PGC-1 ингибирует инфламмасому NLRP3, сохраняя жизнеспособность митохондрий и защищая фиброз почек
Dec 15, 2023
ВВЕДЕНИЕ
Хроническая болезнь почек(ХБП) является глобальной проблемой здравоохранения, и ее распространенность растет во всем мире [1–3].Пациенты с ХБПимеют повышенный риск прогрессирования до терминальной стадии заболевания почек и смертности [4, 5]. Поэтому важно найти эффективные терапевтические цели для предотвращенияпрогрессирование ХБП. Почечная тубулоинтерстициальнаявоспаление и фиброзявляются ключевыми патологическими признакамипрогрессирование ХБП[6–8]. Эпителиальные клетки почечных канальцев(RTEC) необходимы для поддержания гомеостаза жидкости и электролитов и составляют 90% массы почек. RTECs обеспечивают обилие митохондрий и имеют высокие уровни пероксисомального рецептора, активирующего пролифератор (PPAR) и пероксисомального пролифератора-коактиватора-1 (PGC-1) для удовлетворения своих метаболических и функциональных энергетических потребностей [9]. Все больше данных свидетельствует о том, что митохондриальная дисфункция, характеризующаяся уменьшением количества, а также деполяризацией, набуханием и разрушением крист, в значительной степени способствует фиброзу почек [10, 11]. Поврежденные митохондрии не производят эффективно аденозинтрифосфат (АТФ) и выделяют избыточное количествоактивные формы кислорода(АФК) и митохондриальной ДНК (мтДНК), которые, следовательно, запускают нижестоящие воспалительные реакции и приводят к гибели клеток и повреждению канальцев.
Семейство NOD-подобных рецепторов, содержащее пириновый домен 3 (NLRP3), участвует в различных врожденных иммунных ответах хозяина на микробные и немикробные стимулы [12, 13]. Некоторые патогены и эндогенные сигналы опасности, выделяемые поврежденными и умирающими клетками, активируют NLRP3 и приводят к образованию белкового комплекса, называемого «воспаление» [14]. Затем воспаление NLRP3 индуцирует автопроцессинг и активацию каспазы-1, что приводит к расщеплению процитокинов с образованием IL-1 и IL-18. Недавно воспаление NLRP3 было вовлечено в патогенез повреждения почек и фиброза [15–17]. В различных моделях заболеваний почек на животных активируется воспалительный путь NLRP3, и его конечные продукты, IL-1 и IL-18, могут вызывать повреждение почечных канальцев [16–19]. Интересно, что внутренние клетки почек, такие как RTECs и подоциты, экспрессируют NLRP3, что указывает на потенциальную роль передачи сигналов воспаления NLRP3 при клеточном повреждении [20, 21]. Более того, недавние исследования продемонстрировали потенциальное взаимодействие между митохондриальной дисфункцией и активацией воспаления NLRP3 на моделях повреждения почечных канальцев [22–24]. Однако неизвестно, может ли PGC-1, ключевой регулятор митохондриального биогенеза, регулировать путь NLRP3 посредством модуляции митохондриальной динамики.
Таким образом, мы исследовали роль PGC-1 в регуляции активации воспалительной сомы NLRP3 в RTEC. В частности, мы исследовали, могут ли измененные жизнеспособность и динамика митохондрий, вызванные активацией или подавлением PGC-1, регулировать воспалительный путь NLRP3 и, таким образом,влияют на повреждение почек.
Служба поддержки Wecistanche-крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:
Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Телефон:+86 15292862950
Магазин для получения дополнительных технических характеристик:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
ПОЛУЧИТЕ НАТУРАЛЬНЫЙ ОРГАНИЧЕСКИЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНШИ С 25% ЭХИНАКОЗИДОМ И 9% АКТЕОЗИДОМ ПРИ ИНФЕКЦИИ ПОЧЕК
МЕТОДЫ
Клеточные культуры, обработка TGF- 1, активатором PGC-1 и трансфекция первичными RTEC. RTEC были выделены из мышей C57BL/6. Краткий метод описан в дополнительных методах. Субконфлюэнтные RTEC ограничивали FBS в течение 24 часов, а затем среду заменяли на 1% среду FBS DMEM для контрольной группы и ту же среду с TGF- 1 (5 нг/мл) (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота). , США) для группы TGF- 1. RTEC собирали для анализа РНК и белков через 48 часов после смены среды. Активатор PGC-1, метформин (1 мМ) обрабатывали как контрольной группой, так и группой TGF- 1. Дозы препарата были определены на основе наших предыдущих тестов. Кроме того, клетки также трансфицировали плазмидой Ppargc1a (1 мкг) (Addgene, Кембридж, Массачусетс, США) и малой интерферирующей РНК (миРНК) Ppargc1a с использованием реагентов Lipofectamine 2000 и Plus (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Затем, через 6 часов после трансфекции, среду заменяли на бессывороточную среду и клетки инкубировали еще 48 часов. Чтобы ингибировать экспрессию Drp1, мы нокаутировали ген Drp1 с помощью лентивируса, содержащего Drp1, нацеленного на короткую шпилечную РНК (shRNA) для заражения RTEC (любезно предоставленного доктором Ю Дж., Медицинский колледж Университета Йонсей) [25]. Для дальнейшего изучения связи между воспалением NLRP3 и повреждением митохондрий мы также получили RTEC от мышей с нокаутом Nlrp3 (любезно предоставленных доктором Ю Дж., Медицинский колледж Университета Йонсей).
Исследование и лечение животных
Мыши-самцы C57BL/6 (возраст 6 недель, первоначальный вес 20 г) были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США). Животных содержали в помещении с контролируемой температурой (22 градуса) при 12-часовом цикле света/темноты. Все животные были распределены случайным образом. Через неделю после прибытия животных разделили на две группы и кормили либо обычным рационом (ND; n=10), либо рационом с 0,2% аденина (Ade; n=10) в течение до 4 недель. Группам ND и Ade также ежедневно вводили внутрибрюшинную инъекцию метформина (250 мг/кг) за неделю до начала диеты. Через 4 недели применения ND или Ade животных умерщвляли и почки извлекали под анестезией Золетилом (10 мг/кг) (Вирбак, Каррос, Франция). Краткий метод подготовки мышей с односторонней обструкцией мочеточника (UUO) описан в дополнительных методах. Затем образцы почек немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 градусов до использования.
Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени, вестерн-блоттинг
Уровни транскриптов генов, включая Ppargc1a, воспалительный путь NLRP3, митохондриальную динамику, белок 3, индуцируемый фактором некроза опухоли (TNFAIP3), маркер окислительного стресса и профибротические маркеры, сравнивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Последовательности праймеров, использованные в этом исследовании, описаны в дополнительной таблице 1. Более подробные методы описаны в дополнительных методах. Уровни экспрессии белка PGC-1, воспалительного пути NLRP3, TNFAIP3, маркера окислительного стресса и профибротических маркеров исследовали с помощью вестерн-блот-анализа. Подробные методы и информация об антителах отдельно описаны в «Дополнительных методах».
Анализ сборки воспалительной сомы NLRP3
Чтобы определить олигомеризацию связанного с апоптозом спеклообразного белка, содержащего домен рекрутирования каспазы (ASC), был проведен анализ перекрестного связывания, опосредованный дисукцинимидилсубератом (DSS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), как описано. ранее [26]. Вкратце, RTECS и клетки из образцов ткани почек осаждали центрифугированием и лизировали в 0,5 мл лизирующем буфере, содержащем 20 мМ Hepes KOH, pH 7,5, 150 мМ KCl, 1% NP40, 0,1 мМ PMSF и коктейль ингибиторов протеаз на льду. Лизаты клеток центрифугировали при 6000 об/мин при 4 градусах в течение 10 мин. Осадки дважды промывали PBS и затем ресуспендировали в 500 мкл PBS. Ресуспендированные осадки сшивали свежим DSS (2 мМ) в течение 30 минут, а затем осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут. Сшитые осадки ресуспендировали в 30 мкл буфера для образцов SDS и фракционировали на 12% полиакриламидном геле SDS с последующим иммуноблоттингом с антителом ASC (Cell Signaling Technology, Массачусетс, США).
Измерение уровня окислительного стресса
Уровни окислительного стресса (малонового диальдегида [MDA]) измеряли в RTEC и тканях почек с использованием набора для анализа MDA (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США). 10 мг RTEC гомогенизировали на льду в 300 мкл лизирующего буфера MDA (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США), затем центрифугировали (13,000 × g, 10 мин) для удаления нерастворимых материалов. 10 мл плазмы смешивали с 500 мкл 42 мМ H2SO4 и 125 мкл раствора фосфорновольфрамовой кислоты при комнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугирования (13,000 × g, 3 мин) осадок ресуспендировали на льду со 100 мкл бидистиллированной H2O. Затем 200 мкл раствора и 600 мкл раствора 2-тиобарбитуровой кислоты инкубировали при 95 градусах в течение 60 минут перед охлаждением до комнатной температуры на ледяной бане в течение 10 минут. Интенсивность поглощения при 532 нм была пропорциональна уровню МДА.
Выделение митохондрий
RTEC фракционировали на цитозоль и митохондрии с использованием набора для выделения митохондрий (BioVision, Inc., Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя. Короче говоря, клетки собирали и промывали 10 мл ледяного PBS. Клетки центрифугировали при 600×g в течение 5 минут при 4 градусах и ресуспендировали в 1,0 мл 1× буфера для экстракции цитозоля. Гомогенизацию проводили на льду и центрифугировали при 1200×g в течение 10 мин при 4 градусах для удаления ядер и интактных клеток. Собранный супернатант центрифугировали при 10,000×g в течение 30 мин при 4 градусах. Полученные осадки ресуспендировали в 1,0 мл 1× буфера для экстракции цитозоля и центрифугировали при 10,000 × g в течение 30 минут при 4 градусах для получения митохондрий. Полученные митохондрии лизировали в 30 мкл митохондриального лизирующего буфера и добавляли к 100 мкл смеси ферментов (входит в комплект для выделения) со 100 мкл абсолютного этанола. После центрифугирования полученный осадок представлял собой мтДНК. Цитозольную мтДНК получали из супернатанта после осаждения этанолом. Концентрацию мтДНК определяли методом qPCR.
Оценка динамики и функции митохондрий
Для визуализации динамики митохондрий использовали иммунофлуоресцентное окрашивание митохондрий, MitoTracker Deep Red (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). RTEC фиксировали в 4% параформальдегиде и блокировали в DPBS, содержащем 5% нормальной кроличьей сыворотки и 0,1% твина- 20. Затем клетки окрашивали анти-мышиным NLRP3, MitoTracker, а затем конъюгированными с AlexaFluor594- козьими антикроличьими антителами (Jackson ImmunoResearch, Вест-Гроув, Пенсильвания), и, наконец, слайды монтировали с помощью DAPI и визуализировали. Затем мы исследовали структуру митохондрий с помощью стандартной просвечивающей электронной микроскопии. Первичные RTEC фиксировали смесью 2% параформальдегида и 2,5% глутаральдегида на ночь, промывали, обезвоживали и заключали в смолу по стандартным методикам. Митохондрии исследовали под микроскопом JEOL 1011 (JEOL, Токио, Япония). Для оценки скорости митохондриального дыхания использовали анализатор внеклеточного потока Seahorse Bioscience ×24 (Seahorse Bioscience, Биллерика, Массачусетс, США). Для измерения продукции митохондриальных АФК клетки ресуспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнка после соответствующей обработки и окрашивали MitoSOX (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) при 37 градусах в течение 20 минут. Флуоресценцию клеток измеряли с помощью проточного цитометра (FACSVerse, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для анализа потенциала митохондриальной мембраны использовали набор для анализа митохондриального мембранного потенциала тетраметилродамина (TMRE) (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США).
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменения в PGC-1, митохондриальной динамике и воспалительном пути NLRP3 при повреждении почек. Сначала мы исследовали экспрессию PGC-1, митохондриальной динамики и пути NLRP3 в RTEC, обработанных TGF- 1. . В этих клетках обработка TGF- 1 снижала уровни транскрипта и белка Ppargc1a (рис. 1A, B и дополнительный рисунок 1A). Соответственно, уровни экспрессии мРНК митофузина (Mfn), гена, связанного со слиянием митохондрий, и митохондриального фактора транскрипции A (Tfam), который представляет митохондриальную массу, были значительно снижены, тогда как уровень экспрессии динамин-родственного белка 1 (Drp1), митохондриального белка гена, связанного с делением, было увеличено по сравнению с контролем (рис. 1C). Кроме того, обработка TGF- 1 активировала передачу сигналов воспаления NLRP3, о чем свидетельствует повышенный уровень экспрессии генов и белков, связанных с воспалительным путем NLRP3 (рис. 1D, E и дополнительный рисунок 1B). Концентрации IL-1 и IL-18, конечных продуктов пути NLRP3, в клеточных лизатах, обработанных TGF- 1-, измеренные с помощью ELISA, были увеличены (рис. 1F). Кроме того, уровни экспрессии фиброзных маркеров, включая фибронектин и коллаген 1, а также индекс апоптотической гибели клеток соотношения Bax/bcl-2 и расщепленной каспазы-3 также были повышены (рис. 1G, H и дополнительная рис. 1C). ). Эти результаты были аналогичны в модели повреждения почек, вызванной аденином (рис. 2A–H и дополнительный рисунок 1D–F). Таким образом, при повреждении почек происходят значительные изменения в экспрессии PGC-1 и динамике митохондрий, а также активация воспалительного пути NLRP3.
Рис. 1. Изменения в PGC-1 , митохондриальной динамике и воспалительном пути NLRP3 в RTEC, обработанных TGF- 1-. Уровни экспрессии мРНК и белка B PGC-1 были снижены в RTEC, обработанных TGF- 1-. Экспрессия мРНК C генов, связанных с митохондриальной динамикой, включая Mfn, Tfam и Drp1, была изменена в RTEC, обработанных TGF- 1-. Уровни экспрессии мРНК D и белка E воспалительного пути NLRP3 были увеличены в RTEC, обработанных TGF{{10}}. F Концентрации IL-1 и IL-18, оцененные с помощью ELISA, были увеличены в RTEC, обработанных TGF- 1-. Уровни экспрессии G-мРНК и белка H маркеров фиброза, включая фибронектин и коллаген 1, а также маркеров апоптотической гибели клеток Bax/bcl-2 и расщепленной каспазы-3 были увеличены в RTEC, обработанных TGF- 1-. Примечание. *P <0,05 по сравнению с контролем. PGC-1 пероксисомальный пролифератор-коактиватор-1; Семейство NLRP3 NOD-подобных рецепторов, 3, содержащих пириновый домен; ASC, апоптоз-ассоциированный пятнообразный белок, содержащий домен рекрутирования каспазы; RTEC эпителиальные клетки почечных канальцев; Мфн митофузин; митохондриальный транскрипционный фактор А Tfam; белок 1, родственный динамину Drp1; ИФА-ферментный иммуносорбентный анализ.
PGC-1 восстанавливает нарушенную динамику и морфологию митохондрий при повреждении почек.
Затем мы исследовали, может ли PGC-1, ключевой регулятор биогенеза митохондрий, ослаблять динамику митохондрий во время повреждения почек. Для модуляции экспрессии Ppargc1 мы дополнительно использовали плазмиду Ppargc1a, siRNA против Ppargc1 (siPGC-1) и метформин, непрямой активатор PGC-1. Как и ожидалось, нарушенные гены, связанные с митохондриальной динамикой, были восстановлены за счет сверхэкспрессии Ppargc1. Напротив, нокдаун Ppargc1a с помощью siPGC-1 снижал экспрессию Mfn и Tfam, но увеличивал экспрессию Drp1 (рис. 3A-C и дополнительные рис. 2A, B). Эти результаты были подтверждены дополнительными экспериментами с метформином (рис. 3D – F и дополнительные рис. 2C, D). Такие улучшения привели к восстановлению функции митохондрий. Восстановление PGC-1 с помощью плазмиды Ppargc1a и метформина значительно улучшило снижение потенциала митохондриальной мембраны и снижение скорости потребления кислорода в RTEC, обработанных TGF- 1 (дополнительная фигура 3A-D). В соответствии с изменениями в PGC-1 экспрессия фосфо-АМФ-активируемой протеинкиназы (p-AMPK) снижалась в клетках, обработанных TGF- -, тогда как обработка метформином восстанавливала эту экспрессию (рис. 3F и Дополнительный рисунок 2E). Однако метформин не увеличивал уровни экспрессии мРНК и белка PGC-1 в RTEC с подавлением Ppargc1a. Эти результаты позволяют предположить, что AMPK опосредует эффект метформина, а PGC-1 является нижестоящим эффектором AMPK (дополнительные рисунки 2F, G, J). Благотворное влияние метформина на динамику митохондрий также было аннулировано за счет подавления Ppargc1a (дополнительный рисунок 2H – J). In vivo лечение метформином также восстанавливало уровень транскрипта Ppargc1 и обращало вспять измененную экспрессию генов, связанных с митохондриальной динамикой, у мышей, получавших аденин, и мышей UUO (рис. 3G-I и дополнительные рис. 2K, L, 4A-E). Активность AMPK метформином также была подтверждена in vitro в модели, получавшей аденин (рис. 3I и дополнительный рис. 2M). Электронно-микроскопическое исследование также подтвердило потерю целостности митохондрий в RTEC мышей, получавших аденин, и мышей UUO. Однако эти показатели были значительно улучшены благодаря метформину (рис. 3J и дополнительный рис. 4F). Эти данные позволяют предположить, что PGC-1 восстанавливает нарушенную динамику, морфологию и функции митохондрий при повреждении почек.
Повреждение митохондрий может привести к гибели клеток почек и фиброзу. Мы наблюдали повышенные уровни экспрессии фиброзных маркеров, включая фибронектин и коллаген 1, а также индекс апоптотической гибели клеток соотношения Bax/bcl-2 и расщепленной каспазы-3 в RTEC после обработки TGF- 1. Эта повышенная экспрессия маркеров гибели клеток была ослаблена сверхэкспрессией PGC-1 и метформина и усугублена siPGC-1 (рис. 4A-D и дополнительные рис. 5A, B). В соответствии с этими результатами уровни экспрессии фиброзных маркеров и индекс апоптотической гибели клеток были значительно увеличены у мышей, получавших аденин, и мышей UUO. Напротив, метформин полностью изменил все эти проявления (рис. 4E, F и дополнительные рис. 5C, 6A, B). Окрашивание трихромом по Массону также подтвердило улучшение фиброза при применении метформина (рис. 4G). Примечательно, что увеличенные маркеры гибели клеток и передача сигналов NLRP3 в RTEC, обработанных TGF-, были обращены вспять Z-Asp-2,6- дихлорбензоилоксиметилкетоном (Enzo Life Science, Фармингдейл, Нью-Йорк, США), пан-каспазой. ингибитор, что позволяет предположить, что повреждение, вызванное TGF- -, вероятно, будет опосредовано повреждением митохондрий и ранним апоптозом (дополнительная фигура 7A-D). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что активация PGC-1 ослабляет повреждение митохондрий и уменьшает гибель клеток и фиброз почек.
PGC-1 модулирует
Воспалительный сигнальный путь NLRP3 Затем мы дополнительно исследовали взаимосвязь между PGC-1 и воспалительным путем NLRP3 в опосредовании повреждения почек. Когда сверхэкспрессия PGC-1 индуцировалась с помощью трансфекции плазмиды Ppargc1a, уровни экспрессии NLRP3, ASC, IL-1 и IL-18 снижались в RTEC, обработанных TGF- 1- ( Рис. 5A, B и дополнительный рисунок 8A). Концентрации IL-1 и IL-18 в клеточных лизатах, обработанных TGF- 1-, измеренные с помощью ELISA, также снижались после трансфекции плазмиды Ppargc1a (рис. 5C). Лечение метформином дало аналогичный результат (рис. 5D, E и дополнительный рисунок 8B). Однако нокдаун Ppargc1a привел к повышенным уровням экспрессии генов и белков, связанных с воспалительным путем NLRP3 (рис. 5A, B и дополнительная рис. 8A). Более того, активация сигнального пути воспаления NLRP3 у мышей, получавших аденин, и мышей UUO одновременно снижалась под действием метформина (рис. 5F, G и дополнительные рис. 6C, D, 8C). Концентрации IL-1 и IL-18 в RTEC и лизатах тканей почек были значительно снижены при лечении метформином, измеренном с помощью ELISA (рис. 5H).
Учитывая способность PGC-1 регулировать динамику митохондрий, мы затем проверили роль Drp1 в активации воспалительной сомы NLRP3. Передача сигналов воспаления NLRP3 была значительно снижена за счет нокдауна Drp1. Однако в RTEC с нокдауном Ppargc1a и Drp1 уровни экспрессии компонентов воспаления NLRP3 не снижались по сравнению с уровнями в клетках, обработанных TGF- 1-. В RTEC со сверхэкспрессией Ppargc1a и нокдауном Drp1 передача сигналов воспаления NLRP3 была менее активирована (дополнительные рис. 9A, B). Эти данные позволяют предположить, что Drp1 может частично опосредовать активацию воспаления NLRP3, но другие действия PGC-1 участвуют в регуляции сигнального пути NLRP3.
Далее мы исследовали, существует ли сигнал обратной связи от воспалительной сомы NLRP3. С этой целью мы получили RTEC путем первичной культуры от мышей, нокаутных по Nlrp3. В этих клетках, обработанных TGF- 1, активация передачи сигналов NLRP3 была меньше, чем в клетках-аналогах, что приводило к улучшению динамики митохондрий (дополнительная фигура 10A-E). Соответственно, наблюдалось сопутствующее улучшение фиброзных изменений и гибели клеток в отсутствие Nlrp3 (дополнительный рисунок 10F, G). Эти данные предполагают возможную двунаправленную связь между повреждением митохондрий и передачей сигналов NLRP3.
Олигомеризация NLRP3 с адаптерным белком ASC является ключевым этапом образования воспалительного комплекса. Таким образом, мы исследовали, влияет ли PGC- 1 на сборку воспаления NLRP3. В RTEC, обработанных TGF- 1-, наблюдалось связывание ASC с NLRP3. Эта олигомеризация значительно уменьшалась за счет сверхэкспрессии PGC-1 или метформина, тогда как связывание восстанавливалось с помощью siPGC-1 (рис. 6A-C). У мышей, получавших аденин, олигомеризация и активация NLRP3 были подтверждены связыванием ASC с NLRP3, и это было отменено метформином (рис. 6D, E).
Наконец, мы дополнительно изучили содержимое митохондрий и сопутствующие изменения в экспрессии NLRP3. Исследование конфокальной микроскопии показало, что наблюдалось взаимное изменение интенсивности MitoTracker Red и экспрессии NLRP3 в RTEC с PGC-1 или без него. TGF- 1 уменьшал интенсивность окрашивания MitoTracker, и она восстанавливалась за счет сверхэкспрессии PGC-1 и метформина. И наоборот, повышенная экспрессия NLRP3 в RTEC, обработанных TGF- 1-, снижалась за счет сверхэкспрессии PGC-1 и метформина. Однако siPGC-1 опроверг эти выводы (рис. 7). В совокупности эти результаты указывают на то, что сборка воспалительного комплекса NLRP3 индуцируется во время повреждения почек, а активация этого пути подавляется PGC-1 .
Рис. 5. PGC-1 модулирует сигнальный путь воспаления NLRP3. Уровни экспрессии мРНК и белка B воспалительного пути NLRP3 были снижены в RTEC, обработанных TGF- 1-, с трансфекцией плазмиды Ppargc1a, тогда как повышены с помощью siPGC-1. C Концентрации IL- 1 и IL-18, оцененные с помощью ELISA, были снижены в обработанных TGF- 1- RTEC со сверхэкспрессией Ppargc1a. Уровни экспрессии мРНК D и белка E воспалительного пути NLRP3 были снижены в RTEC, обработанных TGF- 1- метформином. Уровни экспрессии F-мРНК и G-белка воспалительного пути NLRP3, а также концентрации H IL-1 и IL-18, оцененные с помощью ELISA, были снижены у мышей, получавших аденин с метформином. Примечание: *P < 0.05 по сравнению с контролем; **P < 0,05 по сравнению с мышами RTEC, получавшими TGF- 1-, или мышами, получавшими аденин. PGC-1 пероксисомальный пролифератор-коактиватор-1; Семейство NLRP3 NOD-подобных рецепторов, 3, содержащих пириновый домен; ASC-ассоциированный с апоптозом пятнышкообразный белок, содержащий домен рекрутирования каспазы; RTEC эпителиальные клетки почечных канальцев; ИФА-ферментный иммуносорбентный анализ; Аде аденин; Встречалась с метформином.
Рис. 6. PGC-1 модулирует олигомеризацию воспаления NLRP3 во время повреждения почек. Олигомерные структуры A–C ASC, проанализированные с помощью DSS-опосредованного перекрестного связывания, наблюдались в RTEC, обработанных TGF- 1-, которые были ослаблены сверхэкспрессией Ppargc1a и метформином и усугублены siPGC-1. Олигомерные структуры D, E ASC наблюдались у мышей, получавших аденин, которые были ослаблены метформином. Примечание: *P < 0.05 по сравнению с контролем; **P < 0,05 по сравнению с мышами RTEC, получавшими TGF- 1-, или мышами, получавшими аденин. PGC-1 пероксисомальный пролифератор-коактиватор-1; Семейство NLRP3 NOD-подобных рецепторов, 3, содержащих пириновый домен; ASC-ассоциированный с апоптозом пятнышкообразный белок, содержащий домен рекрутирования каспазы; DSS дисукцинимидилсуберат; RTEC эпителиальные клетки почечных канальцев; Аде аденин; Встречалась с метформином.
PGC-1 управляет высвобождением мтДНК, окислительным стрессом и TNFAIP3 для регулирования воспаления NLRP3.
Чтобы дополнительно прояснить механистическую связь между PGC-1 и воспалительным путем NLRP3 при повреждении почек, мы сначала исследовали изменения в мтДНК при повреждении клеток, которые известны как триггер активации воспаления NLRP3. Число копий мтДНК уменьшалось в митохондриальной фракции и увеличивалось в цитозольной фракции после обработки TGF- 1, что позволяет предположить, что мтДНК высвобождалась из митохондрий в цитозоль. Примечательно, что эти изменения восстанавливались после сверхэкспрессии Ppargc1a (рис. 8А).
Затем мы исследовали окислительный стресс, положительный регулятор воспаления NLRP3. В RTEC, обработанных TGF- 1-, окислительный стресс был особенно выражен по сравнению с контролем, о чем свидетельствует повышенная интенсивность окрашивания MitoSOX и повышенные уровни MDA. Лечение плазмидой Ppargc1a и метформином ослабляло перепроизводство митохондриальных АФК. И наоборот, нокдаун Ppargc1a еще больше увеличивал уровни окислительного стресса в RTEC, обработанных TGF- 1- (рис. 8B-D). Подобно результатам исследования in vitro, уровни MDA были значительно повышены у мышей, получавших аденин, и у мышей UUO. Усиленный окислительный стресс был уменьшен метформином (рис. 8E и дополнительный рисунок 6E).
Наконец, мы дополнительно исследовали TNFAIP3, который регулируется PGC-1 и также известен как негативный регулятор воспаления NLRP3. TGF- 1 снижал уровни транскрипта Tnfaip3, и это снижение экспрессии Tnfaip3 восстанавливалось за счет восстановления PGC-1. Напротив, нокдаун Ppargc1a привел к дальнейшему снижению экспрессии Tnfaip3 (рис. 8F, G и дополнительные рис. 8D, E). Более того, наблюдалось снижение экспрессии TNFAIP3 у мышей, получавших аденин, и мышей UUO, а метформин восстанавливал эту экспрессию (рис. 8H и дополнительные рис. 6F, 8F). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что PGC-1 может регулировать воспаление NLRP3 посредством модуляции высвобождения мтДНК, митохондриальных АФК/окислительного стресса и TNFAIP3.
Служба поддержки Wecistanche-крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:
Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Телефон:+86 15292862950
Магазин для получения дополнительных технических характеристик:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
