Экстракт семян Phoenix Dactylifera L. проявляет антиоксидантное действие и ослабляет меланогенез

Хьюи-Чун Хуан1 , Шр-Шиуан Ван2, Цанг-Чи Цай3, Ван-Пин Ко3 и Цон-Мин Чанг2,*

Абстрактный:Справочная информация: механизм действия экстракта семян Phoenix dactylifera в уходе за кожей никогда не изучался. Методы: семена P. dactylifera L. экстрагировали ультразвуковой экстракцией. Антиоксидантные характеристики экстракта определяли по 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилу (DPPH) и 2,2'-азино-ди-(3-этилбензтиазолинсульфоновой кислоте) (ABTS plus). анализы и методы очистки. Также были исследованы общее содержание фенолов, восстановительная способность, способность к хелатированию ионов железа (II) и внутриклеточные активные формы кислорода (АФК). Влияние экстракта семян P. dactylifera L. на меланогенез оценивали спектрофотометрически с помощью анализа активности тирозиназы грибов, определения активности внутриклеточной тирозиназы и содержания меланина. Уровни экспрессии белков, связанных с меланогенезом, анализировали вестерн-блоттингом. Результаты: Результаты показали, что P.дактилифера Л.экстракт семян проявлял явную антиоксидантную способность и значительно снижал внутриклеточное содержание АФК при концентрациях {{0}},245 и 0,49 (мг/мл). Кроме того, экстракт снижал экспрессию рецептора меланокортина 1 (MC1R), фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмом (MITF), тирозиназы, родственного тирозиназе белка -1 (TRP1) и белка, родственного тирозиназе -2 ( TRP2) и ингибировал меланогенез в клетках B16F10. Выводы. Наши результаты показали, что экстракт семян P. dactylifera L. ослаблял меланогенез в клетках B16F10 за счет подавления сигнальных путей протеинкиназы A (PKA). Следовательно, экстракт можно использовать в качестве отбеливающего агента в средствах по уходу за кожей.

Ключевые слова: Phoenix dactylifera;тирозиназа; меланин; РОС; ПКА

цистанхе фарма специальныйявляется типом отбеливающего кожу агента.

1. Введение

Антиоксиданты широко применяются для профилактики или лечения заболеваний, связанных с окислительным стрессом, в косметической и дерматологической областях. За последние несколько десятилетий антиоксиданты также использовались в косметической промышленности для предотвращения или замедления старения кожи. Сообщается, что свободные радикалы и активные формы кислорода (АФК) связаны с рядом заболеваний, таких как старение и возрастные заболевания [1]. Интересно, что повреждение кожи свободными радикалами, вызванное стрессом УФ-облучения и АФК, играет важную роль в процессе фотостарения кожи [2,3]. Сообщается, что антиоксиданты мешают процессу окисления, удаляя свободные радикалы и АФК или хелатируя окислительно-каталитические металлы [4]. Следовательно, произошло резкое увеличение числа применений антиоксидантов или антиоксидантных пищевых добавок для уменьшения окислительного стресса или повреждения, вызванного окислительным стрессом в организме [5,6]. Однако было показано, что некоторые химические антиоксиданты, в том числе аскорбат натрия, трет-бутилгидроксианизол (ВНА), эриторбат натрия и трет-бутилгидрокситолуол (ВНТ), способствуют канцерогенному воздействию на здоровье человека [7]. Таким образом, в последние десятилетия наблюдается быстрый рост исследований природных антиоксидантов растительного происхождения. Важно отметить, что повышение уровня АФК может ускорить пигментацию кожи. Среди АФК, полученных из меланоцитов и кератиноцитов, оксид азота, NO, стимулирует синтез меланина за счет повышения уровня экспрессии белка тирозиназы и родственного тирозиназе белка 1 (TRP1) [8,9]. Влияние АФК на выработку меланина было изучено с использованием различных антиоксидантов, таких как N-ацетилцистеин, для отмены действия УФ-индуцированного -меланоцитостимулирующего гормона (-МСГ) [10].

Меланин вырабатывается и секретируется меланоцитами, которые распределены в базальном слое эпидермиса кожи [11]. Первыми двумя этапами пути меланогенеза у человека являются гидроксилирование L-тирозина до 3-4-дигидроксифенилаланина (L-ДОФА) и окисление L-ДОФА до о-допахинона. Тирозиназа (КФ 1.14.18.1) является ферментом, ограничивающим скорость, который катализирует обе первые две реакции во время меланогенеза [12]. Меланин играет жизненно важную роль в защите кожи от повреждения солнечным ультрафиолетом (УФ), а также отвечает за окраску волос, кожи и глаз. Сообщалось о различных дерматологических нарушениях, таких как пигментные пятна, меланодермия, поствоспалительная меланодермия, веснушки и участки актинического повреждения, возникающие в результате накопления избыточного уровня эпидермального меланина [13]. Ингибиторы синтеза меланина все чаще применяются в продуктах по уходу за кожей для лечения или профилактики нарушений гиперпигментации кожи [14,15]. Кроме того, антиоксиданты, такие как арбутин или койевая кислота [16], использовались для лечения гиперпигментации [17]. В последнее время косметика для отбеливания кожи составляет большую часть косметических продуктов. Эти средства для отбеливания кожи широко используют не только женщины со смуглой кожей, но и те, кто пытается справиться с темными пятнами на коже, возникающими из-за ультрафиолета, беременности или преклонного возраста.

Меланогенез регулируется множеством факторов. Например, сообщалось, что родственный тирозиназе белок-1 (TRP1), фактор транскрипции, ассоциированный с микрофтальмом (MITF), и родственный тирозиназе белок-2 (TRP2) регулируют выработку меланина [18–20]. ]. Рецептор меланокортина 1 (MC1R) также играет важную роль в синтезе меланина, индуцированном -MSH [21]. Существует несколько сигнальных путей, участвующих в производстве меланина. Среди различных сигнальных путей, регулирующих выработку меланина, активация циклического АМФ (цАМФ)-опосредованная протеинкиназа А (ПКА) играет критическую роль в регуляции меланогенеза [22]. В сигнальном пути цАМ-ПКА цАМФ индуцирует активацию ПКА [23], за которой следует фосфорилирование белка, связывающего элемент ответа цАМФ (CREB). CREB представляет собой внутриклеточный фактор транскрипции, который стимулирует экспрессию гена фактора микрофтальмии (MITF), играющего важную роль в меланогенезе. MITF представляет собой транскрипционный фактор, который связывается с промоторными областями меланогенных генов тирозиназы, TRP1 и TRP2, повышая их экспрессию [24,25]. После этого внутриклеточное содержание меланина увеличивается [26]. Сообщалось, что -МСГ повышает уровень цАМФ и обычно применяется для активации фосфорилирования CREB, а затем для повышения уровня белка MITF [27].

Экспрессия MITF регулируется несколькими сигнальными путями. N-концевая киназа c-Jun (JNK) и митоген-активируемая протеинкиназа p38 (MAPK) участвуют в активации экспрессии MITF и последующем увеличении экспрессии тирозиназы. Сигналы активации внеклеточной реактивной киназы (ERK) также увеличивают фосфорилирование CREB и последующую экспрессию MITF, что модулирует синтез меланина [28,29]. Следовательно, сообщалось, что несколько агентов для отбеливания кожи ингибируют транскрипционную активность MITF за счет снижения уровней экспрессии белка тирозиназы, TRP1 и TRP2 посредством подавления опосредованного p38MAPK фосфорилирования MITF. Кроме того, было описано, что путь ERK участвует в регуляции MITF во время меланогенеза [30,31]. Активация ERK фосфорилирует MITF, что приводит к деградации MITF, что приводит к снижению содержания меланина [32,33].

Окислительный стресс может быть результатом либо перепроизводства АФК, либо снижения антиоксидантной защиты [1]. Поиск и применение природных антиоксидантов остаются в центре внимания многочисленных исследовательских групп по всему миру. В последнее время растет интерес к исследованиям и разработкам фитохимических веществ, таких как природные антиоксиданты и фенольные соединения из различных природных источников, которые можно использовать в качестве нутрицевтиков, антивозрастной косметики и лекарственных средств [34]. Phoenix dactylifera L. — одна из основных плодовых культур, выращиваемых на Ближнем Востоке и в Северной Африке [35,36]. В предыдущих исследованиях сообщалось, что плоды P. dactylifera L. обладают антиоксидантной, антимикробной и противовоспалительной активностью, поглощающей свободные радикалы [37,38]. Функциональные эффекты P. dactylifera L. ограничиваются не только самими плодами, но и их семенами, которые являются своего рода побочным продуктом плодов [39,40]. Благодаря своим антиоксидантным свойствам экстракты семян P. dactylifera L. могут служить источником антиоксидантных веществ, которые действуют против окислительного стресса [41–43]. Однако было проведено несколько исследований по применению семян P. dactylifera L. для разработки космецевтических продуктов. Эти семена обычно выбрасываются как отходы, но здесь подчеркивается их значение как функционального косметического ингредиента. На сегодняшний день не было сообщений о механизме действия экстракта семян P. dactylifera L. в области косметики по уходу за кожей или о влиянии экстракта семян на выработку меланина. В центре внимания настоящего исследования было определение потенциала экстракта семян P. dactylifera L. в качестве ингибитора меланогенеза для косметической промышленности.

Механизмы, лежащие в основе ингибирующего действия экстракта семян P. dactylifera L. на меланогенез, еще не исследованы. Целью настоящего исследования было изучение антиоксидантных характеристик и потенциальных механизмов действия экстракта семян P. dactylifera L. на меланогенез путем изучения регуляторов транскрипции MITF и фосфорилирования регуляторов сигнальных путей MAPK и PKA.

свежий цистанхе

2. Материалы и методы

2.1. Химикаты и реагенты

Химические реактивы, использованные в исследовании, были приобретены у Sigma-Aldrich Chemical Co. (Сент-Луис, Массачусетс, США). Антитела были получены от Santa Cruz Biotech (Санта-Крус, Калифорния, США), а реагент ECL был получен от Millipore (Биллерика, Массачусетс, США).

2.2. Приготовление и экстракция экстракта семян P. dactylifera

Сушеные плоды P. dactylifera L. были собраны в 2019 из традиционных магазинов, расположенных в городе Медина, Саудовская Аравия. Семена P. dactylifera L. полностью промывали, выдерживали на солнце, сушили на воздухе в течение суток, а затем сушили при 80 ◦C в течение 2 ч в сушильном шкафу. Обезвоженные семена измельчали ​​до мелкого порошка (#50 меш) с помощью специальной мельницы (ультрацентробежная мельница и просеивающая машина Retsch, тип ZM1, Хаан, Германия). Порошок собирали в герметичную стеклянную бутылку и хранили при 25°С до использования. Измельченный высушенный порошок семян P. dactylifera L. (2 г) помещали в экстракционный стакан, содержащий 10 мл дистиллированной воды. Затем была проведена ультразвуковая экстракция с помощью модели ULTRAsonikTM 57H (250 Вт, C и A, продажи промышленных товаров, Юкайпа, Калифорния, США). Рабочая частота 45 кГц в течение 30 мин. После экстракции образцы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 50 мин при 25 ◦C на Eppendorf Centrifuge 5810 R (Гамбург, Германия). Супернатанты собирали и фильтровали через нейлоновый фильтр (размер пор: 0,45 мкм) и фильтрат концентрировали до 9,8 мг/мл.

2.3. Ультраэффективная жидкостная хроматография (UPLC) Анализ экстракта семян P. dactylifera и феруловой кислоты

Экстракт семян P. dactylifera анализировали с использованием ACQUITY UPLC класса H с матричным фотодиодным детектором (Waters, Милфорд, Массачусетс, США). Колонка представляла собой колонку ACQUITY UPLC BEH C18, 130 Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 100 мм. Подвижная фаза А представляла собой 0,5% уксусную кислоту, а подвижная фаза В представляла собой ацетонитрил. Для моментов времени 0 и 5 мин процентное соотношение А/В составляло 95/5; в течение 20 мин процентное соотношение А/В составляло 5/95; для моментов времени 21 и 25 мин процентное соотношение А/В составляло 95/5. В качестве положительного стандарта использовали феруловую кислоту (1 м.д.).

2.4. Анализ поглощающей активности DPPH

В этом анализе витамин С ({{0}},5 мг/мл) и BHA (0,1 мг/мл) использовали в качестве антиоксидантных стандартов. Экстракт семян P. dactylifera L. в различных концентрациях (0.0049, 0,0245 и 0,049 мг/мл) добавляли к 2,9 мл раствора DPPH (60 мкМ). Антиоксидантные компоненты в экстракте семян могут отдавать водород DPPH и превращать DPPH в восстановленную форму. Возникающее в результате уменьшение поглощения при 517 нм регистрировали с помощью спектрофотометра UV-Vis [44].

2.5. Анализ ABTS plus очищающей способности

ABTS плюс очищающая способность экстракта семян P. dactylifera L. сравнивалась с таковой у витамина С ({{0}},9 мг/мл) и BHA ({{10}}). 9 мг/мл). Для этого анализа использовали ABTS plus. Катион сначала получали реакцией раствора ABTS (7 мМ) с персульфатом калия (2,45 мМ), и перед использованием смесь выдерживали в темноте не менее 6 ч. Поглощение при 734 нм измеряли через 10 мин после смешивания различных концентраций экстракта семян (0,0098, 0,049 и 0,098 мг/мл) с 1 мл раствора ABTS plus [45].

2.6. Определение общего содержания фенолов

Общее содержание фенолов определяли с помощью реактива Фолина-Чокальтеу [46], в качестве положительного стандарта использовали галловую кислоту (2 мкг/мл). Различные концентрации экстракта семян P. dactylifera L. (0.0196, 0.098 и 0,196 мг/мл) готовили в 80-процентном метаноле; 100 мкл экстракта переносили в пробирку, добавляли 0,5 мл реактива Фолина–Чокальтеу (предварительно разбавленного в 10-крата деионизированной водой) и перемешивали. Смесь оставляли при комнатной температуре на 5 мин; Добавляли 1,5 мл 20-процентного карбоната натрия. После выдерживания при комнатной температуре в течение 2 ч оптическую плотность определяли при 760 нм с помощью спектрофотометра УФ-видимого диапазона.

2.7. Определение снижающей способности

Витамин С ({{0}}.008 мг/мл) или ВНА (4,8 мг/мл) использовали в качестве положительных стандартов в этом анализе. Восстанавливающую способность экстракта семян определяли по методу, описанному Ояйдзу [47]. Различные концентрации экстракта семян P. dactylifera L. (0.0073, 0,036, 0,073 мг/мл) смешивали с фосфатным буфером (2,5 мл, 0,2 М, pH 6,6). ) и феррицианид калия [K3Fe(CN)6] (2,5 мл, 1% мас./об.). Смесь инкубировали при 50°С в течение 20 мин. К смеси добавляли трихлоруксусную кислоту (2,5 мл, 10% мас./об.), затем смесь центрифугировали при 1000×g в течение 10 мин. Верхний слой раствора (2,5 мл) смешивали с дистиллированной водой (2,5 мл) и FeCl3 (0,5 мл, 0,1% мас./об.) и измеряли оптическую плотность при 700 нм.

2.8. Измерение хелатирующей способности ионов железа (II)

Для измерения хелатирующей способности плюс-иона Fe2 экстракта семян P. dactylifera L. ЭДТА (0.02, 0.04, и { {10}}.08 мг/мл) использовали в качестве положительного стандарта. Различные концентрации экстракта семян (0.0196, 0,098 и 0,196 мг/мл) добавляли к раствору FeCl2 (0,05 мл, 1 мМ). Реакционную смесь реагировали с феррозином (0,1 мл, 1 мМ), затем смесь доводили до 1 мл метанолом и инкубировали при 25°С в течение 10 мин. Поглощение реакционной смеси измеряли при 562 нм [48].

2.9. Анализ жизнеспособности клеток

Анализ жизнеспособности клеток проводили методом МТТ [49]. Клетки подвергали воздействию различных концентраций экстракта семян P. dactylifera L. (0.049, 0.245 и 0,49 мг/мл) в течение 24 ч при 37 ◦C. и 5% CO2 во влажном инкубаторе, и в лунки добавляли раствор МТТ. Нерастворимое производное МТТ солюбилизировали смесью этанол-ДМСО (раствор смеси 1:1). Поглощение лунок при 570 нм измеряли с помощью считывающего устройства для микропланшетов. Клетки B16F10 (BCRC60031) были получены из Центра сбора и исследования биоресурсов (BCRC), город Синьчжу, Тайвань. Клетки поддерживали в среде DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков. Кроме того, влияние семян P. dactylifera L. на жизнеспособность клеток B16F10 также оценивали методом анализа исключения трипанового синего. После обработки экстрактом семян клетки обрабатывали трипсином и центрифугировали для сбора осадка. Осадок клеток ресуспендировали в 300 мкл среды для культивирования клеток DMEM. Небольшую аликвоту клеточной суспензии (20 мкл) осторожно смешивали с 10 мкл трипанового синего (4% в PBS). Количество клеток подсчитывали (нежизнеспособные клетки были синими, а жизнеспособные клетки неокрашенными) с использованием гемоцитометра под микроскопом.

2.10. Измерение активности тирозиназы грибов

Раствор грибной тирозиназы (10 мкл, 200 единиц) добавляли в 96-луночный микропланшет. Реакционная смесь содержала 5 мМ L-ДОФА, растворенного в фосфатно-солевом буфере (PBS) (50 мМ, pH 6,8), и экстракт семян P. dactylifera L. (0,049, 0,245). и 0,49 мг/мл), койевая кислота (200 мМ, 0,03 мг/мл) или арбутин (2 мМ, 0,54 мг/мл). Смесь для анализа инкубировали при 37°С в течение 30 мин и измеряли поглощение образовавшегося дофахрома при 490 нм. Измерение активности тирозиназы грибов проводили, как описано ранее [50].

2.11. Определение содержания меланина

Клетки B16F10 обрабатывали -MSH (100 нМ) в течение 24 ч, а затем обрабатывали либо экстрактом семян P. dactylifera L. (0,0245–0,147 мг/мл), либо экстрактом семян P. dactylifera L. или арбутин (0,54 мг/мл) в течение дополнительных 24 часов. После обработки клеточный осадок солюбилизировали в растворе NaOH (1 н.) при 60°С в течение 60 мин. Содержание меланина определяли при 405 нм, как описано ранее Tsuboi [51].

Цистанхе ингибирует выработку меланина.

2.12. Измерение внутриклеточной активности тирозиназы

Внутриклеточную тирозиназную активность определяли, как описано ранее [52]. Клетки обрабатывали -MSH (100 нМ) в течение 24 ч, а затем экстрактом семян P. dactylifera L. (0.0 245–0,147 мг /мл) или арбутин (0,54 мг/мл) в течение 24 часов. После обработки клеточные экстракты (100 мкл) смешивали со свежеприготовленным раствором L-ДОФА (0,1% в PBS), инкубировали при 37°С и измеряли оптическую плотность при 490 нм.

2.13. Вестерн-блоттинг эксперимент

Клетки обрабатывали экстрактом семян P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49 и 0.147 мг/мл) или арбутин (0,54 мг/мл), а затем лизируют в PBS, содержащем непищевой P-40 (1 процент), дезоксихолат натрия (0,5 процента), додецил натрия сульфат (ДСН, 0,1%), апротинин (5 мкг/мл), фенилметилсульфонилфторид (100 мкг/мл), пепстатин А (1 мкг/мл) и ЭДТА (1 мМ) при 4°С в течение 20 мин. Общее количество лизатов определяли с использованием набора micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Белки (30 мкг) разделяли с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и электрофоретически переносили на поливинилиденфторидную мембрану. Мембрану блокировали в 5% обезжиренном молоке в PBST (PBS с 0,05% Tween-20) и инкубировали при 4°C в течение ночи со следующими первичными антителами, разведенными в PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1. Ab (1:6000), Ab TRP2 (1:1000), Ab MC1R (1:500), Ab GAPDH (1:1500), Ab тирозиназы (1:2000), Ab p-p38 (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) и CERB Ab (1:200), все от Santa Cruz Biotech (Даллас, Техас, США)). Связанные антитела обнаруживали с помощью вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (Amersham Corp.), а затем с помощью системы обнаружения ECL (Amersham) в соответствии с инструкциями производителя.

2.14. Анализ ингибитора PKA

Клетки обрабатывали -MSH (100 нМ) в течение 24 часов с последующим добавлением в течение 1 часа 10 мкМ регулятора PKA H89. После обработки к клеткам добавляли экстракт семян P. dactylifera L. (0,147 мг/мл) и H89 и инкубировали еще 23 часа. Содержание меланина определяли, как описано выше.

2.15. Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием апостериорного теста Тьюки, который применялся для сравнения измеренных данных с использованием статистического пакета для социальных наук (SPSS) версии 22. 0 статистического программного обеспечения (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). * p < 0.05="" считалось="" значимым,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. Результаты

3.1. UPLC анализ экстракта семян P. dactylifera L.

Результаты анализа УЭЖХ показаны на рис. 1А, В. На рис. 1А изображен перекрывающийся пик экстракта семян P. dactylifera L. и феруловой кислоты при 330 нм. На рисунке 1B показаны аналогичные спектры сканирования между 220 и 500 нм для экстракта семян P. dactylifera L. и феруловой кислоты.

3.2. Антиоксидантные характеристики экстракта семян P. dactylifera L.

Антиоксидантная активность экстракта семян P. dactylifera L. in vitro выявила наличие антиоксидантного потенциала. В анализе DPPH витамин С ({{0}},05 мМ; 0,53 мг/мл) и трет-бутилгидроксианизол (ВНА) (0 0,1 мг/мл) использовали в качестве положительных антиоксидантных стандартов. Способность экстракта поглощать DPPH составляла 49,97 ± 2,9 процента, 81,36 ± 0,56 процента и 78,53 ± 3,83 процента от контроля для концентраций экстракта 0.0{{ 31}}49, 0,0245 и 0,049 (мг/мл) соответственно. Для сравнения, поглощающая способность витамина С и ВНА составила 90,12 ± 0,31% и 90,44 ± 0,49% соответственно (рис. 2А).

Этот катион-радикал ABTS имеет синий цвет и вступает в реакцию с большинством антиоксидантов. Во время этой реакции синий катион-радикал ABTS снова превращается в бесцветную нейтральную форму. Реакцию контролировали спектрофотометрически. ABTS плюс очищающая способность экстракта составляла 5,69 ± 1,36 процента, 18,81 ± 0,68 процента и 66,82 ± 8,51 процента от контроля при концентрациях 0.0{{16 }}98, 0.{{2{0}}49 и 0.098 мг/мл соответственно. Напротив, ABTS плюс поглощающая способность витамина C (0,9 мг/мл) и BHA (0,9 мг/мл) составляли 95,52 ± 0,12 процента и 40,3 ± 0,83 процента соответственно. Результаты на рисунке 2B показывают, что экстракт семян удаляет значительное количество ABTS плюс радикал.

Для определения общего содержания фенолов в экстракте семян P. dactylifera L. в качестве положительного стандарта использовали галловую кислоту (2 мкг/мл). Результаты на рисунке 2C показывают, что общее содержание фенолов в 0.0196, 0.{{20}}}98 и 0. 196 (мг/мл) экстракта составляли 33,43 ± 2,33 процента, 117,22 ± 7,81 процента и 195,4 ± 10,91 процента соответственно. Эквиваленты галловой кислоты (GAE) вышеупомянутых концентраций экстрактов семян составляли 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 и 0,642 ± 0,03 соответственно (рис. 2C).

3.3. Ингибирующее действие экстракта семян P. dactylifera L. на меланогенез

Результаты, показанные на рисунке 4A, демонстрируют, что 0,049 мг/мл экстракта семян P. dactylifera L.не оказывает ингибирующего действия на активность тирозиназы грибов. С другой стороны, процент ингибирования фермента составлял 8,34 ± 2,67 процента и 33 ± 2,36 процента от контроля для 0,245 и 0,49 мг/мл.обработки экстрактом семян P. dactylifera L. соответственно. Кроме того, процент ингибирования тирозиназы койевой кислотой (200 мкМ; 0.03 мг/мл) и арбутином (2 мМ; 0,54 мг/мл) ) составляли 56,26 ± 5,06 процента и 64,56 ± 2,88 процента от контроля соответственно (рис. 4А). Таким образом, более высокие концентрации экстракта семян P. dactylifera L. (0,245 и 0,49 мг/мл) могут представлять ингибирующие уровни тирозиназы грибов.

На рисунке 4B результаты показали, что только 0,147 мг/мл экстракта семян P. dactylifera L. может значительно снизить содержание меланина в клетках меланомы B16F10. После обработки содержание меланина в клетках B16F10 составило 80,66 ± 5,43% от контроля. Для положительного стандарта, арбутина (0,54 мг/мл), оставшееся внутриклеточное содержание меланина составляло 61,19 ± 8,17 процента от содержания в контроле. Результаты показали, что 0,147 мг/мл экстракта семян P. dactylifera L. показали меньший эффект, чем арбутин. Остальные значения активности внутриклеточной тирозиназы составили 85,1 ± 8,1 процента и 73,7 ± 11,9 процента для 0,098 и 0,147 мг/мл экстракта семян P. dactylifera L. соответственно. Оставшаяся внутриклеточная активность тирозиназы составляла 64,3 ± 14,9% от контроля после обработки клеток арбутином (рис. 4С). Результаты показали, что более высокие концентрации экстракта семян P. dactylifera L. по-прежнему проявляли меньший ингибирующий эффект на -MSH-индуцированную активность тирозиназы в клетках B16F10, чем арбутин.

3.4. Экстракт семян P. dactylifera L. ингибирует уровни экспрессии белков, участвующих в меланиногенезе.

Вестерн-блоты использовали для изучения уровней экспрессии белков, связанных с меланогенезом, в клетках B16F10 (рис. 5А). Результаты показывают, что обработка экстрактом семян P. dactylifera L. в различных концентрациях приводила к снижению уровней MC1R, MITF, тирозиназы, TRP1 и TRP2. Ингибирующее действие экстракта на экспрессию белка проявлялось при концентрации {{10}},147 мг/мл. Кратность изменения уровня экспрессии белка для MC1R составила 0,74 ± 0,02; для MITF это было {{20}},51 ± 0,03; для тирозиназы 0,54 ± 0,26; для TRP-1 – 0,57 ± 0,15; а для TRP-2 он был 0,49 ± 0,1 (рис. 5B).

Уровни экспрессии сигнальных белков, связанных с меланогенезом, исследовали с помощью вестерн-блоттинга (рис. 5С). Результаты показывают, что 0.147 мг/мл обработки экстрактом семян P. dactylifera L., по-видимому, приводило к снижению уровней p-p38, p-JNK, p-ERK и p-CREB. Кратность изменения уровня экспрессии белка для p-p38 составила 0,88 ± 0,15; для p-JNK – 0,68 ± 0,39; для p-ERK это было 0,65 ± 0,23; а для p-CREB это было 0,44 ± 0,07 (рис. 5D).

3.5. Экстракт семян P. dactylifera L. не влияет на экспрессию генов тирозиназы, TRP1, TRP2 или MITF

Уровни экспрессии генов белков, связанных с меланогенезом, таких как тирозиназа, TRP1, TRP2 и MITF, исследовали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR). Относительные нормированные уровни экспрессии тирозиназы/GAPDH для 0.0367, 0.049 и 0.147 мг/мл P. dactylifera L. обработка экстрактом семян составила 3,51 ± 0,52, 2,38 ± 0,24 и 1,64 ± 0,55 соответственно. Для TRP-1/GAPDH относительные нормализованные уровни экспрессии для 0.0367, 0.049 и {{40 }}}.147 мг/мл обработки экстрактом семян P. dactylifera L. составляли 1,64 ± 0,2, 1,15 ± 0,02 и 0. 89 ± 0.07 соответственно. Относительные нормализованные уровни экспрессии TRP-2/GAPDH для 0.0367, 0.049 и 0.147 мг /мл экстракта семян P. dactylifera L. составляли 1,08 ± 0,13, 0,85 ± 0,01 и 0,7 ± 0,05 соответственно. Для MITF/GAPDH относительные нормализованные уровни экспрессии для 0,0367, 0,049 и 0,147 мг/мл обработки экстрактом семян P. dactylifera L. составляли 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 и 0,74 ± 0,05 соответственно (рис. 6).

4. Дискуссия

Сообщалось, что меланогенез усиливает клеточный окислительный стресс. Кроме того, некоторые антиоксиданты, поглотители АФК, поглотители ингибиторов и ингибиторы могут ингибировать УФ-опосредованный синтез меланина [54]. Поэтому антиоксиданты, поглотители АФК и ингибиторы меланогенеза все чаще применяются в косметических средствах для отбеливания кожи для предотвращения нежелательной гиперпигментации кожи [14]. Также было обнаружено, что стимуляция металлотионеина, эндогенного антиоксиданта, может подавлять меланогенез в меланоцитах [55]. Кожа человека часто подвергается воздействию окисляющих загрязнителей окружающей среды или ультрафиолетового излучения и повреждается внешними факторами окружающей среды. В частности, сообщалось, что УФ-облучение индуцирует образование АФК в коже и способствует перекисному окислению липидов клеточной мембраны [56]. Для противодействия окислительному стрессу кожа оснащена особыми антиоксидантными системами [57].

Чтобы выяснить антиоксидантную активность экстракта семян P. dactylifera L., DPPH и ABTS, а также активность по удалению радикалов, общее содержание фенолов, восстановительную способность и способность экстракта к хелатированию ионов металлов определяли, как описано ранее [47,48]. Экстракт семян P. dactylifera L. проявлял значительную антиоксидантную активность во всех вышеупомянутых аналитических исследованиях. Результаты показали антиоксидантный потенциал экстракта семян P. dactylifera L. в разных диапазонах с различной эффективностью. Активность экстракта семян по удалению DPPH, показанная на рисунке 2A, отличалась от активности ABTS plus, показанной на рисунке 2B, что могло быть результатом различных механизмов взаимодействий антиоксидант-радикал. Кроме того, стехиометрия реакций между антиоксидантными компонентами в экстракте семян может различаться, что приводит к разнице в способности нейтрализовать свободные радикалы [58]. Потенциальные антиоксиданты в экстракте семян P. dactylifera L. могут преобразовывать комплекс Fe3 plus/феррицианид в форму железа, а восстанавливающая способность служит индикатором антиоксидантной активности экстракта семян, как показано на рисунке 2D. Было обнаружено, что койевая кислота [59] действует как ингибитор тирозиназы, потому что койевая кислота действует как хелатор металлов, хелатируя ионы меди и ингибируя те ионы, которые входят в активный центр тирозиназы. Следовательно, антиоксиданты в экстракте семян могут образовывать нерастворимые комплексы металлов с ионами железа и затем ингибировать взаимодействие между ионами металлов и липидами. Более высокая способность экстракта семян к хелатированию ионов металлов указывала на его потенциальную антиоксидантную активность и возможное ингибирующее действие на активность тирозиназы (рис. 2Е).

Принцип анализа внутриклеточных АФК заключается в том, что DCFH-DA диффундирует через клеточную мембрану и ферментативно гидролизуется эстеразой до DCFH; затем DCFH реагирует с АФК (такими как H2O2) с образованием DCF. Быстрое увеличение DCF указывало на окисление DCFH внутриклеточными радикалами [60]. Идея поиска новых антиоксидантов для отбеливания кожи заключается в гипотезе о том, что окислительный стресс, возникающий в результате УФ-облучения, может способствовать стимуляции синтеза меланина. Сообщалось, что УФ-облучение вызывает образование АФК в кожных тканях, которые могут индуцировать выработку меланина путем активации тирозиназы [61]. Кроме того, сообщалось, что некоторые средства для отбеливания кожи могут ингибировать меланогенез, взаимодействуя с ионами меди в активном центре тирозиназы или с о-хинонами, чтобы блокировать полимеризацию промежуточных продуктов в пути синтеза меланина [62]. Кроме того, витамин С или витамин Е могут уменьшить окисление ранее существовавших частиц меланина. Следовательно, эти витамины широко применяются в продуктах для отбеливания кожи [63]. Интересно, что наши результаты продемонстрировали антиоксидантные свойства экстракта семян P. dactylifera L., указывая на то, что экстракт семян P. dactylifera L. может действовать как отбеливающий кожу ингредиент в косметике.

Анализ МТТ является хорошо известным колориметрическим анализом, который измеряет активность клеточных ферментов НАДН/НАДФН-зависимой оксидоредуктазы, которые восстанавливают МТТ до формазановых красителей пурпурного цвета. Этот анализ можно применять для изучения потенциальной цитотоксичности лекарственных средств и токсичных материалов, поскольку эти вещества усиливают или подавляют жизнеспособность клеток. Результаты, показанные на фигуре 3A, соответствовали результатам анализа исключения трипанового синего на фигуре 3B, что указывает на то, что экстракт семян P. dactylifera L. не оказывал цитотоксического действия на жизнеспособность клеток меланомы B16F10.

Грибная тирозиназа обычно используется в качестве целевого фермента для скрининга потенциальных ингибиторов меланогенеза. Впервые было обнаружено, что диапазон дозировок ({{0}}.049–0,49 мг/мл) экстракта семян P. dactylifera L. может ингибировать активность тирозиназы грибов. Результаты, показанные на рисунке 4А, показывают, что экстракт семян проявлял меньшее ингибирующее воздействие на активность тирозиназы грибов, чем койевая кислота. Тирозиназа играет важную роль на первых двух этапах пути меланогенеза. Чтобы выяснить истинное ингибирующее действие экстракта семян P. dactylifera L. на выработку меланина, определяли содержание меланина B16F10 и активность внутриклеточной тирозиназы. Результаты, представленные на фиг. 4В, показывают, что более высокая концентрация экстракта семян P. dactylifera L. оказывала очевидное ингибирующее действие на образование меланина. Данные показали, что экстракт семян P. dactylifera L. действительно блокирует меланогенез в клетках меланомы. При этом результаты, показанные на рисунке 4C, соответствовали результатам, показанным на рисунке 4B. В вышеупомянутых клеточных экспериментах -MSH использовали в качестве индуктора для стимуляции синтеза меланина. Сообщалось, что -MSH связывает рецептор меланокортина 1 (MC1R) и активирует внутриклеточную аденилатциклазу, которая, в свою очередь, катализирует АТФ до цАМФ и активирует цАМФ-зависимую ПКА. Результаты на Фигуре 5А показали, что экстракт семян P. dactylifera L. ингибировал экспрессию MC1R, тем самым блокируя выработку меланина, индуцированную опосредованной -MSH внутриклеточной активацией цАМФ. Кроме того, сигнальный путь PKA, опосредованный цАМФ, был инактивирован, и меланогенез ингибировался. Чтобы подтвердить вывод, мы провели эксперименты с ингибитором PKA, и данные, представленные на рисунке 4D, показали, что ингибирующий эффект экстракта семян P. dactylifera L. (0,147 мг/мл) на меланогенез в клетках B16F10 подавлялся H{{ 24}}лечение. H89 (N-[2-п-бромциннамиламиноэтил]-5-изохинолинсульфонамид) является селективным и мощным ингибитором PKA. Результаты показывают, что на цАМФ-опосредованную передачу сигналов PKA влиял экстракт семян P. dactylifera L..

Тирозиназа, TRP1 и TRP2 являются тремя основными ферментами, которые регулируют синтез меланина в клетках млекопитающих [64]. Кроме того, MITF является основным регулятором транскрипции тирозиназы, TRP1 и TRP2, а также наиболее важным регулятором пигментации меланоцитов [65]. Результаты на Фигуре 5А показывают, что экстракт семян P. dactylifera L. снижал уровни экспрессии этих белков, связанных с меланогенезом, ингибировал активность тирозиназы и уменьшал содержание меланина в клетках B16F10.

В этом исследовании экстракт семян P. dactylifera L. подавлял фосфорилирование CREB и активацию PKA. Эти данные свидетельствуют о том, что путь цАМФ-PKA может быть ответственным за индуцированный экстрактом семян P. dactylifera L. антимеланогенез (рис. 5C).

Сообщалось, что МАРК модулируют меланогенез [66]. Семейство MAPK включает три типа протеинкиназ, включая внеклеточную реактивную киназу (ERK), N-концевую киназу c-Jun (JNK) и p38 MAPK. MAPK p38 может активировать белок, связывающий элемент ответа цАМФ (CREB, а CREB активирует экспрессию MITF, что положительно влияет на синтез меланина [67]. Результаты на рисунке 5C свидетельствуют о том, что экстракт семян P. dactylifera L. может инактивировать CREB, JNK и p38, в свою очередь, ингибируют экспрессию MITF (рис. 5A). Эти результаты позволяют предположить, что антимеланогенный эффект, индуцированный экстрактом семян dactylifera L., может быть опосредован подавлением путей PKA. Кроме того, сообщалось, что облучение УФ-светом играет играют важную роль в инициировании нескольких кожных заболеваний, включая шелушение, образование морщин и гиперпигментацию [68].Результаты показали, что экстракт семян P. dactylifera L. снижает выработку меланина, что может быть связано с истощением внутриклеточных АФК.

Чтобы оценить влияние экстракта семян P. dactylifera L. на выработку клеточного меланина, мы определили уровни мРНК в клетках B16F10, обработанных -MSH и экстрактом семян P. dactylifera L. Клетки, обработанные -MSH, показали повышенные уровни MITF, тирозиназы, TRP-1 и TRP-2, как и ожидалось. Интересно, что клетки, обработанные экстрактом семян P. dactylifera L., показали снижение экспрессии мРНК этих генов, связанных с меланогенезом. Однако между колонками не было статистически значимой разницы, которая указывала на то, что экстракт семян P. dactylifera L. не влияет на уровни экспрессии генов MITF, тирозиназы, TRP1 и TRP2.

Это наш продукт.

Для большей информации, пожалуйста нажмите сюда.

Сообщалось, что основной фенольной кислотой, обнаруженной в семенах P. dactylifera L., является феруловая кислота [69]. Было показано, что феруловая кислота эффективно ингибирует синтез меланина в клетках меланомы B16 путем ингибирования индуцированного казеинкиназой 2- фосфорилирования тирозиназы дозозависимым образом [70]. Эти отчеты подтверждают наши результаты, показанные на рисунке 1: феруловая кислота в водном экстракте семян P. dactylifera L. способствовала ингибированию меланогенеза в клетках B16F10. Безусловно, в ближайшем будущем следует исследовать и другие функциональные компоненты экстракта семян.

Наши результаты показали, что экстракт семян P. dactylifera L. ингибировал меланогенез в клетках B16F10, подавляя сигнальные пути PKA. Следовательно, экстракт семян P. dactylifera L. можно использовать в качестве эффективного средства для отбеливания кожи.

5. Выводы

Это первый отчет о механизме действия водного экстракта семян P. dactylifera L. на синтез меланина. Настоящее исследование продемонстрировало участие пути цАМФ/PKA/CREB в депигментирующем эффекте экстракта семян P. dactylifera L.. Наши результаты показали, что экстракт семян P. dactylifera L. ингибировал меланогенез в клетках B16F10, подавляя сигнальные пути PKA. Следовательно, экстракт семян P. dactylifera L. можно использовать в качестве нового дерматологического средства против меланогенеза и эффективного средства для отбеливания кожи.