Часть 2. Молекула повреждения почек-1 является потенциальным рецептором для SARS-CoV-2

Для получения дополнительной информации. контактtina.xiang@wecistanche.com

Клинические проявления коронавируса

1. Инкубационный период длительный, основными симптомами являются лихорадка, утомляемость, боль в горле и кашель. Лихорадка может быть высокой, умеренной или низкой;

2. У грудных детей и пожилых людей не характерны и часто сопровождаются хрипами и одышкой. В тяжелых случаях может произойти мультисистемное повреждение;

3. Сухой кашель в начальной стадии в основном приступообразный и сильный, похожий на коклюш, который влияет на сон и активность; в поздней стадии кашель мокротный, мокрота злобная, изредка содержит небольшое количество крови, иногда сопровождается хрипами;

4. Некоторые пациенты имеют легкие симптомы и могут не иметь лихорадки. У большинства пациентов прогноз благоприятный, а небольшое количество пациентов находится в критическом состоянии или даже умирает;

5. Острый респираторный дистресс-синдром, септический шок, рефрактерный метаболический ацидоз и нарушение свертывания крови.

Как предотвратить новый коронавирус, повышение собственного иммунитета – самое эффективное для людей средство борьбы с вирусом. Цистанхе, которая с древних времен использовалась как питательное сокровище, известна как «пустыняженьшень" и является королем повышения иммунитета. Цистанхе - король повышения иммунитета

Современные медицинские исследования доказали, что помимо функций питания и укрепления организма, цистанхе обладает значительным целебным действием в отношении предотвращения опухолей, омоложения, антиаритмии, ингибирования апоптоза и повышения иммунитета. услуга.

общие глюкозиды Цистанхеявляются активными компонентами женьшеня для регулирования иммунной функции, что может улучшить иммунную функцию не только у нормальных людей, но и у людей с низкой иммунной функцией.

Клиническое наблюдение подтвердило, что Цистанхе оказывает определенное лечебное действие на злокачественные опухоли и имеет очевидный эффект повышения лейкоцитов. Прием женьшеня во время лучевой и химиотерапии может уменьшить токсические и побочные эффекты лучевой и химиотерапии, ускорить восстановление поврежденных тканей и предотвратить лейкопению;

Обсуждение

Для борьбы спандемия COVID-19, глубокое понимание того, какSARS-CoV-2проникает в клетки человека. Исследования показали прямое заражение SARS-CoV-2 впочкав дополнение к легкому (Braun et al., 2020; Farkash et al., 2020). Однако ACE2 остается единственным хорошо известным рецептором, который может опосредовать эту инвазию. Кроме того, почечный тропизм SARS-CoV-2 и связанные с нимповреждение почеккажутся необъяснимыми из-за относительно сниженного уровня ACE2 при вирусной инвазии (Kuba et al., 2005). Здесь наше исследование предполагает, что KIM1, биомаркер повреждения почек с резко усиленной регуляцией (Yang et al., 2015), опосредует инвазию SARS-CoV-2 в почки в качестве рецептора.

Мы также обнаружили, что SARS-CoV-2-RBD связывается с KIM1 с более высокой аффинностью, чем SARS-CoV-RBD и MERS-COV-RBD, что, вероятно, лежит в основе более сильного заражения SARS-CoV-2 (Рабаан и др., 2020 г.); следовательно, стоит пересмотреть почечную инфекцию и роль KIM1 в этих тяжелых респираторных заболеваниях. Примечательно, что наши результаты предполагают разные сайты связывания KIM1 и ACE2 на вирусных RBD, поэтому стоит изучить, опосредуют ли и каким образом KIM1 и ACE2 инвазию SARS-CoV-2 в эти органы. Кроме того, поскольку KIM1 подвергается эндоцитозу посредством клатрин-зависимых путей (Zhao et al., 2016), также было бы интересно продолжить изучение KIM1-зависимого процесса после прикрепления вируса к клеточной мембране.

ACE2 является наиболее хорошо изученным рецептором для SARS-CoV-2, однако он не является идеальной терапевтической мишенью для COVID-19, поскольку он широко экспрессируется во многих органах и играет решающую роль в регулировании артериального давления. и предотвращение повреждения сердца/почек (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). Напротив, KIM1 имеет более сильную связь с функцией почек и сильно экспрессируется только послепочечная травма(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda and Kaplan, 2018), что делает его более конкретной и, возможно, более безопасной терапевтической мишенью для пациентов с COVID-19 с заболеваниями почек.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о решающей роли KIM1 в почечном тропизме SARS-CoV-2 в качестве потенциального рецептора для SARS-CoV-2. Здесь мы предлагаем модель «порочного цикла», опосредованного KIM1 и ACE2 (рис. 5G), которая может объяснить почечный тропизм SARS-CoV-2 у пациентов с COVID-19. На начальной стадии инвазии SARS-CoV-2 более высокий физиологический уровень (дополнительный рисунок S1) и аффинность связывания (дополнительная таблица S1) делают ACE2 основной мишенью, которая не специфична для почек. Однако после появления вирус-индуцированной AK1 результирующий резко активизированный KIM1 быстро способствует вторичной вирусной инфекции, опосредованной KIM1 и ACE2, которая более специфична для почек и, следовательно, усугубляет повреждение почек в порочном круге (рис. 5G). Подходы, которые могут нарушить взаимодействие между SARS-CoV-2 и KIM1, включая антитела против KIM1, низкомолекулярные ингибиторы и пептиды-антагонисты, производные от KIM1-, могут пролить свет на COVID-19 лечение.

материалы и методы

Материалы

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 процентов) были химически синтезированы компанией Genscript. Антитело против мышиного IgG (p/n 18-8816-33) и антитело против кроличьего IgG (p/n 18-8817-33) были получены от Rockland. IgG с магнитными гранулами Protein G от SureBeads (J2112LB-02) был приобретен у Bio-Rad. DAPI (D9542) был получен от Sigma. Фаллоидин, меченый Alex Flour 594 (C2205S), был получен от Beyotimes. Антитела против KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) и ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).

Приобретение и анализ профилей экспрессии KIM1 и ACE2

Чтобы получить исчерпывающие профили транскриптома и белков KIM1 и ACE2 для тканей человека, мы собрали и проанализировали данные транскриптома и профили белков на основе иммуногистохимии из Атласа белков человека (HPA, https://www.proteinatlas.org), который показал экспрессия и локализация белков человека в тканях и органах на основе глубокого секвенирования РНК (RNA-seq) из 37 нормальных тканей и иммуногистохимии на тканевых микроматрицах, содержащих 44 типа тканей (Uhlen et al., 2015). HPA RNA-seq ткани гена, кодирующего белок, регистрировали как среднее число транскриптов, кодирующих белок, на миллион (pTPM), соответствующее средним значениям образцов из каждой ткани. Уровни экспрессии белка на основе гистологии анализировали вручную по четырем уровням (не обнаружено, низкий, средний и высокий). На дополнительном рисунке S1 перечислены 10 верхних уровней тканевой транскрипции и уровни экспрессии белка KIM1 и ACE2, основанные на гистологии, соответственно, а также обобщен профиль перекрывающейся экспрессии KIM1 и ACE2.

Моделирование молекулярной стыковки и динамики

Докинги проводились через Z-Dock (http://zdock.umassmed.edu/). Кристаллические структуры SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) и KIM1 Ig Домен V (PDB ID 5DZO) использовали для поиска потенциальных моделей связывания. Белковые комплексы с лучшими оценками были отобраны для следующих молекулярно-динамических симуляций, которые были проведены сервером Desmond и проанализированы Pymol2.3 и Maestro11.8.012. Для изучения динамических параметров белковых комплексов применялась 50-нс симуляционная диаграмма динамики. . Свободная энергия связывания MM-GBSA была рассчитана с помощью HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Среднеквадратичное отклонение (RMSD) и среднеквадратичное отклонение (RMSF)

RMSD использовался для оценки среднего изменения смещения выбранных атомов для конкретной рамки, как описано (Li et al., 2011). RMSF был проведен для изучения изменений смещения в белковой цепи (Li et al., 2011). .

Модели мышей с ОПП и количественная ПЦР

I / R-повреждение было выполнено на мышах C57BL / 6, как мы описали ранее (Chen et al, 2015, 2017). При ОПП, вызванной цисплатином, 30 мг/кг массы тела цисплатина вводили внутрибрюшинно 8-самцам мышей 8-недельного возраста, а через 3 дня мышей умерщвляли. Образцы крови и почек были собраны для дальнейшего анализа, с n=4 для каждой экспериментальной группы животных. Тотальную РНК выделяли из почек с помощью RNAiso Plus (TaKaRa) и подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием системы синтеза первой цепи M-MLV (Invitrogen). Обилие специфических транскриптов генов оценивали с помощью количественной ПЦР. Предоставлены праймеры, использованные в исследовании (дополнительная таблица S4).

Конструкты

Плазмиды млекопитающих для экспрессии KIM1 человека, KIM1 Ig V (остатки KIM1 aa 20-127), KIM1 △lg V (усеченный KIM1 без остатков aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(остатки SARS-CoV-2-S aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP и TIM4-YFP были построены. Продукты ПЦР-амплификации соответствующих фрагментов кДНК клонировали в вектор на основе промотора pRK, содержащий метку HA или FLAG. Плазмиды, связанные с SARS-CoV-2-, были любезно подарены доктором PHWang из Шаньдунского университета.

Культура клеток и трансфекция

Линию клеток канальцев почек человека HK-2 (полученную из Китайского центра коллекции типовых культур) культивировали в среде DMEM/F12 (Hyclone), содержащей 17,5 мМ глюкозы и 10% фетальной бычьей сыворотки. Чтобы оценить воздействие SARS-CoV-2 на клетки, клетки HK-2 трансфицировали плазмидами SARS-CoV-2-S и SARS-CoV-2-RBD, а затем собрали для дальнейшее обнаружение.

Совместная интеллектуальная собственность

Указанные клетки HK-2/HEK293T (1×10) лизировали в 1 мл буфера для предварительного лизиса (25 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ ЭДТА, 5 процент глицерина), который разработан для анализов пулдауна и IP, а также в качестве промывочного буфера для гранул. Для IP клеточный лизат подвергали иммунопреципитации с указанным антителом или соответствующим gG с помощью магнитных шариков SureBeadsTM Protein G в течение ночи при 4°C. После промывки буфером для предварительного лизиса, содержащим 500 мМ NaCl, гранулы кипятили в загрузочном буфере и подвергали иммуноблотингу (Wan et al., 2017).

FRET анализ

Внутриклеточное взаимодействие между KIM1 и SARS-CoV-2-RBD было обнаружено с помощью стандартного анализа на основе FRET (Karpova and McNally, 2006) с использованием KIM1-CFP и SARS-CoV-2-RBD-YFP. . Вкратце, экспрессионные плазмиды млекопитающих, экспрессирующие KIM1-CFP или KIM1 Alg V-CFP, котрансфицировали SARS-CoV-2-RBD-YFP в -293Т-клетки. Для обнаружения с помощью флуоресцентного спектрофотометра клетки собирали и лизировали через 24 часа после трансфекции, а лизат определяли с помощью флуоресцентного спектрофотометра F-2700 (Hitachi) с помощью сканирования по длине волны (500-600 нм) и сканирования по времени (435 /527 нм, возбуждение/испускание). Для конфокального обнаружения клетки визуализировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP8 под мощным объективом (40×) (канал CFP: 435/485 нм, возбуждение/испускание; канал YFP : 485/527 нм, возбуждение/испускание; канал FRET: 435/527 нм, возбуждение/излучение) (Li et al, 2020b). Котрансфекция неконъюгированных CFP и YFP была включена в качестве отрицательного контроля, как описано (Karpova and McNally, 2006). Взаимодействие между KIM1 и его лигандом TIM4 было обнаружено с помощью анализа FRET в качестве положительного контроля (Rong et al, 2011).

CRISPR-Cas9-опосредованное нокаутирование KIM1

Протоколы на основе CRISPR-Cas9-для инженерии генома использовались, как описано (Zhang et al., 2017). Приведены целевые последовательности направляющей РНК для KIM1 (дополнительная таблица S4).

Маркировка FITC и конфокальная микроскопия

Метку FITC выполняли, как мы описали ранее (Li et al., 2020b; Zhang et al., 2020). Вкратце, SARS-CoV-2-RBD инкубировали с FITC (молярное соотношение 1:5) в течение ночи, а затем добавляли 5 мМ NHCl, чтобы остановить реакцию и погасить непрореагировавший FITC. Раствор дважды диализовали и лиофилизировали для дальнейшего использования.

Клетки HEK293T (5×109) или клетки HK-2 (1×107) инкубировали со свободным FITC или FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 мкг/мл для 2. Для анализа интернализации на основе пептидов AP1 или AP2 (50 мкМ) добавляли совместно с FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 мкг/м). После фиксации 4-процентным (вес/объем) формальдегидом клеточные мембраны окрашивали фаллоидином, меченым Alex Flour 594 (2 мкг/мл), а ядра окрашивали DAPI (1 мкг/м), а затем визуализировали с помощью Leica TCS. Конфокальный микроскоп СП8. Для каждой группы в оценку включали не менее 100 клеток из пяти полей зрения под объективом с большим увеличением (64×). Были представлены репрезентативные изображения. Количественная оценка изображений была проведена ImageJ1.8.0.

Анализы жизнеспособности клеток

Клетки высевали по 3000-4000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. При 80-процентном слиянии клетки, инкубированные с SARS-CoV-2-RBD (100 мкг/мл), обрабатывали AP1 или AP2 (10, 50, 100 мкМ) или без них. После этого в каждый раствор добавляли 10 мкл МТТ (5 мг/мл).

лунок в течение 4 часов, среду удаляли и добавляли ДМСО. Поглощение, измеренное при 490 нм, нормализовали для соответствующей контрольной группы.

статистический анализ

Данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. Достоверные различия оценивали по двустороннему критерию Стьюдента. Двустороннее P-значение<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">