Фенилэтанолгликозиды из Cistanche Tubulosa подавляют активацию звездчатых клеток печени и блокируют проведение сигнальных путей в TGF-01/smad как потенциальные агенты против фиброза печени

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Шу-Пин Ю, Лун Ма, Цзюнь Чжао, Ши-Лей Чжан и Тао Лю

Абстрактный: Цистанхе трубчатаяэто традиционное китайское лекарственное средство на травах, широко используемое для регуляции иммунитета ифенилэтаноидные гликозиды(CPhG) являются одними из основных компонентов, ответственных за эту деятельность. Предыдущие исследования показали профилактическое и терапевтическое действие CPhG на фиброз печени у крыс, вызванный бычьим сывороточным альбумином (БСА). Цель исследования состояла в том, чтобы оценить противофиброзный эффект КФГ и мономеров.эхинакозида такжеактеозидпутем ингибирования активации звездчатых клеток печени (HSC), блокирования проведения сигнальных путей в трансформирующий фактор роста-p1 (TGF-p1)/smad и определяют их гепатопротекторную активность in vitro. Пролиферация ГСК явно ингибировалась после обработки ЦФГ (100,50 мкг/мл)/эхинакозидом (500,250,125 мкг/мл)/актеозидом (6,3 мкг/мл) со значениями IC50 119,125,520,345 и 6,999 мкг/мл. мл соответственно в анализе МТТ. Различные концентрации CPhGs/эхинакозид/актеозидне влиял на клеточную токсичность HSC согласно измерениям лактатдегидрогеназы (LDH). Различные концентрации CPhGs/эхинакозид/актеозидповышал уровень мРНК и экспрессию белка smad7 и снижал уровни мРНК smad2, smad3 и экспрессию белка smad2, фосфо-smad2 (p-smad2), smad3, фосфо-smad3 (p-smad3) в HSC. Таким образом, эти результаты демонстрируют, что CPhGs/эхинакозид/актеозидможет блокировать проведение сигнальных путей в TGF-p1/smad и ингибировать активацию HSC, предполагая, чтоС. тубулозатаким образом, может быть потенциальным фитопрепаратом для лечения фиброза печени.

Ключевые слова: Цистанхе трубчатая; фенилэтанолгликозиды изЦистанхе(ЦПГ);эхинакозид; актеозид; звездчатые клетки печени (HSC); TGF-p1/smad

Цистанхе трубчатая

1. Введение

становятся пролиферативными и фиброгенными, впоследствии накапливают внеклеточный матрикс и в конечном итоге дифференцируются в фиброгенные миофибробластоподобные клетки. Трансформирующий фактор роста-.1 (TGF-p 1) считается основным профиброгенным медиатором. Сигнальный путь, связанный с TGF-&1, является важным механизмом фиброза печени, и он в основном включает smad-зависимую и smad-независимую передачу сигналов, а smad-зависимый путь передачи сигналов считается основным каналом передачи сигналов TGF-p1. . Таким образом, блокада сигнального пути TGF-p1/smad может подавлять выработку коллагена и, в конечном счете, облегчать фиброз печени, что сделало этот путь важной мишенью в исследованиях препаратов против фиброза печени в последние годы.

Несмотря на высокую распространенность фиброза печени во всем мире, общепринятой антифиброгенной терапии не существует [2—4]. Традиционные китайские травяные лекарственные средства (ТКГМ) представляют большой интерес для лечения заболеваний печени, поскольку некоторые из них можно использовать в качестве терапевтических препаратов для лечения и профилактики фиброза печени. В настоящее время многие исследования сосредоточены на потенциальных антифиброгенных препаратах, которые использовались в качестве TCHM в течение тысяч лет [5].

Cistanche tubulosa W (семейство Orobanchaceae) — паразитическое растение, широко выращиваемое в южном районе Синьцзяна в Китае [6]. Люди используют его для укрепления почек, питания крови, расслабления кишечника и замедления старения без побочных эффектов, и он официально внесен в Китайскую фармакопею [7]. C. Tubulosa содержит множество активных компонентов, в том числе фенилэтаноидные гликозиды (CPhG), иридоиды и полисахариды. Среди множества активных компонентов C. tubulous основными характерными компонентами этого растения являются CPhG, обладающие рядом биоактивных свойств (антиоксидантное, антиусталостное, радиорезистентное и т. д.). В последние годы сообщалось, что CPhG обладают избыточным гепатопротекторным действием Hent и могут удалять радикалы дерева, защищать печеночные мембраны и проявлять иммунорегуляторные эффекты, ингибирование апоптоза, ингибирование экспрессии поверхностного антигена гепатита В (HBs Ag) и вируса гепатита В. активность репликации ДНК вируса гепатита В (HBeAg) и вируса гепатита В (HBV) и др. Уровень ДНК HBV является наиболее надежным показателем, напрямую отражающим активность репликации вируса, которая является ключевым фактором в определении естественного течения хронических инфекций HBV, мониторинг эффекта оральной противовирусной терапии и оценка прогноза острой и хронической инфекции ВГВ. Серологические показатели выявления ВГВ в основном включают HBsAg, HBeAg и др. [8—11]. Тем не менее, в литературе имеется мало сообщений об антифиброзных эффектах CPhG. Предыдущие исследования показали профилактическое и терапевтическое действие CPhG на фиброз печени у крыс, индуцированный бычьим сывороточным альбумином (BSA), но антифиброгенная активность CPhG и его основных мономеров (эхинакозид и актеозид, рис. 1) никогда не оценивалась in vitro.

органическая цистанхе трубчатая

2. Результаты

2.1. Количественное определение CPhG

CPhG вС. тубулозасодержат два гликозида фенилэтилового спирта: эхинакозид и актеозид, а их содержание в ЦФГ было обнаружено с помощью анализа ВЭЖХ (рис. 1) и составило 42,71 % 土 0,42 % и 14,27 % 土 0.18 процентов соответственно.

2.2. Ингибирующая активность CPhG, эхинакозида и актеозида в отношении HSC-T6

CPhG, эхинакозид и актеозид (62,5-500 мкг/мл) ингибировали жизнеспособность клеток HSC зависимым от концентрации образом. CPhG и актеозид продемонстрировали замечательную ингибирующую активность в отношении клеток HSC, при этом значения 50-процентного ингибирования активности роста клеток (IC50) составили 119,125 мкг/мл и 6,999 мкг/мл соответственно. Эхинакозид проявлял умеренную ингибирующую активность (IC50520,345 мкг/мл; таблица 1 и рисунок 2).

2.3. Клеточная токсичность CPhG, Echin acoside и Acteorida на HSC

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), стабильный цитоплазматический фермент, присутствующий во всех клетках, быстро высвобождается в супернатант клеточной культуры при повреждении плазматической мембраны. Ферментативная активность в культуральном супернатанте коррелирует с долей лизированных клеток [12]. Как показано в Таблице 2, при лечении различными концентрациями C PhG, эхинакозида и актеозида, хотя активность ЛДГ продемонстрировала небольшое увеличение по сравнению с группой, получавшей клеточный коэртрол, разница не была статистически значимой (p > 0,05). ), что указывает на то, что большинство клеточных мембран сохранили свою целостность, а ингибирование CPhG, эхинакозида и актеозида на HSC не связано с неспецифической клеточной токсичностью.

2.4. Влияние ЦФГ, эхинакозида и актеозда на пролиферацию ГСК, индуцированную TGF-^i

Пролиферация, активация и дифференцировка HSC регулируются множеством факторов. Среди различных факторов, участвующих в фиброзе печени, TGF{{0}} считается наиболее важным, поскольку он может активировать HSC, стимулировать дифференцировку миофибробластов, увеличивать синтез ECM и ингибировать деградацию ECM, а также высвобождать хемокины и цитокины, участвующие в фиброзе печени [13]. В этом исследовании, за исключением контрольной группы, стационарные ГСК стимулировали TGF-P1 in vitro для имитации образования раннего фиброза печени и для изучения влияния CPhG, эхинакозида и актеозида на TGF-p1- индуцированной пролиферации HSC. Как показано в Таблице 3, по сравнению с контрольной группой группа TGF-61 значительно стимулировала пролиферацию HSC (p < 0.01).="" по="" сравнению="" с="" группой="" tgf-p1,="" tgf-p1="" плюс="" cphg="" (tc)="" (50,="" 100="" мкг/мл,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" плюс="" эхинакозид="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" мкг/мл,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" плюс="" актеозид="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" мкг/мл,="" p="">< 0,05)="" заметно="" ингибировали="" пролиферацию="" hscs,="" индуцированные="" tgf-|3="" 1="" в="" разной="">

2.5. Экспрессия мРНК smad2)smad3 и smad7 после воздействия CPhG, охмакозида и актеазида на ГСК

Smad3 и smad2 являются ключевыми нижестоящими эффекторами пути передачи сигналов TTGF-p [14,15], а smad7 является ингибитором передачи сигналов smad. Теоретически повышенная экспрессия smad7 или пониженная экспрессия smad2/smad3 могут блокировать проведение сигнальных путей в TGF-p 1/smad. Как показано на рисунке 3, количественный ПЦР-анализ в реальном времени показал, что экспрессия мРНК smad2 и smad3 указывала на более низкий уровень, в то время как smad7 указывала на более высокие уровни в контрольной группе по сравнению с группой TGF-|31. В группе ТС (25, 50, 75,100 |дг/мл) уровень мРНК smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" и="" smad3="" (p="">< 0,01)="" были="" значительно="" снижены="" по="" сравнению="" с="" группой="" tgf-pf="" и="" даже="" были="" сходны="" с="" контрольной="" группой;="" в="" то="" же="" время="" уровень="" мрнк="" smad7="" был="" значительно="" повышен="" в="" группе="" tc="" (50,="" 75="" 100="" мкг/мл)="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01="" соответственно).="" однако;="" экспрессия="" smad7="" указывала="" на="" тенденцию="" к="" возрастанию="" в="" группе,="" получавшей="" tc="" 25="" мкг/мл,="" по="" сравнению="" с="" группой,="" получавшей="" tgf-p1="" (рис.="">

В то же время, по сравнению с группой TGF-p1, экспрессия мРНК smad2 и smad3 была значительно снижена в TE (62,5, 125, 250, 500 мкг). /мл) (p < 0.01),="" а="" экспрессия="" мрнк="" smad7="" была="" значительно="" повышена="" в="" группе="" te="" (125,="" 250="" 500="" мкг/мл)="" (p="">< 0,01)="" (рис.="" 4).="" .="" точно="" так="" же="" группа="" та="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" мкг/мл)="" также="" показала="" ту="" же="" тенденцию="" (рис.="">

2.6. Влияние CPhG, эхинакозида и ацеозидов на сигнальный путь T GF-^i/smad в HSC

Сигнальный путь TGF-p1/smad зависит от smad2, smad3, фосфо-smad2 (p-smad2), фосфо-smad3 (p-smad3) и smad7, где p-smad2, p-smad3 представляют собой активированные формы smad2 и smad3. В этом исследовании были проанализированы уровни белка omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 и smad7. Вестерн-блоттинг выявил повышение уровней smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 под действием TGF-p1 и ингибирование этого повышения под действием CPhG, эхинакозида и актеозида; тем временем анализ методом Весирн-блоттинга выявил повышение уровня smad7 с помощью CPhG, эхинакозида и актеозида. (рис. 6—8).

Как показано на рисунке 6, по сравнению с группой, получавшей c on2rol, экспрессия белков smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 была значительно увеличена, а экспрессия белка smad7 снизилась в группе, получавшей TGF-p1. В группе TC (25 , 50, 75, 100 мкг/мл) группы препаратов, smad/ (рис. 6A), p-smad2 (рис. 6B), smad 3 (рис. 6C), p-smad3 (рис. 6D) экспрессия была значительно ниже, чем в группе TGF-p1 (卩 <0,01), а экспрессия белка smad7 (рис. 6E) была выше, чем в группе TGF-S1 (p <0,01) (рис. 6).

В то же время после воздействия эхинакозида и актеозида на HSC измеряли экспрессию белков ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 и smad7. Как показано на рисунках 7 и 8, уровни экспрессии белков smad2, smad3, p-smad2 и p-smad3 были значительно подавлены (p < 0.05="" или="" p="">< 0.01.="" ),="" уровень="" экспрессии="" белка="" smad7="" был="" повышен="" (p="">< 0,01)="" по="" сравнению="" с="" группой="" tgf-p="" 1="" (рис.="" 7="" и="">

3. Обсуждение

Фиброз печени является одной из ведущих причин заболеваемости и смертности во всем мире, но в настоящее время для этого состояния доступны очень ограниченные терапевтические возможности, поэтому для нас очень важно искать потенциальные мишени для терапевтического вмешательства, чтобы предотвратить развитие фиброза печени. 16]. Недавно исследователи обнаружили, что различные растительные лекарственные средства обладают гепатопротекторным или антифибротическим действием. Многие TCHM, такие как таблетки Fufang Biejia Ruangan [17] и отвар Xiao-chai-hu (shosaiko to в Японии) [18,19], широко использовались для лечения фиброза печени в Китае, Корее и Японии в течение тысяч лет. C. Tubulosa содержит множество активных компонентов, включая CPhG, иридоиды и полисахариды. Как одна из эффективных материальных основ C. Tubulosa, CPhG обладают отличной гепатопротекторной активностью, но информация об антифиброзном действии GPhC и родственных соединений ограничена. В этом исследовании мы исследовали, как CPhG, эхинакозид и актеозид подавляют активацию HSC и блокируют проведение сигнального пути в TGF-p1/snaad в качестве потенциальных средств против фиброза печени in vitro.

Повреждение печени любой этиологии в конечном итоге приводит к активации ГСК, которые подвергаются трансдифференцировке в фиброгенные миофибробластоподобные клетки [20]. То есть миофибробласты

возникают в результате активации и пролиферации HSCs [21] и считаются медиатором формирования фиброза печени. По этой причине мы провели исследования in vitro, чтобы сравнить показатели жизнеспособности клеток HSC, подвергшихся воздействию CPhG, эхинакозида и актеозида. Результаты показали, что ингибирующее действие актеозида на ГСК было наиболее сильным, а эффект ЦФГ был лучше, чем у эхинакозида. CPhG, сыворотки, содержащие эхинакозид и актеозид, ингибировали пролиферацию HSC дозозависимым образом.

ЛДГ является цитоплазматическим ферментом живых клеток и в нормальных условиях не может проникать через клеточную мембрану. Когда клетки повреждены, проницаемость мембраны увеличивается, и ЛДГ высвобождается наружу клетки. Обычно ЛДГ позволяет определить степень повреждения клеток [{{0}}]. Исследование показало, что активность LDH в сыворотке, обработанной CPhG, эхинакозидом и актеозидом, показала лишь незначительное увеличение по сравнению с контрольной группой клеток, и разница не была статистически значимой (p > 0,05), что указывает на то, что большая часть клеточной мембраны сохранила свою целостность. , а ингибирование ГСК CPhG, эхинакозидом и актеозидом не связано с неспецифической клеточной токсичностью.

Когда происходит повреждение печени, активированные гепатоциты могут высвобождать TGF-pi, который, в свою очередь, активирует HSC-T6, следовательно, TGF-pi тесно связан с фиброзом [25-27]. В этом исследовании CPhG, эхинакозид и актеозид могут рассматриваться как привлекательная терапевтическая стратегия для ингибирования пролиферации HSC после стимуляции HSC с помощью wTGF-pi in vitro. Мы предполагаем, что CPhG, эхинакозид и актеозид могут использоваться в качестве своего рода лечения и/или профилактики фиброза печени и ингибировать образование раннего фиброза печени. Формирование фиброза печени представляет собой сложный процесс с многофакторным и многоклеточным участием. В этом патологическом процессе взаимодействия клетка-клетка, клетка-цитокины и клетка-матрикс образуют громоздкую сеть. В этой сети развитие фиброза печени может регулироваться различными сигнальными путями и средствами. TGF-pi является классическим активатором HSC и ключевым медиатором в патогенезе фиброза печени [28]. CPhG, эхинакозид и актеозид могут ингибировать экспрессию мРНК и белков, связанных с путем TGF-pi/smad, в HSC.

TGF-pi оказывает свое клеточное действие через сигнальный путь smad и считается ключевым медиатором в развитии фиброза и воспаления печени. При связывании TGF-pi с рецептором TGF-p-типа II киназа рецептора II типа фосфорилирует GS-домен рецептора TGF-p типа I, что приводит к активации рецептора типа I [29]. Посредством действия p-smad2 и p-smad3 на два остатка серина в мотиве SSXS их С-конца реакции ниже сигнального пути smad активируются за счет активации рецептора I типа [30]. P-smad2 и p-smad3 образуют олигомерные комплексы с smad4, затем проникают в ядро ​​и проявляют свою биологическую транскрипционную активность. Таким образом, белки smad передают сигналы непосредственно от рецепторной киназы в ядро ​​[3i]. С другой стороны, smad7 прочно связан с рецептором TGF-pi, что приводит к неспособности smad 2/3 к активации, а также к ингибированию путей передачи сигнала [32]. Smad7 может ингибировать p-smad2 и p-smad3, ядерную транслокацию активированных комплексов smad и активацию (CAGA) (9)-MLP-Luc, что приводит к снижению экспрессии коллагена I и полному ингибированию передачи сигнала TGF-p. [33,34]. Наши результаты показали, что CPhG, эхинакозид и актеозид могут снижать экспрессию мРНК smad2 и smad3 и повышать экспрессию мРНК smad7; ингибируют экспрессию белков smad2, p-smad2, smad3 и p-smad3 и усиливают экспрессию белка smad7, предполагая, что CPhG, эхинакозид и актеозид также играют роль в ингибировании активации HSC и, таким образом, ингибируют фиброз печени, подчеркивая потенциальный антифиброзный эффект. механизм.

Последовательность гепатопротекторных эффектов трех исследуемых агентов была следующей: актеозид > ЦФГ > эхинакозид. Для дальнейшего выяснения причин различий в механизме защиты КФГ, эхинакозида и актеозида от фиброза печени была проанализирована их химическая структура. Фрагмент гликозида фенетилового спирта, по-видимому, является важной структурой для гепатопротекторного эффекта [35]. Актеозид (C29H36Oi5) — двойной гликозид, а эхинакозид (C35H46O20) — тригликозид, т. е. эхинакозид имеет в своей структуре дополнительный гликозид по сравнению с актеозидом, что приводит к увеличению его пространственных размеров. Гепатозащитная или ингибирующая ГСК активность актеозида лучше, чем у эхинакозида, что может быть связано с наличием стерических затруднений.

защита печени: экстракт цистанхе

4. Экспериментальная часть

4.1. Химикаты и реагенты

TGF-pi был приобретен у Peprotech (Роки-Хилл, Нью-Джерси, США). Клеточная линия HSC-T6 была приобретена у Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Ухань, Китай). Диметилсульфоксид (ДМСО) был приобретен у Sigma Inc. (Сент-Луис, Миссури, США). Праймеры Smad2, smad3 и smad7 были произведены Шанхайской биологической и технологической компанией Sangon (Шанхай, Китай). Набор для синтеза первой цепи кДНК Revert Aid был приобретен у Thermo Scientific (Шанхай, Китай). Набор для ПЦР Quantifast SYBR green был приобретен у QIAGEN GmbH (Hilden, Германия). Антитело p-smad2 (ser465/467), кроличье mAb Smad3 (C67H9) и p-smad3 (ser423/425) кроличье mAb были приобретены у Cell Signaling Technology (Бостон, Массачусетс, США). Антитело Smad7 было приобретено у Boster (Ухань, Китай). Поликлональное антитело Smad2 и моноклональное антитело против актина были приобретены у Proteintech (Ухань, Китай). Обнаружение первичных антител проводили с использованием раствора антител 2 степени (конъюгированные Alk-Phos, антикроличьи) и раствора антител 2 степени (конъюгированные Alk-Phos, антимышиные), приобретенных у Invitrogen™ (Карлсбад, Калифорния, США). Набор для анализа лактатдегидрогеназы был получен от Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Нанкин, Китай).

4.2. Растительный материал

C. Tubulosa была собрана в Тулуфане, в Синьцзян-Уйргурском автономном районе Китая, в мае 2006 г. Растительный материал был идентифицирован как C. Tubulosa Цзян Хе, Институт Материа Медика, Синьцзян. Образец ваучера был депонирован в Институте Materia Medica Синьцзяна в Китае.

4.3. Выделение и очистка ЦФГ и его соединений.

Высушенные и нарезанные корневища C. Tubulosa (6,0 кг) трижды последовательно экстрагировали с обратным холодильником 70% этанолом (4,8 л), а затем из объединенных экстрактов удаляли растворитель. с получением этанольного экстракта (1,146 кг). Экстракты этанола очищали смолой AB-8 с получением сырого экстракта фенилэтанолгликозидов (CPhGs). После растворения в воде экстракт очищали адсорбционной хроматографией на макропористой смоле с AB-8 с получением суммы гликозидов фенилэтанола из C. Tubulosa (CPhGs, 210 г). CPhG наносили на колонку ODS OP{{10}} и последовательно элюировали смесями MeOH-H2.(0:1 -^1:0). Элюаты объединяли в пять субфракций по данным ТСХ с использованием системы растворителей CHCh-MeOH-H?.(6:4:0,5). Пятна визуализировали после распыления 1% FeCih. Различные фракции неоднократно очищали с помощью колоночной хроматографии Sephadex LH-20 с метанолом в качестве элюента, и из CPhG выделяли два гликозида фенилэтанола. Их структура была подтверждена как эхинакозид (C35H46O20) и актеозид (C29H36O15) с использованием МС, 1H- и MC-ЯМР [35], чистота которых была определена как 99,17% и 98,92%, соответственно, с помощью УФ-ВЭЖХ. Структуры эхинакозида и актеозида показаны на фигуре 9.

4.5. Количественное определение CphG

Жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) (LC {{0}}A HPLC, Shimadzu Co., Киото, Япония) использовали для анализа содержания эхинакозида и ктеозида в CPhG. Использовали колонку Phenomenex Gemini ODS (250×4,6 мм, 5 мкм) при 30°С. Изократическую подвижную фазу, состоящую из метанола-ацетонитрила-1% уксусной кислоты (15:10:75, об./об./об.), использовали в течение 40 минут при скорости потока 0,6 мл/мин, с УФ-излучением. обнаружение при 334 нм.

4.6. Культура клеток

Клетки HSC культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (с высоким содержанием глюкозы) (DMEM, Пекин, Китай) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Gibco, Карлсбад, Калифорния, США), 10 0 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (HyClone, Logan, UT, USA) во влажном инкубаторе при 37°С с 5% СО2. Эти клетки регулярно пересевали 0,25-процентным (1x) раствором трипсина (HyClone, Logan, UT, USA) и среду меняли каждые 2 дня. Первоначально клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в течение 48 часов. Затем среду заменяли на DMEM без FBS, чтобы голодать клетки в течение 12 часов. Эти клетки размножали в течение 48 ч. Через 48 ч сыворотку подвергали голоданию с 0,5% FBS в течение 12 ч перед добавлением 5 нг/мл TGF-&1.

4.7. Определение значений IC50

После инкубации в течение ночи в голодной среде, содержащей {{0}},5% FBS, клетки HSC высевали в 96-луночный планшет при плотности 5 x 104 клеток/мл в течение 24 часов. Клетки ГСК обрабатывали ЦФГ, эхинакозидом и актеозидом в различных концентрациях (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 и 500 мкг/мл) в течение 48 ч. Каждая концентрация имела четыре лунки. В конце лечения 20 мкл МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид] (Sigma; 5 мг/мл) и инкубировали еще 4 часа. В каждую лунку после удаления супернатанта добавляли ДМСО (200 мкл). После встряхивания планшета в течение 10 минут на шейкере значения IC50 были получены путем измерения поглощения при длине волны 490 нм с использованием прибора для мечения ферментов (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), этот анализ был проведен в трех экземплярах. Значения IC50 для CPhG, эхинакозида и актеозида составили 119,125, 520,345 и 6,999 мкг/мл соответственно.

4.8. Эффекты ингибирования клеточной пролиферации и жизнеспособность клеток

Клетки ГСК подвергали воздействию различных концентраций CPhG (25, 50, 100 мкг/мл), эхинакозида (125 250 500 мкг/мл) и актеозида (1,5, 3, 6 мкг/мл). Различные концентрации CPhG, эхинакозида и актеозида наносили на планшет в четыре последовательных лунки и инкубировали в течение 48 часов. Эффект ингибирования клеточной пролиферации и уровень жизнеспособности клеток (основанный на измерении активности ЛДГ, высвобождаемой из поврежденных клеток в супернатант [36]) определяли с помощью МТТ-анализа. Скорость ингибирования рассчитывали по следующей формуле [37]:

Степень ингибирования (в процентах) "[1 - (среднее поглощение экспериментальной группы/среднее поглощение контрольной группы)] x 100 процентов

Согласно инструкции к набору,

ЛДГ (Е/л) {{0}} (измеренная ОП — контрольная ОП)/(стандартная ОП — контрольная ОП) x 0,2 ммоль/л x 1000

Наше предварительное исследование показало, что CPhG, эхинакозид и актеозид не влияли на жизнеспособность клеток.

4.9. Антипролиферативное действие TGF-^1

Долгое время считалось, что HSC, активированные TGF-p1, связаны с фиброзом печени, и ингибирование роста HSC было предложено в качестве метода лечения фиброза печени [36,38]. Антипролиферативное действие CPhG, эхинакозида и актеозида на ГСК, активированные TGF-p1, определяли с помощью анализа МТТ [39]. Используя процедуры и концентрации лекарств, как описано,

экспериментальные группы включали контрольную группу, группу TGF-pi, группы TGF-pi плюс различные концентрации лекарственного средства. Все группы клеток, кроме контрольной, культивировали в среде DMEM, содержащей 5,0 нг/мл TGF-p1 (без FBS) в течение 24 часов. Ингибиторную активность в отношении пролиферации клеток рассчитывали как 100-кратное (поглощение обработанного соединения — поглощение фонового света)/(поглощение модели — поглощение фонового света).

4.10. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Уровень экспрессии мРНК smad2, smad3 и smad7 определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Для определения экспрессии мРНК в клетках HSC клетки (5 x 1{8}}4 клеток) высевали в шестилуночные планшеты с 3,0 мл DMEM с 10% FBS и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5 процентов CO2. После замены питательных сред на бессывороточную DMEM в лунки добавляли ХФГ (100, 50, 25 мкг/мл), эхинакозид (500, 250, 125 мкг/мл) и актеозид (6, 3,1,5 мкг/мл). После инкубации в течение 48 ч с CPhG и композициями мономеров тотальную РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и энергично перемешивали с хлороформом в течение 15 с. После выдерживания при комнатной температуре в течение 3 мин лизат центрифугировали при 12,000 xg в течение 15 мин при 4°С. РНК в водной фазе осаждали изопропанолом, а верхнюю водную фазу переносили в новую микроцентрифужную пробирку. РНК осаждали добавлением 0,75% этанола, после чего микроцентрифужную пробирку центрифугировали при 12,{34}} xg при 4 градусах не более 5 мин. Супернатант удаляли, а РНК сушили при комнатной температуре в течение 5-10 мин. Праймеры (Sangon) были разработаны с использованием Batch Primer 3 и перечислены в таблице 4. Результаты были нормализованы к мРНК гена домашнего хозяйства p-actin в качестве внутреннего контроля и представлены в виде относительных уровней мРНК. Реакции проводили с 8 мкл iQ SYBR Green Supermix, парой праймеров 1 10 пМ, 8,5 мкл дистиллированной воды и 2,5 мкл кДНК.

Каждую полимеразную цепную реакцию проводили при следующих условиях: 95° в течение 3 мин, затем 40 циклов по 10 с при 95°, 30 с при 55° и 10 с при 55° -95 для удлинения, после чего одно измерение флуоресценции. Окончательные результаты были описаны с помощью относительных значений (2_AACt). Расчет и анализ выполняли с помощью системы обнаружения ПЦР в реальном времени iQ5.

4.11. Вестерн-блот-анализ

Экстракты цельных клеток готовили с использованием буфера для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) с 1-процентным ингибитором протеазы Halt и 1-процентным коктейлем ингибитора фосфатазы Halt (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Общий белок использовали для обнаружения smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 и smad7. Концентрацию белка измеряли и количественно определяли по методу Бредфорда. Белок (10-30 Rg) разделяли на 10% геле SDS-PAGE и переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) (Millipore, Бостон, Массачусетс, США). Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре 5% бычьим сывороточным альбумином и первичными антителами (поликлональное антитело smad2, антитело p-smad2, моноклональные антитела кролика smad3 и моноклональное антитело кролика p-smad3, разведение 1:1000; кроличьи моноклональные антитела smad7, 1 разведение :200, моноклональное антитело против актина, разведение 1:5000) инкубировали при 4 градусах в течение ночи. Соответствующий Alk-Phos. конъюгированные вторичные антитела инкубировали при комнатной температуре. Наконец, мембраны трижды промывали солевым раствором 1 x Tris-HCl с 0,1% Tween 20, а сигналы сканировали и визуализировали с помощью системы визуализации GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Денситометрический анализ интересующих белков был проведен и нормализован к p-актину с помощью программного обеспечения GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). р-актин использовали в качестве внутреннего контроля.

4.12. Статистический анализ

Данные выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения SPSS 16.0 (Синьцзянский медицинский университет). Для анализа значений IC50 использовали пробит-анализ. Достоверность различий рассчитывали с помощью одностороннего теста ANOVA, и значения с p < 0,05="" считали="" статистически="">

5. Выводы

В заключение, CPhG из C. Tubulosa и его компоненты эхинакозид и актеозид проявляют значительный антифибротический эффект. Среди них активность актеозида является самой сильной, в то время как активность CPhG находится между двумя соединениями. Ингибирование активации передачи сигналов TGF-p1/Smad может быть основным механизмом, с помощью которого CPhG защищают от хронического заболевания печени, связанного с фиброзом, а эхинакозид и актеозид являются эффективной основой антифиброзного материала C. Tubulosa.

Благодарности:Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (81260624). Авторы хотели бы выразить свою искреннюю благодарность профессору Тао Лю за его улучшение письма в этой статье.

Вклад автора:TL, JZ, S.-PY, LM и S.-LZ задумали и разработали эксперименты. S.-PY, TL и JZ проанализировали данные. С.-П.Я. и Ж.З. написали рукопись. TL, LM и JZ рассмотрели рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Конфликт интересов:Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

использованная литература

1. Субрамониам, А.; Пушпангадан, П. Развитие фитопрепаратов при заболеваниях печени. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31, 166-175.

2. Фридман, С.Л. Механизмы заболевания: Механизмы фиброза печени и терапевтические последствия. Нац. клин. Практика. Гастроэнтерол Гепатол. 2004,1, 98-105. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

3. Фридман, С.Л.; Ролл, Ф.Дж.; Бойлз, Дж.; Бисселл, Д.М. Печеночные липоциты: основные коллагенпродуцирующие клетки нормальной печени крысы. проц. Натл. акад. науч. США 1985, 82, 8681-8685. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

4. Фридман, С.Л.; Бансал, М.Б. Реверсия фиброза печени - факт или фантазия? Гематология 2006, 43, S82-S88. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

5. Ахмад, А.; Ахмад, Р. Понимание механизма фиброза печени и потенциальных терапевтических подходов. Саудовская J. Гастроэнтерол. 2012, 18, 155-167. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

6. Питер, Х.; ворон; Чжан, Л.Б. Orobanchaceae Ventenat. Во «Флоре Китая», 23-е изд.; Редакционный комитет Флора Китая: Китайская академия наук, Пекин, Китай, 2013; стр. 1-16.

7. Китайская фармакопея Министерства санитарии Китайской Народной Республики. Китайская фармакопея; Часть 1; Издательство химической промышленности: Пекин, Китай, 2010; п. 126.

8. Ли, Дж.; Хуанг, Д .; Он, Л. Влияние роуконгронга (Herba Cistanches Deserticolae) на репродуктивную токсичность у мышей, индуцированную гликозидом Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). Дж. Традит. Подбородок. Мед. 2014, 34, 324-332. [Перекрестная ссылка]

9. Син, Ю.; Ляо, Дж .; Тан, Ю .; Чжан, П .; Тан, К.; Национальные институты здравоохранения США.; Ву, Х .; Ли, Н .; Цзя, X. Ингибиторы АПФ и агрегации тромбоцитов из Tamarix hohenackeri Bunge (растение-хозяин Herba Cistanches), растущего в Синьцзяне. Фармакогн. Маг. 2014,10,111-118. [В паблике]

10. Цзя, Ю; Гуань, Q .; Цзян, Ю .; Салх, Б.; Го, Ю .; Ту, П.; Du, C. Облегчение колита, вызванного декстрансульфатом натрия, у мышей с помощью обогащенного эхинакозидом экстракта Cistanche tubulosa. Фитотерм. Рез. 2014, 28, 110-119. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

11. Вонг, Х.С.; Ko, KM Herba Cistanches стимулирует клеточный окислительно-восстановительный цикл глутатиона за счет активных форм кислорода, образующихся в результате митохондриального дыхания в кардиомиоцитах H9c2. фарм. биол. 2013, 51, 64-73. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

12. Мартин А.; Клайнс, М. Кислая фосфатаза: конечная точка для испытаний на токсичность in vitro. Витро Селл. Дев. биол. 1991, 27, 183-184. [Перекрестная ссылка]

13. Лечуга, К.Г.; Эрнандес-Назара, З.Х.; Домингес Росалес, JA; Моррис, ER; Ринкон, Арканзас; Ривас-Эстилла, AM; Эстебан-Гамбоа, А.; Rojkind, M. TGF-01 модулирует экспрессию матриксной металлопротеиназы-13 в звездчатых клетках печени с помощью сложных механизмов, включающих p38MAPK, PI3-киназу, AKT и p70S6k. Являюсь. Дж. Физиол. Гастроинтест Физиол печени. 2004, 287, G974-G987. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

14. Нгуен, Дж.; Тан, С.Ю.; Нгуен, Д.; Alliston, T. Load регулирует образование кости и экспрессию склеростина посредством TGFp-зависимого механизма. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

15. Песах, М.; Марэ, Дж.; Прюнье, К.; Ферран, Н.; Лаллеманд, Ф .; Мовьел, А .; Atfi, A. C-Jun связывается с онкобелком Ski и подавляет транскрипционную активность Smad2. Дж. Биол. хим. 2002, 277, 29094-29100. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

16. Дин Н.; Ю, РТ; Субраманиам, Н.; Шерман, Миннесота; Уилсон, К.; Рао, Р .; Леблан, М.; Коултер, С.; Он, М.; Скотт, К.; и другие. Геномная цепь рецептора витамина D/SMAD блокирует печеночный фиброзный ответ. Ячейка 2013 153, 601-613. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

17. Ян, Франция; Фанг, ЧБ; Лу, Дж. С. Влияние таблеток Fufang Biejia Ruangan на фиброз печени in vivo и in vitro. Мировой Ж. Гастроэнтерол. 2013,19, 5326-5333. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

18. Сакаида, И.; Хиронака, К.; Кимура, Т .; Тераи, С.; Ямасаки, Т .; Окита, К. Фитотерапия Шо-сайко-то (TJ -9) увеличивает экспрессию матриксных металлопротеиназ (ММР) при сниженной экспрессии тканевого ингибитора металлопротеиназ (ТИМП) в звездчатых клетках крыс. Жизнь наук. 2004, 74, 2251-2263. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

19. Чен М.; Чен, Дж.; Цай, К.; Ван, В .; Чанг, Д.; Ту, ДГ; Hsieh, HY Роль TGF-01 и цитокинов в модуляции фиброза печени с помощью Sho-saiko-to в модели перевязанных желчных протоков крысы. Дж. Этнофармакол. 2005, 97, 7-13. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

20. Боларин Д.М.; Azinge, EC Биохимические маркеры, внеклеточные компоненты при фиброзе и циррозе печени. Ниг. QJ Хосп. Мед. 2007, 17, 42-52. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

21. Конг Д.; Чжэн, С .; Лу, Ю. Источник и роль миофибробластов в фиброзе печени. Подбородок. Фармакол. Бык. 2011, 27, 297-300.

22. Де Лавор, MSL; Бинда, Н.С.; Фукусима, ФБ; Калдейра, FMC; Да Силва, Дж. Ф.; Сильва, директор по маркетингу; де Оливейра, км; Мартинс Бде, К.; Торрес, ББ; Росадо, ИК; и другие. Модель ишемии-реперфузии в спинном мозге крыс: исследование жизнеспособности клеток и передачи сигналов апоптоза. Междунар. Дж. Клин. Эксп. Патол. 2015, 8, 9941-9949. [В паблике]

23. Бахадар, Х.; Макбул, Ф .; Ниаз, К .; Абдоллахи, М. Токсичность наночастиц и обзор современных экспериментальных моделей. Иран Биомед. Ж. 2016, 20, 1-11. [В паблике]