Часть 2: Биоактивные соединения из эфедры ломкой: оптимизация экстракции, химическая характеристика, антиоксидантная и антигликационная активность

Для получения дополнительной информации. контактtina.xiang@wecistanche.com

2.7.Антигликационная активность

2.7.1. УФ-видимый анализ

УФ-видимый спектр — это быстрый, последовательный и простой метод, обычно используемый для обнаружения конформационных изменений белков и образования комплексов. Спектры поглощения нативного и гликированного БСА, инкубированного в течение 15 сут в присутствии или в отсутствие КЭЭ/фракций, а такжекверцетин(положительный контроль) представлены на рисунке 3А.

Было четко показано, что нативный БСА имеет характерный пик при ≥ 2s0 нм, который в основном обусловлен ароматическими аминокислотами, включая тирозин, триптофан и фенилаланин [47].

После модификации глюкозой поглощение при λ280 нм было на 60,57% более гиперхромным, чем у нативного БСА. Повышенная интенсивность поглощения при длине волны 250 нм может быть связана с вызванным гликированием разворачиванием белковой спирали, что может повлиять на его нормальную физиологическую функцию.

Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>HE, которые были в 1,82, 1,71, 1,57, 1,35, 1,28 и 1,13- раза ниже, чем гликированный БСА. Тем не менее, эта активность была заметно ниже, чем укверцетиниспользовали в качестве положительного контроля (в 2,24- раза ниже, чем гликированный БСА). Таким образом, из исследований абсорбции можно сделать четкий вывод, что EAF из E.fragilis обладает защитным действием против развертывания BSA, вызванного гликированием белка.

2.7.2. Ингибирование гликирования белка в модели BSA-Glu

AGE представляют собой гетерогенную группу соединений с характеристиками флуоресценции при λ440 нм при возбуждении при 370 нм. Способность CEE и его различных фракций из E. fragilis ингибировать образование AGE оценивали с помощью анализа BSA-глюкозы, и результаты представлены на рисунке 3B.

Как видно из рисунка 3B, скорость ингибирования AGE всех тестируемых образцов демонстрировала тенденцию к увеличению с увеличением концентрации. При 1 мг/мл CCE, HE, DME EAE, WBF, WF и кверцетин ингибировали образование AGE на 53,26, 39,83, 54,82, 76,68, 69,09,48,83 и 97,84% соответственно после инкубации. на 15 дней. EAF (ICs =0,375±0,034 мг/мл) был наиболее эффективным ингибитором AGE среди всех фракций, за ним следовали WBF, DMF, CCE и WF с IC5. 0 значений 0,595 ± {{30}}.047, 0,857 ± 0,018, 0,951 ± 0,099 и 1,044 ± 0,032 мг/мл соответственно. Наиболее слабую активность проявлял HF со значением IC50 1,212±0,063 мг/мл.

Высотаантигликированиепотенциал EAF может быть связан с высоким содержанием фенолов и флавоноидов, которые были описаны как очень хорошие ингибиторы образования КПГ [48]. Zhang et al. также сообщали о более высоком антигликировании EAF экстракта листьев Liquidambar formosana Hance. [31] по сравнению с его дихлорметановой, н-бутанольной и водной фракциями.

Как показано в Таблице 5, ингибирование КПГ тесно связано положительным образом с обоими ТФ(r=0,950;p<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">

r=0.914, r=0.983, r=0.975, r=0.923 и r=0.963 (p<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">удаление свободных радикалова такжеантиоксидантемкости.

2.7.3. Влияние на окисление белков, вызванное гликированием

Гликирование белков (реакция Майяра) представляет собой реакцию, начинающуюся с ковалентного присоединения восстанавливающего сахара к аминогруппе белков (в основном остатков лизина и аргинина), что приводит к образованию нестабильного и обратимого продукта, т. е. основания Шиффа, которое далее подвергается перегруппировке Амадори. для образования более стабильного кетамина, называемого продуктами Амадори. Впоследствии продукты Амадори подвергаются реакции ендиола с образованием карбонилированных белков [48]. Деградация этого кетамина может привести ксвободные радикалытакие как радикалы супероксида, которые далее превращаются в HO·благодаря реакции Фентона, вызывая окислительное и клеточное повреждение [49].

Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >ВЧ.

Влияние CEE/фракций на вызванное гликированием окисление тиолов белка представлено на рисунке 3D. В нативном БСА уровень тиола белка составил 1,06± 0,086 нмоль/мг белка, что было снижено более чем в 3 раза(0 0,34±0,021 нмоль/мг белка) в гликированном белке. В присутствии CEE/фракций уровень тиоловой группы значительно увеличивался дозозависимым образом в диапазоне от 0,1 до 1 мг/мл. При этом уровень белкового тиола увеличивался в следующем порядке: HF<><><><>

Аналогичные результаты наблюдались в растении Teucrium polium, поскольку EAF был более эффективен, чем другие фракции (фракции диэтилового эфира и воды) против опосредованного гликированием окисления белков [51]. В своем исследовании Гольшахи и Бахрамикия [52] также сообщили об аналогичных результатах при использовании нескольких растворителей с возрастающей полярностью (диэтиловый эфир и вода) при расщеплении лекарственного растения Trachyspermum copticum. По мнению этих авторов, EAF обладает наиболее мощным защитным эффектом против окисления белков, опосредованного гликированием, за ним следуют диэтиловый эфир и вода. Это свидетельствует о наличии в EAF таких соединений, которые могут обладать профилактическим действием против индуцированных гипергликемией окислительных повреждений белка, которые, как полагают, происходят в процессах гликооксидации за счет уменьшения образования карбонила белка и защиты тиолов белка от окисления, как предполагают данные.

2.8.Идентифицированные фенольные соединения в ЭДП

ЭАФ, проявившая наибольшую биологическую активность среди других фракций, была выбрана для идентификации ее основных биологически активных соединений методом ОФ-ВЭЖХ. Всего было идентифицировано шесть соединений путем сравнения их времени удерживания со временем удерживания эталонных стандартов. Идентифицированные фенольные соединения представлены на рис. 4. Галловая, ванилиновая, кофейная и феруловая кислоты были идентифицированы как фенольные кислоты, тогда как только два соединения, а именно рутин и кверцетин, были идентифицированы как флавоноиды. Согласно исследованию Soumaya et al. [53], феруловая кислота, лютеолин-7-O-глюкозид, мирицетин и кемпферол3-O-рутинозид были идентифицированы как присутствующие в EAF надземных частей тунисского E.fragilis, тогда как присутствие рутина , кверцетин, галловая кислота и кофеиновая кислота были обнаружены в нашем исследовании впервые. Различия в химическом составе ЭДП, полученных из одного и того же вида растений, могут различаться в зависимости от частей растения, стадии развития растения, условий роста (например, почвы, света, температуры, воды, влажности и удобрений), время сбора урожая, система сушки и процедура экстракции [54]. Полученные результаты фитохимического профиля отпечатков пальцев показали большое количество E.fragilis, которые содержали несколько фенольных соединений, которые считаются основными участниками нейтрализации свободных радикалов и антиоксидантной активности [55]. Кроме того, эти соединения известны своими мощными антигликационными способностями [48]. Несколько исследований выявили прямую связь между антиоксидантной активностью фенольных соединений и их антигликационными способностями.

2.9. Изучение молекулярного докинга идентифицированных соединений

Чтобы четко представить подробный механизм, с помощью которого идентифицированные соединения в EAF E. fragilis связываются с BSA и RAGE, мы провели исследование молекулярного докинга. Результаты докинга представлены в таблице 6, а взаимодействия между наиболее активным соединением и мишенями показаны на рисунке 5. Результаты показали, что кверцетин плотно прилегает к сайту связывания, расположенному в гидрофобной полости субдомена IB БСА с наименьшей энергией связывания { {2}},7 ккал/моль (рис. 5А). Напротив, меньшая энергия связывания была получена с феруловой кислотой, ванилиновой кислотой, кофейной кислотой, галловой кислотой и рутином (-6,35, {{7} },05, -5,84, -5,25 и -4,41 ккал/моль соответственно). Обычно высокая степень отрицательности энергии связи более эффективна, и соединение можно использовать для контроля процессов гликирования. Из рисунка 5B видно, что кверцетин образует восемь водородных связей с SER109, ASP111, LEU112, LEU115, ARG144, ARG185 и ARG458 BSA и четыре гидрофобных взаимодействия, опосредованных алифатическими аминокислотами (PRO110, PRO113, LYS114 и ARG144). . Кроме того, четыре аминокислоты (ASP108, HIS145, LEU189 и LEU462), окружающие кверцетин, взаимодействовали посредством сил Ван-дер-Ваальса. Сообщалось, что лизин и аргинин являются основными аминокислотными остатками, участвующими в процессе гликирования [56]. Следовательно, маскировка кверцетина остатками лизина и аргинина может быть одним из возможных механизмов E. fragilis для ингибирования гликирования белков на начальной стадии.

Взаимодействие продуктов КПГ с RAGE, как известно, через образование АФК через НАДФН-оксидазу и митохондрии [57] запускает активацию множественных внутриклеточных сигнальных путей (включая JAK/STAT, фосфоинозитол-3киназу, ро-ГТФазы, SAPK/INK MAP-киназы, p38 и erk1/2 (p44/p42) MAP-киназы), и завершающиеся активацией факторов транскрипции NF-kB [58], что приводит к патогенезу диабета и связанных со старением заболеваний [5]. Следовательно, блокирование взаимодействий AGEs-RAGE может подавлять передачу сигналов, провоцирующих стресс, что считается терапевтической стратегией ингибирования гликирования на более поздних стадиях. Результаты стыковки с RAGE, как показано в таблице 6, доказали, что галловая кислота имеет самый высокий показатель стыковки (G=-6,8 ккал/моль) по сравнению с таковыми для ванилиновой кислоты, феруловой кислоты, кофейной кислоты, кверцетина и рутин (-6,68, -5,94, -5,89, -5,58 и -4,89 ккал/моль соответственно). Кроме того, 2D-моделирование галловой кислоты и RAGE показало, что галловая кислота образует пять обычных водородных связей с CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 и SER83 RAGE (рис. 5C, D). Кроме того, LYS37 и LYS43 отвечали за гидрофобные взаимодействия галловой кислоты с RAGE. Пять аминокислот, окружающих галловую кислоту (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81 и GLY82), были присоединены силами Ван-дер-Ваальса, тем самым стабилизировав комплекс галловая кислота-RAGE, создав прочную когезионную среду. Таким образом, текущее исследование показало эффективное взаимодействие некоторых биоактивных соединений в EAF E. fragilis с белками-мишенями BSA и RAGE. E.fragilis может быть источником потенциальных конкурентов глюкозы и КПГ, которые могут сопротивляться их действию. связывание с BSA и RAGE соответственно и, следовательно, снижение последующего развития окислительного стресса и воспаления (рис. 6).

3. Материалы и методы

3.1. Химикаты и реагенты

22-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS), бутилированный гидрокситолуол (BHT), азид натрия, гидрохлорид гуанидина, твин-40,1,{ {7}}дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH), реагент Фолина-Чокальто, -каротин, линолевая кислота, глюкоза, 2,4-динитрофенилгидразин (DNPH), 5,5'-дитиобис-({{16 }}Нитробензойная кислота) (DTNB), молибдат аммония и стандарты полифенолов были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Перекись водорода (H2O2) была приобретена у Fluka (Базель, Швейцария). Хлорид алюминия (AICl3), карбонат натрия (NazCO3), хлорид железа (FeCl3), персульфат калия (K2S2Os), феррицианид калия (K3Fe(CN)6), серная кислота и все растворители были получены от Merck Life Science (Дармштадт, Германия). ). Аскорбиновую кислоту и трихлоруксусную кислоту (ТХУ) получали от Scharlau (Барселона, Испания).

3.2. Растительные материалы

E. fragilis (надземные части) был собран в Дур-Лагфифат, Улад-Тейма, Тарудант, Марокко (3 0 градуса 24'0" северной широты; долгота, 9 градусов 12'36" западной долготы) в мае 2019 года. был идентифицирован профессором Нажатом ЭЛЬХИАТИ, ботаником из нашего института, где хранилась коллекция ваучерных экземпляров. Растение промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе, измельчали ​​в блендере и хранили при 49°С до использования.

3.3.Экспериментальный план

3.3.1.Выбор переменных

Известно, что многие параметры оказывают значительное влияние на экстракцию фенольных соединений, например, тип растворителя, концентрация растворителя, время экстракции и температура экстракции [59]. Различные растворители, такие как ацетон, метанол и этанол, подходят для экстракции различных фенольных соединений [16], но в этом исследовании в качестве растворителя был выбран этанол из-за его пищевой безопасности и экологически чистого производства [60]. Поэтому все факторы, включая концентрацию этанола (X), температуру экстракции (X2) и время экстракции (X3), были выбраны в качестве переменных.

3.3.2. BBD для оптимизации извлечения

Процедура оптимизации была разработана с использованием RSM для определения влияния факторов экстракции и выбора оптимальных экспериментальных условий экстракции фенольного соединения E. fragilis. Был предпринят трехуровневый трехфакторный BBD для исследования влияния трех независимых факторов, включая X1 (концентрация этанола, процент), X (температура экстракции, градус) и X3 (время экстракции, ч) на содержание TP и TF. экстрактов E, fragilis [17]. В целях оптимизации в случайном порядке было проведено 15 испытаний, включая три центральные точки (таблица 1). На основе нашего предварительного однофакторного эксперимента (данные не показаны) все переменные были установлены на трех уровнях (-1, 0 и плюс 1), с X, (40, 60 и 80 процентов), X ,(25, 42,5 и 60 градусов), и X3(6, 15 и 24 ч) (табл. 1). Следующее полиномиальное уравнение второго порядка (уравнение (1)) использовалось для подбора переменных отклика:

где Y — прогнозируемый отклик; о, ; я и ; — коэффициенты регрессии для отрезка, линейного, квадратичного и взаимодействующего членов соответственно; и Х;, и Х; — независимые переменные (i ≠ j).

3.3.3. Процедура извлечения

Порошкообразный образец (10 г) экстрагировали методом мацерации в расчетной концентрации этанола (40-80 процентов; 1:10, вес/объем) при различных температурах (25-60 градусов) в течение различных периодов времени ({ {5}} ч) на орбитальном шейкере-инкубаторе (160 об/мин). Для удаления нерастворимой массы использовали марлю и фильтровальную бумагу Whatman №1. Затем фильтрат сушили при 40°С при низком давлении с использованием R-3 Rotavapor (Büchi) с получением неочищенного этанольного экстракта (СЕЕ).

3.4. Фракционирование CEE, полученное в оптимальных условиях

Полученный в оптимальных условиях КЭЭ солюбилизировали в дистиллированной воде (100 мл) и проводили жидкостно-жидкостную экстракцию различными растворителями возрастающей полярности с получением гексановой фракции (HF, 3×100 мл), дихлорметановой фракции (ДМФА, 3×100 мл). мл), этилацетатная фракция (EAF.3×100 мл), водонасыщенная фракция н-бутанола (WBF, 3×100 мл),

и оставшаяся водная фракция (WF). Эти фракции затем фильтровали и сушили, как описано выше, и выход экстракции регистрировали в соответствии с уравнением (2):

где Wo и W – масса высушенных ЦЭЭ/фракций и исходная масса порошка E.fragilis; соответственно.

3.5. Фитохимический анализ

Спектрофотометрические методы, используемые для оценки фитохимического содержания экстрактов E. fragilis, подробно описаны в дополнительных материалах [61,62].

3.6. Биологическая активность

Подробная информация об антиоксидантной [43,63-67] и антигликирующей активности [68-70] тестов in vitro приведена в дополнительных материалах.

3.7. Анализ EAF с ОФ-ВЭЖХ

Анализ фенольных соединений в ЭДП проводили с помощью Agilent 1100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), оснащенного обращенно-фазовой аналитической колонкой ZORBAX Eclipse SB-C18 100×4 мм и 3,5 мкм. размер частиц [71]. Температуру колонки поддерживали постоянной на уровне 48 градусов. Изократическое элюирование ацетонитрилом, 0,1% раствором уксусной кислоты в воде (12:88, об./об.) в качестве подвижной фазы и скоростью потока 1 мл/мин обеспечивало хорошее разделение полифенолов в ЭДП E.fragilis. Вводимый объем составлял 10 мкл, хроматограммы измеряли при 330 нм. Время удерживания фенольных соединений в ЭДП сравнивали со временем удерживания чисто доступных стандартов для их идентификации.

3.8. Молекулярная стыковка

AutoDock Tools (ADT) версии 1.5.6 использовали для проведения исследования молекулярного докинга. Формат SDF всех соединений был получен из базы данных PubChem, а затем преобразован в файл 3Dpdb с использованием графического интерфейса Open Babel (версия 2.4.1). Кристаллические структуры BSA (идентификатор PDB: 4ORO) и RAGE (идентификатор PDB: 4LP5) были взяты из банка данных белков RCSB (PDB). Вкратце, белки были сначала подготовлены для докинга путем (i) удаления всех гетероатомов и молекул воды, (i) добавления полярных атомов водорода и (ii) присвоения коллмановских зарядов. Размер поля сетки был установлен на x{{10}},y=126,z=126 и x=80,y=80.Z{{ 15}} с центром сетки ×=8,415,y=21,626,z=106,57 и x=37,98,y=-43,581 ,z=9.371 с шагом сетки 0,375A, созданным вокруг сайта связывания BSA и RAGE соответственно. Программное обеспечение для стыковки было запущено 100 раз с использованием ламарковского генетического алгоритма (LGA), чтобы найти наилучшую позу для связывания. Лиганд с наименьшей энергией связи был выбран для дальнейшего исследования. Программное обеспечение Discovery Studio версии 2020 (BIOVIA, Сан-Диего, Калифорния, США) использовалось для визуализации результатов стыковки.

3.9. Статистический анализ

Программное обеспечение Design-Expert версии 119 (Stat-Ease Inc. и Миннеаполис, Миннесота, США) использовалось для выполнения RSM. Анализ данных был выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Дункана с использованием SPSS 26.0(IBM Co., США);p<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">

4. Выводы

RSM с ​​BBD использовали для настройки оптимизированных параметров экстракции биоактивных соединений из марокканской лекарственной травы E. fragilis. Были рассчитаны оптимальная концентрация этанола, температура и время экстракции для максимального

выход экстракции фенольных соединений и составил 61,93%, 44,43°С и 15,84 ч соответственно. Полученный в оптимальных условиях экстракции КЭЭ и его различные фракции анализировали на содержание в них ТП и ТФ, а также ихантиоксиданти антигликационная активность. Фракция EAF показывает самое высокое содержание TP и TF и ​​самую сильную антиоксидантную активность по сравнению с другими фракциями. Кроме того, оценка нескольких биомаркеров, таких как спектр поглощения в УФ-видимой области, флуоресценция специфических КПГ, содержание карбонила и группа свободных тиолов, показала наибольший защитный эффект ЭАФ против гликирования, опосредованного глюкозой. Кроме того, наблюдалась значительная положительная связь между антиоксидантными способностями фенольных соединений и их антигликационной активностью. Это указывает на то, что фенольные соединения могут быть основными преобладающими компонентами, ответственными как за антиоксидантную, так и за антигликационную активность. Биологически активные соединения в EAF были охарактеризованы с помощью анализа ОФ-ВЭЖХ, и было идентифицировано в общей сложности шесть соединений. Анализ молекулярной стыковки in silico также показал эффективное взаимодействие кверцетина и галловой кислоты с BSA и RAGE в качестве белков-мишеней соответственно. В совокупности это исследование предполагает, что E.fragilis может быть потенциальным источником природных биоактивных соединений с мощной антиоксидантной и антигликационной активностью и должен применяться для лечения и профилактики старения и осложнений, связанных с гликированием. Необходимо провести дальнейшие исследования по выделению биоактивных соединений и фармакологическому скринингу (например, изучение цитотоксичности) для изучения фитохимии и механизмов действия фармакологических свойств E. fragilis.

использованная литература

1. Мартинс, Н.; Баррос, Л.; Сантос-Буэльга, К.; Сильва, С .; Энрикес, М .; Феррейра, ICFR Отвар, настой и водно-спиртовой экстракт культивируемого тимьяна: антиоксидантная и антибактериальная активность и фенольная характеристика. Пищевая хим. 2015, 167, 131–137. [Перекрестная ссылка]

2. Дитае, П.; Паричанон, П.; Тракунливатхана, П.; Чансиетис, К.; Лерцири, С. Антиоксидантные и антигликационные свойства тайских травяных чаев по сравнению с обычными чаями. Пищевая хим. 2012, 133, 953–959. [Перекрестная ссылка]

3. Яо, К.; Лян, Ю .; Шао, Ю.; Биан, В .; Фу, Х .; Сюй, Дж.; Суй, Л.; Яо, Б.; Ли, М. Концентрации конечных продуктов гликирования в фолликулярной жидкости женщин, подвергающихся ЭКО/ИКСИ с использованием протокола агонистов ГнРГ. Воспр. Биомед. Онлайн 2018, 36, 20–25. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

4. Гримм, С.; Отт, К.; Хёрлахер, М.; Вебер, Д.; Хён, А .; Grune, T. Формирование иммунопротеасом, индуцированное конечным продуктом повышенного гликозилирования: участие RAGE и Jak2/STAT1. Биохим. Дж. 2012, 448, 127–139. [Перекрестная ссылка]

5. Минатчи, П.; Пурушотаман, А .; Maneemegalai, S. Антиоксидантные, антигликационные и инсулинотропные свойства Coccinia grandis (L.) in vitro: возможная роль в профилактике диабетических осложнений. Дж. Традит. Дополнение. Мед. 2017, 7, 54–64. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

6. Накагава Т.; Ёкодзава, Т .; Терасава, К .; Шу, С .; Джунжа, Л.Р. Защитная активность зеленого чая против повреждения белков, опосредованного свободными радикалами и глюкозой. Дж. Агрик. Пищевая хим. 2002, 50, 2418–2422. [Перекрестная ссылка] [PubMed]