Фенилэтаноидные гликозиды индуцируют апоптоз в клетках Eca-109 по митохондриально-зависимому пути

Введение

Рак пищевода является одним из наиболее распространенных типов рака, занимая 11-е место по уровню заболеваемости и 6-е место по уровню смертности в мире. В 2015 году он стал причиной ~439000 смертей. Заболеваемость раком пищевода заметно различается в разных регионах, причем в восточных В Азии, восточной и южной Африке наблюдались самые высокие показатели заболеваемости, а в Западной Африке - самые низкие показатели в 2012 году. В Китае предполагаемые случаи рака пищевода и смертность составили 477000 и 375000 соответственно. , в 2015 году. Хотя уровень заболеваемости раком пищевода снизился в странах со средним и высоким социально-демографическим индексом в период с 2005 по 2015 год, уровень смертности остается высоким из-за плохого прогноза. Сочетание хирургической резекции с химиотерапией или лучевой терапией использовалось для лечения рака пищевода, однако сообщалось, что в период с 2003 по 2014 год 5-летняя выживаемость оставалась неизменной.<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyпродемонстрировал, чтоЦистанхе тубулозной фенилэтаноидные гликозиды(CTPG) может подавлять рост клеток меланомы B16-F10 in vitro и in vivo (24). Однако плохая растворимость в воде ранее использовавшегося CTPG ограничивает разработку лекарств. Поэтому использовали водорастворимый CTPG (CTPG-W) и исследовали противоопухолевое действие на клетки рака пищевода (Eca-109). Было установлено, что CTPG-W может дозозависимо ингибировать жизнеспособность клеток Eca-109 посредством индукции апоптоза по митохондриально-зависимому пути.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Материалы и методы

Животные.

Самки мышей C57BL/6 (6-8 недель, ~25 г) были приобретены в Пекинском центре исследований лабораторных животных (Пекин, Китай) и помещены в камеру с контролируемой температурой (25˚C) и световым циклом (12/ 12) Центр животных Синьцзянского университета (Урумчи, Китай). Все животные получали свободную от патогенов воду и корм.

Клеточная линия и культура.

Линия клеток карциномы пищевода человека (Eca-109) была сохранена в Синьцзянской ключевой лаборатории биологических ресурсов и генной инженерии (Колледж наук о жизни и технологий, Синьцзянский университет, Урумчи, Китай) и культивирована в RPMI{{1} } среда (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Цзянсу, Китай), 1% L -глутамин (100 мМ), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37˚C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

CTPG-W (каталожный номер SGJG20170410) был приобретен у Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Основные соединения CTPG были квалифицированы и количественно определены с помощью ВЭЖХ в соответствии с нашим предыдущим исследованием (24). Вкратце, ВЭЖХ проводили на колонке ZORBAX SB-C18 (250x4,6 мм; 5 мкм) при 30°C и элюировали 0,2% раствором муравьиной кислоты и градиентом метанола, начиная с 23%, при этом каждую минуту добавляли 1 мл. в течение 45 мин до достижения 31%. Всего было введено 10 мкл образца и обнаружено при длине волны 330 нм. Стандарт эхинакозида был приобретен у Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а стандарт актеозида был приобретен у Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Стандарты использовались для анализа компонентов CTPG-W.

МТТ-анализ.

Пролиферацию клеток измеряли с помощью МТТ-анализа. Клетки Eca{{0}} инокулировали в 96-луночные планшеты с плотностью 5x103 клеток в 100 мкл RPMI{{5 }} среду/лунку и культивировали при 37°C в течение 24 часов, затем обрабатывали различными концентрациями (0, 200, 400, 600 и 800 мкг/мл) CTPG-W или 0,4% диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 24, 48 и 72 часа. ДМСО использовали в качестве контроля растворителя (800 мкг/мл CTPG-W, содержащего 0,4% ДМСО). Цисплатин (20 мкг/мл) использовали в качестве положительного контроля. Затем супернатант отбрасывали после центрифугирования при 225 g в течение 5 минут при комнатной температуре и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора МТТ (0,5 мг/мл в среде RPMI-1640 без FBS) и инкубировали при 37°C в течение 3 час Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 200 мкл ДМСО. Значения оптической плотности (ОП) измеряли при длине волны 490 нм с помощью 96-луночного считывателя микропланшетов (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США). Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле: Жизнеспособность клеток (%)=(ODобработанная/ODнеобработанная)x100%. Морфологию клеток Eca-109 наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (увеличение x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Токио, Япония).

Для пролиферации спленоцитов мышей C57BL/6 подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков и выделяли селезенки. Готовили одноклеточную суспензию и спленоциты высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1x105 клеток/лунку в 100 мкл среды RPMI-1640, а затем обрабатывали различными концентрациями. (0, 200, 400, 600 и 800 мкг/мл) CTPG-W в течение 24, 48 и 72 часов при 37˚C с 5% CO2. Пролиферацию спленоцитов измеряли с помощью МТТ-анализа в соответствии с вышеупомянутым протоколом. Стимулирующий индекс=ODобработанный/ODнеобработанный.

Измерение апоптоза и клеточного цикла. Клетки Eca{{0}} культивировали в чашках диаметром 60 мм при плотности 2,5x105 клеток/чашку в течение 24 ч и обрабатывали различными концентрациями ({{31} }, 200, 400, 600 и 800 мкг/мл) CTPG-W или 0,4% ДМСО в течение 24 часов при 37˚C с 5% CO2. Клетки собирали и окрашивали с помощью набора для обнаружения апоптоза аннексина V-флуоресцеина (FITC)/йодида пропидия (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) в соответствии с протоколами производителя. Образцы собирали методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) и анализировали с помощью FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ашленд, Орегон, США). Для анализа влияния CTPG-W на клеточный цикл 2,5x105 клеток Eca-109 высевали в культуральные чашки диаметром 60 мм и обрабатывали CTPG-W (0, 100, 200 и 400 мкг/мл) или 0,4 мкг/мл. % ДМСО в течение 24 часов при 37˚C с 5% CO2. Все клетки собирали и дважды промывали ледяным PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), затем фиксировали в 70% ледяном этаноле при 4°C в течение 30 минут. После двукратной промывки ледяным PBS клетки ресуспендировали в 300 мкл буфера для окрашивания PI/РНКазы (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) в течение 10 минут при комнатной температуре. Распределение клеточного цикла анализировали с помощью программного обеспечения ModFit LT 3.0 методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur).

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯпротив усталостиЗащита печени PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Анализ мембранного потенциала митохондрий (Δψm) и активных форм кислорода (АФК).Для анализа Δψm клетки Eca{{0}} обрабатывали CTPG-W (0, 400, 600 и 800 мкг/мл) или 0,4% ДМСО для 24 часа при 37˚C с 5% CO2 и окрашивание с помощью набора для анализа митохондриального мембранного потенциала с JC-1 (Институт биотехнологии Beyotime, Шанхай, Китай), в соответствии с протоколом производителя, в течение 20 минут при 37˚. С. После двукратного промывания промывочным буфером JC-1 (Институт биотехнологии Бейотима) образцы ресуспендировали в 300 мкл промывочного буфера JC-1 и анализировали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur). Флуоресценцию красителя JC-1 в клетках Eca-109 наблюдали также с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (увеличение х200; Nikon Eclipse Ti-E). Для анализа АФК клетки Eca-109 обрабатывали CTPG-W (0, 400, 600 и 800 мкг/мл) в течение 2, 4, 6, 12 и 24 часов и окрашивали с помощью анализа активных форм кислорода. комплект (Институт Биотехнологии Бейотайм), согласно протоколу производителя, в течение 20 мин при 37˚С. После трехкратной промывки ледяным PBS образцы собирали методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6.

Рисунок 1. Квалифицированный контроль CTPG-W. Компоненты CTPG-W качественно и количественно анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и сравнивали со стандартами эхинакозида и актеозида. CTPG-W, водорастворимые фенилэтаноидные гликозидыC. трубчатая.

Активность по связыванию радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH). Активность CTPG-W по улавливанию свободных радикалов определяли с помощью анализа свободных радикалов DPPH в соответствии с опубликованным протоколом с незначительной модификацией, поскольку метанол был заменен этанолом для растворения DPPH (25,26). Для стационарных измерений 150 мкл DPPH (100 ммоль/л) в этаноле смешивали с различными концентрациями CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 и 600 мкг/мл) в 50 мкл PBS и инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Поглощение при 517 нм определяли в присутствии и в отсутствие CTPG-W. В качестве положительного контроля использовали в общей сложности 50 мкл витамина С. Активность по улавливанию радикалов ДФПГ рассчитывали по формуле: Очистка (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, где Ablank — поглощение контроля (без ДФПГ), Asample – оптическая плотность образца, а A0 – оптическая плотность PBS с DPPH.

Вестерн-блот-анализ. Клетки Eca{{0}} обрабатывали CTPG-W (0, 200, 600 мкг/мл) или 0,4% ДМСО в течение 24 часов при 37˚C с 5% CO2. Последующая двукратная промывка PBS, клетки 

Рисунок 2. Влияние CTPG-W на рост клеток Eca-109 и спленоцитов. (A) Клетки Eca-109 обрабатывали различными концентрациями CTPG-W в течение 24, 48 и 72 часов, а затем жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-анализа. (B) Морфологические изменения клеток Eca-109 при обработке CTPG-W через 24 часа. (C) Спленоциты мышей C57BL/6 обрабатывали различными концентрациями CTPG-W в течение 24, 48 и 72 часов, а затем пролиферацию анализировали с помощью МТТ-анализа.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. трубчатая.

лизировали в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Пекин, Китай) в течение 20 минут на льду. После центрифугирования при 10,000 g в течение 10 минут при 4°C супернатанты собирали и концентрации белка определяли с помощью набора для бицинхониновой кислоты (Thermo Fisher Scientific, Inc.) в соответствии с протоколами производителя. Вестерн-блот-анализ проводили согласно нашему предыдущему описанию (24). Антитела против каспазы-7 (кат. № D120077), каспазы-8 (кат. № D155240), каспазы-9 (кат. № D220078), В-клеточной лимфомы{ {13}} (Bcl-2)-ассоциированный X (Bax) (каталожный номер D220073) и Bcl-2 (каталожный номер D260117), а также антимышиные IgG-пероксидаза хрена (HRP) ) (каталожный номер D111050) и антикроличий IgG-HRP (каталожный номер D110058) были приобретены у BBI Life Sciences (Шанхай, Китай). Антитела против каспазы-3 (кат. номер E-AB-10050) и активной каспазы -3 (кат. номер E-AB-22115) были куплены у Elabscience ( Ухань, Китай). Другие антитела против каспазы-7 (кат. № 9492), поли(АДФ-рибозо)-полимеразы (PARP) (кат. № 9542), цитохрома c (кат. № AC909), c-Jun NH{ {37}}концевая киназа (JNK) (номер по каталогу 9252S) и -актин (номер по каталогу 58169) были получены от Cell Signaling Technology, Inc. (Данверс, Массачусетс, США). Все первичные и вторичные антитела разводили в соотношении 1:1,000. Первичные антитела инкубировали при 4°С в течение ночи, а вторичные антитела инкубировали при 37°С в течение 1 часа.

Рисунок 3. Апоптоз клеток Eca-109, индуцированный CTPG-W. Клетки обрабатывали различными концентрациями CTPG-W в течение 24 часов. (A) Апоптозные и некротические клетки Eca-109 были проанализированы методом проточной цитометрии. На верхней панели изображены отдельные точечные графики, а на нижней панели — сводные данные. * П<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. трубчатая.

Целевые белки выявляли с использованием набора для усиленного хемилюминесцентного анализа (Институт биотехнологии Бейотайм) в соответствии с протоколом производителя.

Статистический анализ. Статистическую значимость рассчитывали путем одностороннего дисперсионного анализа с помощью апостериорного критерия Тьюки, а результаты анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США) среди экспериментальной и контрольной групп. Все данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение. П<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

ЭКСТРАКТ ЦИСТАНХЕ ТУБУЛОЗНОЙ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ФУНКЦИИ ПОЧЕК PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Результаты

CTPG‑W подавляет рост клеток Eca‑109.

Компоненты CTPG-W были квалифицированы и количественно оценены с помощью ВЭЖХ (рис. 1), которые сравнивались со стандартами эхинакозида и актеозида. В зависимости от времени удерживания пика и площади пика CTPG-W содержал 39,16% эхинакозида и 2,44% актеозида. Во-первых, влияние CTPG-W на жизнеспособность клеток Eca-109 определяли с помощью МТТ-анализа. CTPG-W растворяли в ДМСО в концентрации 200 мг/мл и разбавляли средой RPMI-1640, содержащей 10% инактивированного нагреванием FBS, до указанных концентраций. Клетки Eca-109 обрабатывали CTPG-W и жизнеспособность клеток анализировали с помощью МТТ-анализа в указанные моменты времени. Обработка CTPG‑W значительно снижала жизнеспособность клеток Eca-109 в зависимости от дозы и времени (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Рисунок 4. Влияние CTPG-W на распределение клеточного цикла в клетках Eca-109. Различные концентрации CTPG-W использовали для обработки клеток Eca-109 в течение 24 часов, а распределение клеточного цикла анализировали с помощью проточной цитометрии. * П<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. трубчатая.

CTPG‑W индуцирует апоптоз в клетках Eca‑109. Чтобы выяснить, подавляет ли CTPG-W рост клеток Eca-109 посредством индукции апоптоза или некроза, клетки обрабатывали различными концентрациями CTPG-W. Через 24 часа апоптоз и некроз клеток Eca-109 обнаруживали с помощью окрашивания аннексином V/PI. Как показано на фиг. 3А, клетки аннексина V-/PI+ были закрыты как некротические клетки, а клетки аннексина V+/PI+ и аннексина V+/PI- были закрыты как апоптотические клетки. CTPG-W в первую очередь индуцировал апоптоз клеток Eca-109 дозозависимым образом, хотя количество некротических клеток Eca-109 также значительно увеличивалось при обработке 600 и 800 мкг/мл CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W индуцирует остановку клеточного цикла в S-фазе в клетках Eca-109. Нарушение цикла раковых клеток подавляет рост клеток и способствует апоптозу (27). Распределение клеточного цикла в клетках Eca-109 определяли с помощью окрашивания PI после обработки CTPG-W в течение 24 часов. Было замечено, что количество клеток в фазе S увеличилось, а количество клеток в фазах G0/G1 показало общее значительное снижение после обработки CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W снижает Δψm и индуцирует высвобождение цитохрома с. Апоптоз может быть вызван митохондриально-зависимым путем (28,29). Про- и антиапоптотические члены семейства белков BCL-2 играют важную роль в регуляции целостности митохондриальных мембран (30,31). После обработки CTPG-W в течение 24 часов Δψm оценивали с помощью окрашивания JC-1. Агрегат JC-1 (красная флуоресценция, обнаруженная в FL-2) будет распадаться на мономер (зеленая флуоресценция, обнаруженная в FL-1), когда Δψm снижается (32). Как показано на рис. 5А, частоты клеток FL-1+ FL-2-/+ значительно увеличивались дозозависимым образом, что указывает на то, что Δψm клеток Eca-109 уменьшалась. Изменения флуоресценции клеток Eca-109 также наблюдались с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (рис. 5Б). С увеличением концентрации CTPG-W красная флуоресценция уменьшалась, а зеленая флуоресценция возрастала, что согласуется с данными проточной цитометрии. Также наблюдалось заметное повышение уровня цитохрома с в цитозоле (рис. 5В), что является результатом снижения Δψm. Это подтверждает вывод, сделанный на основании увеличения количества клеток FL-1+ FL-2-/+, о том, что Δψm уменьшилась в результате обработки CTPG-W. Сообщалось, что JNK может регулировать активацию семейства белков BCL-2, вызывая высвобождение цитохрома c (33-35). Также было установлено, что уровень JNK заметно повышался после лечения CTPG-W (рис. 5C). Результаты показали, что CTPG-W может индуцировать апоптоз клеток Eca-109 митохондриально-зависимым путем.

Рисунок 5. Снижение Δψm и активация цитохрома с и JNK. Клетки Eca-109 обрабатывали различными концентрациями CTPG-W в течение 24 часов. (A) Δψm определяли с помощью окрашивания JC-1, а образцы анализировали с помощью проточной цитометрии. Отдельные точечные графики отображают изменения флуоресценции JC-1. Частоты ячеек FL-1+ FL-2-/+ изображены на нижней панели. ***П<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Рисунок 6. Уровни АФК в клетках Eca-109 при обработке CTPG-W и антиоксидантная активность CTPG-W. (A) Клетки Eca-109 обрабатывали различными концентрациями CTPG-W, и уровни АФК анализировали с помощью проточной цитометрии в указанные моменты времени. * П<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Влияние CTPG‑W на внутриклеточную генерацию АФК.АФК могут снижать Δψm, вызывая апоптоз (36). Чтобы выяснить, может ли CTPG-W увеличивать выработку АФК, клетки Eca-109 обрабатывали различными концентрациями CTPG-W. Клетки собирали в указанные моменты времени и окрашивали DCFH-DA. Продукцию внутриклеточных АФК в клетках Eca-109 определяли методом проточной цитометрии. Как показано на фиг. 6А, 800 мкг/мл CTPG-W значительно увеличивали выработку АФК с 2-6 ч и снижали с 12-24 ч. Кроме того, 400 мкг/мл CTPG-W значительно увеличивали выработку АФК с 12-24 ч. Более того, 200 мкг/мл CTPG-W существенно не изменили выработку АФК. Динамические изменения продукции АФК могут быть связаны с апоптозом клеток Eca-109. Также было установлено, что CTPG-W обладает активностью по улавливанию свободных радикалов (рис. 6Б), что может быть связано со снижением продукции АФК в клетках Eca-109, обработанных 800 мкг/мл CTPG-W через 12 часов.

Рисунок 7. Уровни расщепленных каспаз и расщепленного PARP после обработки CTPG-W. Белки выделяли из клеток Eca-109, обработанных CTPG-W в течение 24 часов, и уровни расщепленных каспаз и расщепленного PARP определяли с помощью вестерн-блот-анализа. ДМСО, диметилсульфоксид; CTPG-W, водорастворимые фенилэтаноидные гликозидыC. трубчатая; PARP, поли(АДФ-рибоза) полимераза.

CTPG-W повышает активность каспазы-3, каспазы-7, каспазы-9 и PARP. Высвобождение цитохрома с вследствие снижения Δψm может активировать протеазы каспаз, вызывая апоптоз (29,30,37). После обработки CTPG-W в течение 24 часов активация каспазы -3, 7, 8, 9 и PARP была обнаружена с помощью вестерн-блот-анализа. По сравнению с контролем уровни расщепляемой каспазы-9, расщепляемой каспазы-7, расщепляемой каспазы-3 и расщепляемого PARP, но не уровни расщепляемой каспазы{{20 }} активировались под действием CTPG дозозависимым образом (рис. 7). Эти результаты показали, что CTPG-W снижает Δψm и способствует высвобождению цитохрома с, активируя каспазы, которые индуцируют апоптоз клеток Eca-109.

Обсуждение

Традиционный CHM может вызывать апоптоз раковых клеток пищевода различными путями, включая внешний рецептор смерти и внутренние пути стресса митохондриального и эндоплазматического ретикулума (29). Наше предыдущее исследование продемонстрировало, что CTPG, как основной компонент C. Tubeulosa, ингибирует рост клеток меланомы B16-F10 посредством индукции апоптоза по митохондриально-зависимому пути (24). В настоящем исследовании изучалось противоопухолевое действие CTPG-W на клетки Eca-109 и было установлено, что CTPG-W подавлял рост клеток Eca-109, индуцировал апоптоз и остановку клеточного цикла. снижал Δψm, увеличивал высвобождение цитохрома с и активировал каспазы. CTPG и CTPG-W могут вызывать апоптоз и остановку клеточного цикла в раковых клетках. Однако точные механизмы различаются из-за разных компонентов CTPG (26,64% эхинакозида, 10,19% актеозида и 1,71% изоактеозида) и CTPG-W (39,16% эхинакозида и 2,44% актеозида). CTPG арестовывал клетки B16-F10 в фазах G0/G1, а CTPG-W арестовывал клетки Eca-109 в фазе S (24). Производство АФК дозозависимо увеличивалось под действием CTPG, но это указывало на изменение в зависимости от времени при приеме высокой дозы CTPG-W, которая значительно увеличивалась в начале лечения CTPG-W (2-6 ч) и значительно снизилась через 12 ч по сравнению с контролем. Возможная причина заключается в том, что основным компонентом CTPG-W является эхинакозид. В нескольких исследованиях сообщалось, что эхинакозид может ингибировать выработку АФК и апоптоз, индуцированный АФК, оказывая нейропротекторное и антивозрастное действие (38-40). Аналогичным образом, в настоящем исследовании наблюдалась активность по улавливанию свободных радикалов. Поэтому было высказано предположение, что некоторые компоненты, включая вербаскозид, изо-вербаскозид и салидрозид, в высокой дозе CTPG-W могут немедленно индуцировать генерацию АФК, вызывая апоптоз клеток Eca-109 (41,42), а затем ROS был очищен echiнакозид. Другая возможная причина различий в продукции АФК с помощью CTPG и CTPG-W заключается в том, что в этом и предыдущем исследовании использовались разные клеточные линии (24). Донг и др. (43) сообщили, что эхинакозид может индуцировать апоптоз клеток колоректального рака человека SW480 посредством образования окислительного повреждения ДНК без повышения уровня АФК.

Обработка CTPG-W снижала Δψm и вызывала высвобождение цитохрома с, который способствует расщеплению каспазы -9 (28). Соответственно, уровни расщепленной каспазы -9 повышались при обработке CTPG-W. Впоследствии активная каспаза-9 может активировать каспазу-3, вызывая апоптоз (44). Уровни расщепленной каспазы-3 также повышались при обработке CTPG-W. Однако каспаза -8 не активировалась CTPG-W, что указывает на то, что внешний путь рецептора смерти не участвует в апоптозе, индуцированном CTPG-W. Эти наблюдения показывают, что CTPG-W индуцирует апоптоз клеток Eca-109 посредством активации митохондриально-зависимого пути.

PARP играет важную роль в стабильности генома и может расщепляться активными каспазами, особенно каспазой -3 и -7 (45). Было установлено, что обработка CTPG-W активирует каспазу -3 и -7, которые могут расщеплять PARP, ингибируя репарацию ДНК и вызывая апоптоз.

CTPG-W также в зависимости от дозы и времени подавляет рост клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека BEL-7404 (неопубликованные данные). Хотя CTPG-W подавляет рост клеток Eca-109 и BEL-7404, он способствует пролиферации спленоцитов, что может быть связано с содержанием полисахаридов (~50%) в CTPG-W (46 ). Аналогичным образом, в нескольких исследованиях сообщалось, что полисахариды могут способствовать пролиферации спленоцитов (46-49). На мышиной модели было установлено, что CTPG‑W значительно увеличивал индекс селезенки по сравнению с контрольной группой, но не влиял на массу тела и показатели других органов, включая сердце, печень, почки и легкие (неопубликованные данные). что указывает на то, что CTPG-W не оказывает цитотоксического действия на нормальные клетки.

В совокупности данные показали, что CTPG-W ингибирует рост клеток Eca-109 путем индукции апоптоза по митохондриально-зависимому пути.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%