министерством образования, молодежи и спорта в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальным институтом здравоохранения США (8-е издание, исправленное). 2011 г., ISBN-13:978-0-309-15400-0).

2.2.Химикаты

Пентобарбитал, нитропруссид натрия, диметилсульфоксид (ДМСО), метиловый эфир L-Nw-нитроаргинина (L-NAME), атропин, TRAM-34/1-[(2-хлорфенил)дифенилметил] -1H-пиразол, индометацин, нифедипин, брадикинин, KCl, CaCl и UCL-1684/6,12,19, 20,25,26-гексагидро-5,27 :13,18:21,24-триэтено-11,7-метено-7H-дибензо[b,m][1,5,12,16]тетраазациклотрикозин{{ 29}},13-гидрат трифторацетата дия приобретали у Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия). Bay K8644 был получен от Axon Medchem BV (Гронинген, Нидерланды). Тестируемый метаболит 3-HPAA был приобретен у компании Toronto Research Chemicals (Торонто, Онтарио, Канада). NaCl, NaHCO3 и D-глюкоза были предоставлены компанией PENTA sro (Прага, Чехия). республика). Физиологический раствор был приобретен у Baxter Czech spol. sro (Прага, Чехия) и гепарин от Zentiva (Прага, Чехия).

Нитропруссид натрия, L-NAME и атропин растворяли в дистиллированной воде. Исходные растворы TRAM-34（1 мМ） и UCL-1684（100 мкМ） готовили в виде водных растворов с добавлением 20% и 10% ДМСО соответственно. Исходный раствор индометацина (1 мМ) также готовили в 10% растворе ДМСО/вода, а Bay K8644 (10 мМ) и нифедипин (10 мМ) растворяли в чистом ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в тканевой камере всегда была<0.2%.the krebs="" solution="" contains="" the="" following="" (mm):="" nacl119,="" kcl4.7,="" cacl2="" 1.25,kh2po41.18,="" mgso4.7h2o1.17,="" nahco325,="" and="" d-glucose="">

2.3. Эксперименты in vivo

Двенадцать крыс SHR (средний вес 356 ± 21 г, артериальное давление под анестезией 211 ± 64/152 ± 45 мм рт. ст., частота сердечных сокращений 381 ± 37 ударов в минуту) были анестезированы внутрибрюшинно пентобарбиталом (5 0 мг кг-). Датчик давления MLTO380/D был подключен к левой общей сонной артерии, и артериальное давление с частотой сердечных сокращений регистрировалось с помощью устройства Power Lab, подключенного к программному обеспечению LabChart 7 (ADInstruments, Сидней, Австралия). Левую подкожную вену канюлировали для внутривенного введения болюса или инфузии. После операции каждой крысе давали стабилизироваться в течение 15 минут перед экспериментом. 3-HPAA растворяли в физиологическом растворе и вводили по двум протоколам: (1) в виде однократной болюсной дозы в диапазоне от 0.00от 1 до 10 мг/кг{{18 }}(применяемый объем всегда был 0,1 мл, n=8); или (2) в виде четырех последовательных 5-минутных инфузий в дозах 0,05, 0,25, 1 и 5 мг.кг-1.мин-1 （n=4） при скорости инфузии 50 мкл в минуту с помощью шприцевого насоса «Genie» Kent (Kent Scientific Corporation, Торрингтон, Коннектикут, США) (рис. 2а). В обоих протоколах следующую дозу всегда вводили после того, как артериальное давление стабилизировалось в течение не менее 5 минут. В качестве контроля каждое животное обрабатывали физиологическим раствором в тех же условиях перед первым введением 3-HPAA. После измерения каждую крысу умерщвляли внутривенным введением KCl (1 мл, 1 моль·л-). Температуру тела во время эксперимента поддерживали на уровне 36,5±0,5 градуса с помощью нагревательной пластины.

2.4. Эксперименты Ex Vivo

2.4.1. Подготовка ткани

Эксперименты ex vivo проводились на кольцевых сегментах коронарных артерий свиньи (рис. 2b). Свиные сердца (n= 11) были получены с местной бойни. Свиньи представляли собой здоровых животных обоего пола, от стандартного разведения и находящихся под ветеринарным контролем, предназначенных для потребления. Сердца обрабатывали для эксперимента примерно через 4 ч после убоя животного. Сердца погружали в раствор Кребса и немедленно вырезали левую огибающую коронарную артерию, снова погружали в раствор Кребса и очищали от прилипшего жира, соединительной ткани и крови. После этого очищенную коронарную артерию разрезали на цилиндрические кольца длиной примерно 3 мм. Для некоторых механистических экспериментов эндотелиальный слой механически разрушали, осторожно растирая пинцетом поверхность просвета. Кольца выдерживали в тканевых ваннах, наполненных раствором Кребса, в условиях насыщения кислородом (95% О и 5% СО2) при 37°С. Каждое артериальное кольцо было подвешено между двумя проволочными крючками из нержавеющей стали, один из которых был прикреплен к держателю, а второй соединен с датчиком и компьютером, оснащенным программным обеспечением SPEL Advanced Kymograph Software, v3.2 (Experimetria Ltd., Будапешт, Венгрия). Такое расположение позволяет измерять изометрическое натяжение. Препараты уравновешивали при натяжении 2 г в течение 40 мин, в течение которых раствор Кребса заменяли каждые 10 мин. После этого натяжение устанавливали на уровне 1 г (базовый уровень), каждую тканевую ванну заполняли 5 мл раствора Кребса и проводили следующий тест на жизнеспособность: коронарные кольца сокращали с помощью KCl (конечная концентрация в ванне составляла 40 мМ), и когда было достигнуто плато, добавляли брадикинин (300 нМ) для подтверждения интактного эндотелия или оголенных колец. Затем коронарные кольца несколько раз промывали раствором Кребса.

2.4.2. Подтверждение сосудорасширяющей активности 3-HPAA на коронарной артерии свиньи

Вазорелаксантную активность измеряли на предварительно сокращенных KCl (40 мМ) артериальных кольцах (рис. 2b). Как только было достигнуто плато, 3-HPAA кумулятивно добавляли в ванну в концентрациях в диапазоне от 100 мкМ до 1 мМ.3-HPAA готовили в растворе Кребса. Раствор Кребса без испытуемого соединения добавляли в некоторые коронарные кольца в качестве контроля по той же методике. Каждую дозу применяли после стабилизации релаксантного ответа, вызванного предыдущей дозой, а нитропруссид натрия (100 мкМ) использовали для индукции максимального расслабления во всех экспериментах в конце процедуры.

2.4.3. Механические эксперименты

В следующих экспериментах был изучен механизм сосудорасширяющего действия 3-HPAA на интактные коронарные кольца эндотелия с использованием ингибитора синтазы оксида азота (NO), L-NAME (100 мкМ); антагонист мускариновых рецепторов, атропин (50 мкМ); ингибитор циклооксигеназы (ЦОГ), индометацин (10 мкМ); или ингибиторы Ca2+-активированных Kt-каналов средней и малой проводимости, TRAM-34 (10 мкМ) и UCL-1684 (1 мкМ) соответственно (рис. 2b). Атропин или ингибиторы всегда добавляли за 30 мин до добавления KCl (40 мМ). Затем, в отдельном эксперименте, было исследовано участие сосудистых каналов Cay1.2 Ca2 plus (L-типа) в 3-HPAA-индуцированной вазорелаксации путем предварительной обработки обнаженных эндотелием коронарных колец 15 мМ KCl с последующей инкубацией. с 3-HPAA в концентрации 1 мМ в течение 30 мин. Затем активатор кальциевых каналов L-типа, Bay K8644, наносили кумулятивно (100 пМ-10 мкМ) в темноте, чтобы вызвать сократительный ответ. KCl (80 мМ) использовали для индукции максимального сокращения. В качестве отрицательного контроля использовали кольца, инкубированные с соответствующим объемом носителя (раствор Кребса). Кроме того, в качестве положительных контролей использовали кольца, инкубированные с известным ингибитором кальциевых каналов L-типа нифедипином (150 нМ). Исследуемые целевые белки и лиганды, использованные в механистических экспериментах, приведены в таблице 1.

2.5. Анализ данных

Для анализа данных использовали GraphPad Prism 7.03 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Для экспериментов in vivo различия между отдельными болюсными дозами 3-HPAA и контролем (физиологическим раствором) сравнивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Даннетта. Для инфузий использовали двухфакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннетта. Для механистических экспериментов ex vivo результаты сравнивали с использованием непарного t-критерия. Для экспериментов с заливом K8644 использовался двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Даннета для множественных сравнений. Данные представлены как среднее ± SEM.

3. Результаты

3.1.Влияние 3-HPAA на артериальное давление и частоту сердечных сокращений in vivo в SHR

3.1.1. Однократное болюсное введение

Значительное снижение среднего, систолического и диастолического артериального давления наблюдалось после болюсного введения {{0}}HPAA в дозах от 0.01 до 10 мг·кг-'. (Рисунки 3 и S1). Снижение систолического артериального давления было очевидным с дозы 0,1 мг. кг-л (рис. 3а), тогда как диастолическое артериальное давление значительно снизилось даже при 10-кратно более низкой дозе (0,01 мг кг-л) (рис. 3б). В том же эксперименте не было обнаружено влияния на частоту сердечных сокращений ни при 3-Дозы НРАА (рис. S2).

3.1.2. Инфузионное введение

5-минутные инфузии 3-HPAA привели к снижению среднего, систолического и диастолического артериального давления (полные результаты на рисунке S3). Эффект был дозозависимым, достигая максимально ок. 50 процентов. Значительные изменения были вызваны двумя самыми высокими дозами, 1 и 5 мг·кг-1·мин-I (рис. 4). Кроме того, в этом случае не было обнаружено значительных изменений частоты сердечных сокращений (рис. S4).

3.2. Подтверждение сосудорасширяющих свойств 3-HPAA на коронарной артерии свиньи

В экспериментах ex vivo 3-HPAA индуцировала вазодилатация коронарных артерий свиней дозозависимым образом (рис. 5). За исключением первой дозы, наблюдалась вазодилатация. Однако результаты были значимыми только для самой высокой концентрации (1 мМ). Эту же концентрацию использовали для дальнейшего механистического тестирования ex vivo.

3.3. Механизм сосудистых эффектов 3-HPAA, изученных ex vivo, на коронарных артериях свиней

Чтобы исследовать механизмы, лежащие в основе 3-HPAA-индуцированной вазодилатации, мы сравнили ее влияние на кольца коронарных артерий свиньи с интактным эндотелием и без эндотелия, предварительно сжатые KCl. Удаление эндотелия уменьшало сосудорасширяющий эффект (рис. 6б). После этого открытия было проверено участие эндотелиального NO. Предварительная обработка ингибитором eNOS, L-NAME (100 мкМ), также приводила к значительному снижению вазодилатации, вызванной 3-HPAA (рис. 6c). Напротив, аналогичная предварительная обработка коронарных колец антагонистом мускариновых рецепторов атропином (50 мкМ) или блокаторами каналов IKCa или SKCa, TRAM-34 (10 мкМ) и UCL-1684 (1 мкМ) соответственно, или с ингибитором ЦОГ, индометацин (10 мкМ) не вызывал каких-либо изменений вазодилатации, вызванной 3-HPAA (рис. 6d-g). Наконец, мы решили исследовать, может ли 3-HPAA действовать посредством ингибирования кальциевых каналов Cay1.2 (L-типа) на гладкомышечных клетках сосудов. Предварительная обработка колец 3-HIPAA (1 мМ) не оказала существенного влияния на сокращение, вызванное кумулятивными дозами Bay K8644 (100 пМ -10 мкМ) (рис. 7), в то время как инкубация с известным ингибитором кальциевых каналов Cav1.2 (L-типа) нифедипином (150 нМ) значительно уменьшала сокращения (положительный контроль).

Нажмите на ссылку, чтобы получить дополнительную информацию о части 2.
https://www.xjcistanche.com/news/part2-3-гидроксифенилуксусная кислота-а-кровь-pre-54725696.html