Как ингибитор фосфоинозитид 3-киназы алпелисиб используется при синдроме Лоу/болезни Дента?

Ингибитор фосфоинозитид 3-киназы алпелисиб восстанавливает организацию актина и улучшает дисфункцию проксимальных канальцев in vitro и в мышиной модели синдрома Лоу и болезни Дента.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Марин Беркес^1,5, Джонатан Р. Гэдсби^2,5, Беатрис Паола Феста^1,5, Ричард Батлер³ , Стивен П. Джексон², Валерия Берно⁴, Алессандро Лучани1 , Оливье Девюйст^1,6и Дженнифер Л. Галлоп^2,6

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитоскелет; эндоцитоз; липиды; проксимальный каналец; почечный синдром Фанкони

Мутации с потерей функции в гене OCRL, который кодирует фосфатидилинозитол [PI] 4,5-бисфосфат [PI(4,5)P2] 5-фосфатазу OCRL, вызывают дефектный эндоцитоз и дисфункцию проксимальных канальцев. вСиндром Лоу и болезнь Дента2. Дефект обусловлен повышенным уровнем PI(4,5)P2 и аберрантной полимеризацией актина, что блокирует перенос эндосом. PI 3-фосфат [PI(3)P] недавно был идентифицирован как коактиватор с PI(4,5)P2 в актиновом пути. Здесь мы проверили гипотезу о том, чтофосфоинозитид 3-киназа(PI3K) ингибиторы могут восстанавливать эндоцитозный дефект, вызванный потерей OCRL, путем перебалансировки сигналов фосфоинозитида к актиновому аппарату. Широкодиапазонный ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа)ингибитор копанлисиб и класс IA p110a PI3K(фосфоинозитид 3-киназа) ингибитор алпелисибснижение аберрантной полимеризации актина в OCRL-дефицитных клетках почек человека in vitro. Уровни PI 3,4,5-трифосфата, PI(4,5)P2 и PI(3)P были снижены при лечении алпелисибом, а нокдаун siRNA каталитической субъединицы PI3K p110a фенотипировал актиновый фенотип. В модели гуманизированных мышей OcrlY/- алпелисиб уменьшал окрашивание эндосомального актина, восстанавливая структуру стрессовых волокон и уровни мегалина в плазматической мембране клеток проксимальных канальцев, что отражалось в улучшенном поглощении эндоцитами низкомолекулярных белков in vivo. Таким образом, наши результаты подтверждают связь между фосфоинозитидными липидами, полимеризацией актина и эндоцитарным транспортом в проксимальных канальцах и представляют собой доказательство концепции повторного использования алпелисиба вСиндром Лоу/болезнь Дента2.

Заявление о переводе

Синдром Лоу и болезнь Дента2, вызванный мутациями в фосфоинозитид-липидной 5-фосфатазе OCRL, проявляющийся дисфункцией проксимальных канальцев и низкомолекулярной протеинурией при наличии только поддерживающей терапии. Наши выводы показывают, чтофосфоинозитид 3-киназа ингибитор алпелисиб, который в настоящее время одобрен для лечения рака, устраняет аберрантный баланс фосфоинозитидов и актиновый фенотип, связанные с потерей OCRL, вызывая существенное улучшение эндоцитарного механизма и абсорбционной способности в клеточных системах и гуманизированной мышиной модели синдрома Лоу/болезни Дента 2. Учитывая очевидный профиль безопасности, алпелисиб является многообещающим кандидатом на повторное назначение лекарственного средства вСиндром Лоу и болезнь Дента.

Эпителиальные клетки, выстилающие проксимальные канальцы (ПТ) почки, обладают эффективным рецептор-опосредованным эндолизосомным путем, который восстанавливает и обрабатывает важные вещества, которые фильтруются через клубочки. Врожденные нарушения, поражающие эндолизосомы, вызывают дисфункцию ПТ (почечный синдром Фанкони) с потерей с мочой растворенных веществ и низкомолекулярных (НМ) белков, часто осложняющуюся метаболическими и ростовыми осложнениями и развитием хронической болезни почек.¹Инактивирующая мутация в OCRL была связана с болезнью Дента 2 (MIM № 300555), заболеванием, характеризующимся дисфункцией PT, камнями в почках и прогрессирующей почечной недостаточностью, а также с окулоцереброренальным синдромом Лоу (MIM № 309000), который проявляется, кроме того, к дисфункции ПТ и почечной недостаточности, системным проявлениям, таким как врожденная катаракта, когнитивная недостаточность и гипотония.^2-4Текущие методы лечения болезни Дента 2 и синдрома Лоу носят лишь вспомогательный характер.

Рисунок 1|ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторы облегчают аберрантную сборку актина в эндосомах в модели клеток почки человека с дефицитом OCRL (HK2). ( а ) Этапы превращения фосфоинозитидных липидов, относящиеся к этому исследованию, с указанием превращений между PI (4,5) P2, PI (3, 4, 5) P2 и PI (3) P с наиболее соответствующими ферментами, выделенными жирным шрифтом, наиболее релевантные преобразования сплошными линиями, а другие пунктирными линиями. PI(4,5)P2 повышен при синдроме Лоу из-за отсутствия 5-фосфатазной активности в OCRL и образуется в результате фосфорилирования PI фосфатидилинозитол4-киназами (PI4K) и PI(4) P5-киназа (PIP5K). PI(4,5)P2 фосфорилируется PI3K класса I с образованием PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 может быть дефосфорилирован в PI(4,5)P2 с помощью PTEN или в PI(3,4)P2 с помощью SH-2-содержащих инозитол-50 полифосфатов (SHIP) 1 и 2, синаптоянин 1 и 2, а также OCRL, хотя это (продолжение)

Рисунок 1|(продолжение) считается незначительным. PI(3,4)P2 дефосфорилируется в PI(3)P инозитолполифосфат-4-фосфатазой типа IA (INPP4A) и B. PI(3)P также образуется в эндосомах путем фосфорилирования PI классом III. ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа), вакуолярный сортирующий белок Vps34. ( b ) Вестерн-блоты, иллюстрирующие потерю экспрессии OCRL в клеточной линии HK2 OCRL с нокаутом CRISPR (KO) по сравнению с контрольными клетками HK2 дикого типа (WT) с тубулином в качестве контроля нагрузки. ( c – e ) Репрезентативные конфокальные микрофотографии Airyscan и количественная оценка перекрытия раннего эндосомного антигена 1 (EEA1) / актина (выраженного в процентах от общего количества обнаруженных везикул EEA1+) для клеток HK2 WT или OCRL KO, обработанных либо диметилсульфоксидом (ДМСО) (d) или указанный ингибитор и фиксировали с помощью 4-процентного раствора формальдегида. Во всех случаях изображения иллюстрируют один z-срез из обработанного Airyscan конфокального стека клеток, иммуномаркированных для EEA1 (желтый), фаллоидина (актин, пурпурный) и 40,6-диамидино{ {14}}фенилиндол (DAPI) (циан). Стержни=5 мм. В количественных оценках линии указывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего, и каждая точка данных представляет собой отдельную ячейку. Во всех экспериментах обработки применялись за 16 часов до фиксации. Во всех количественных оценках статистическую значимость оценивали с помощью дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса (KW) с тестом множественных сравнений Данна. ( c ) клетки WT или KO, обработанные либо ДМСО, либо 100 нМ копанлисиба, демонстрируя восстановление актин-эндосомального перекрытия. Тест KW: ***P < 0.0{{50}}}1,="" множественные="" сравнения;="" дмсо="" дикого="" типа="" по="" сравнению="" с="" ko="" дмсо,="" ko="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" копанлисибом="" оба="" ***p=""><0,001, wt="" копанлисиб="" по="" сравнению="" с="" ko="" копанлисибом="" p="0,44" (незначимо="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" и="" 63="" клетки="" для="" wt="" дмсо,="" wt="" копанлисиб,="" ko="" дмсо="" и="" ko="" копанлисиб,="" соответственно.="" (="" d="" )="" клетки="" wt="" или="" ko,="" обработанные="" либо="" дмсо,="" либо="" 10="" мм="" алпелисиба,="" демонстрирующие="" восстановление="" актин-эндосомального="" перекрытия.="" kw-тест:="" ***p="">< 0,001,="" множественные="" сравнения;="" wt="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" алпелисибом="" оба="" ***p=""><0,001, wt="" alpelisib="" по="" сравнению="" с="" ko="" алпелисибом.="" р=""> 0,99 (нс). N=31, 30, 43 и 41 клетки для WT ДМСО, WT алпелисиб, KO ДМСО и KO алпелисиб, соответственно. ( e ) клетки WT или KO, обработанные либо ДМСО, 10 мМ GSK2636771, либо 10 мМ иделализиба, демонстрируя, что ни одно из соединений не способно значительно уменьшить актин-эндосомальное перекрытие. KW-тест: ***P < 0,001,="" множественные="" сравнения;="" wt="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ko="" дмсо,="" ***="" p=""><0,001, ko="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" gsk,="" *="" p="0.04," ko="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" иделалисибом,="" p=""> 0,99 (нс). Клетки N=159, 130, 203, 122, 131 и 145 для WT DMSO, WT GSK2636771, WT иделалисиб, KO DMSO, KO GSK2636771 и KO иделалисиб, соответственно. Чтобы оптимизировать просмотр этого изображения, ознакомьтесь с онлайн-версией этой статьи на сайте www.kidney-international.org.

Как ингибитор фосфоинозитид 3-киназы алпелисиб используется при синдроме Лоу/болезни Дента?

Протеинурия LMW является постоянным признаком, наблюдаемым при синдроме Лоу / болезни Дента 2, что свидетельствует о том, что OCRL влияет на рецептор-опосредованный эндоцитоз.⁵OCRL кодирует фосфатидилинозитол (PI) 4,5-бисфосфат [PI(4,5)P2] 5- фосфатазу OCRL,⁶который контролирует идентичность липидов в эндолизосомном пути путем деградации PI(4,5)P2 (рис. 1а). Недостаточная деградация PI(4,5)P2 посредством OCRL связана с неспособностью обнажить покрытые клатрином везикулы в фибробластах, что сопровождается образованием «кометных» структур полимеризованного нитевидного актина из образующихся аберрантных ранних эндосомоподобных органелл.^7-9В других типах клеток, особенно в PT-клетках почек, дефицит OCRL приводит к образованию структур «корзины» F-актина, окружающих аберрантные эндолизосомальные органеллы.¹⁰Избыток F-актина блокирует перенос мембран через эндоцитоз и эндолизосомальный путь и, как предполагается, снижает рециркуляцию мультилигандного рецептора мегалина к апикальной мембране, усугубляя дефект внутри эндолизосомного пути.¹¹В соответствии с основной ролью аберрантного F-актина дефектное эндоцитарное поглощение, вызванное мутациями OCRL, облегчается за счет нацеливания на актиновый аппарат с помощью латрункулина B или за счет истощения регуляторных белков актина, а также за счет истощения, опосредованного малыми интерферирующими РНК (миРНК). PI(4)P 5-киназы для регулирования синтеза PI(4,5)P2^7,10(Рисунок 1а).

Полимеризация актина все больше понимается как происходящая не только от PI(4,5)P2, но также и от других фосфоинозитидных липидов. Например, PI(3,4,5)P3 активирует GTPase Rho-типа Rac, а PI(3)P действует в сочетании с PI(4,5)P2, чтобы стимулировать полимеризацию актина ниже другой Rho-типа GTPase, Cdc42.^12-14Взаимное превращение этих фосфоинозитидов связано с движением липидов по эндоцитарному и эндосомальному пути. PI(4,5)P2 фосфорилируется фосфатидилинозитол- 30 -киназой класса I (PI3K) до PI(3,4,5)P3 на плазматической мембране и постепенно дефосфорилируется до PI(3,4)P2 и PI. (3)P или PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P обогащается в эндосомах, где он необходим для их функции, и образуется преимущественно путем прямого фосфорилирования PI с помощью PI3K класса III.фосфоинозитид 3-киназа), Впс34¹⁶(Рисунок 1а). В клеточной линии пигментированного эпителия сетчатки (RPE) с дефицитом OCRL генерируемые актиновые кометы уменьшаются при обработке PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторы вортманнина и Vps34-IN1, что согласуется с биохимическими исследованиями, показывающими корегуляцию актина посредством совпадения как PI(3)P, так и PI(4,5)P2.¹⁴

Восстановление эндоцитоза, наблюдаемое при нацеливании на актиновый аппарат в клетках пациента OCRL и нокаутных (KO),^7,10вместе с восходящей регуляцией актина с помощью PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)Мероприятия¹⁴и сильно взаимосвязанный характер преобразования PI обеспечивает интригующую возможность того, что класс I PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторы могут быть полезны при синдроме Лоу. Такие ингибиторы, разработанные для лечения рака, одобрены для клинического применения.¹⁷и, таким образом, потенциально пригодны для повторного использования лекарств. Хотя такие соединения, как копанлисиб¹⁸обладают широкой специфичностью и побочными эффектами, недавний успех был продемонстрирован для более специфических ингибиторов. Иделалисиб,¹⁹который нацелен на PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)субъединица p110d одобрена для лечения хронической лимфоцитарной лимфомы, а алпелисиб, нацеленный на p110a, одобрен для применения при раке молочной железы.^20,21Более того, алпелисиб продемонстрировал клиническую эффективность у детей с синдромом PROS/ГВОЗДИКИЙ,²²редкий синдром избыточного роста, возникающий в результате активации PIK3A.

Здесь мы проверили гипотезу о том, что класс I PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторы могут восстанавливать дефект эндоцитоза из-за потери OCRL, используя установленные клеточные и мышиные модели.^10,11,23Мы показываем, что ингибирование PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)активность через копанлисиб или алпелисиб, или опосредованное миРНК истощение каталитической субъединицы p110a, являющейся мишенью алпелисиба, снижает избыточную полимеризацию актина в клетках почек человека (HK2), дефицитных по OCRL. Сосредоточив внимание на алпелисибе как наиболее специфичном соединении для клинического применения, мы показываем, что он снижает полимеризацию актина и улучшает поглощение через эндолизосомный путь в клетках PT из гуманизированного Ocrl.^Y/-мышей в пробирке. Кроме того, лечение алпелисибом in vivo облегчает протеинурию, уменьшает дисфункцию протромбинового времени и восстанавливает клеточные уровни мегалина в гуманизированном Ocrl.^Y/-мышей. Эти результаты подтверждают, что алпелисиб является кандидатом на повторное назначение препарата вСиндром Лоу и болезнь Дента 2.

Рисунок 2|Эффекты алпелисиба на актин зависят от дозы и повторяются с помощью siРНК PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)стр.110а. ( а ) Типичные конфокальные микрофотографии Airyscan (фиксированные с использованием 4-процентного формальдегидного фикса и иммуномаркированные для антигена 1 ранней эндосомы [EEA1], желтый; актин [фаллоидин], пурпурный; и 4{{40}},{{ 5}}диамидино-2-фенилиндол [DAPI], голубой; столбики=5 мм) и количественный анализ клеток почки человека дикого типа (WT) или нокаутных (KO) клеток почки человека (HK2), обработанных диметилсульфоксидом (ДМСО) или указанные дозы алпелисиба в течение 16 часов, что демонстрирует дозозависимое восстановление актин-эндосомального перекрытия. Во всех случаях линии указывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего, а точки указывают отдельные клетки. Клетки N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 и 67 для контроля ДТ, ДТ 10 мМ, ДТ 50 мМ, КО ДМСО и KO 2,5, 5, 10, 15, 25 и 50 мМ алпелисиб, соответственно. Статистическая значимость оценивалась по критерию Крускала-Уоллиса (KW) с критерием множественных сравнений Данна: общий ***P < 0,001,="" множественные="" сравнения;="" wt="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ко="" дмсо,="" ко="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ко="" 5,="" 15,="" 25="" и="" 50="" мм="" алпелисибом="" все="" ***p=""><0,001, ко="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ко="" 2,5="" мм="" алпелисиб="" *p="0.0131," ко="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ко="" 10="" мм="" алпелисиб="" **p="0.0043," дмсо="" wt="" по="" сравнению="" с="" wt="" 10="" и="" 50="" мм="" alpelisib="" p=""> 0,9999 (незначимо [нс]). ( b ) Вестерн-блот для p110a и контрольной загрузки -тубулином клеток WT или KO, обработанных либо скремблом (Scram.), либо p110a siRNA. (c) Репрезентативные конфокальные микрофотографии Airyscan (фиксированные с использованием 4-процентного формальдегида и иммуномаркированные для EEA1, желтый; актин [фаллоидин], пурпурный; и DAPI, голубой; столбцы =5 мм) и количественный анализ обработанных клеток WT или KO. со скремблированием (S) или p110a siRNA, демонстрируя уменьшение перекрытия EEA1-актина при истощении p110a. Критерий KW с критерием множественных сравнений Данна: ***P < 0,001,="" множественные="" сравнения;="" скремблирование="" wt="" по="" сравнению="" с="" ko="" скремблированием,="" ko="" скремблирование="" по="" сравнению="" с="" ko="" p110a="" sirna="" оба="" ***p=""><0,001. n="79," 108,="" 93="" и="" 131="" клеток="" соответственно.="" hk2,="" почка="" человека;="" pi3k,="" фосфатидилинозитол-30="" -киназа;="" sirna,="" малая="" интерферирующая="" рнк.="" чтобы="" оптимизировать="" просмотр="" этого="" изображения,="" ознакомьтесь="" с="" онлайн-версией="" этой="" статьи="" на="" сайте="">

Рисунок 3|Уровни фосфатидилинозитола (PI) 4, 5-бифосфата [PI(4,5)P2] повышены при нокауте OCRL (KO), а PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , и PI(3)P подавляются лечением алпелисибом. Во всех экспериментах указанные обработки применялись за 16 часов до фиксации. В количественных оценках линии указывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего, и каждая точка данных является результатом отдельной ячейки. Во всех количественных оценках статистическую значимость оценивали с помощью дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса (KW) с тестом множественных сравнений Данна. Полосы=20 мм на всех изображениях. ( а ) Репрезентативные широкопольные микрофотографии клеток почек человека дикого типа (WT) или нокаутированных клеток (HK2), обработанных диметилсульфоксидом (ДМСО) или 10 мМ алпелисибом, а затем зафиксированных с помощью фикса плазматической мембраны и иммуномеченных для PI (3,4,5 )P3 (красный) и 40,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (голубой) с количественным определением средней интенсивности мечения PI(3,4,5)P3 в клетке, демонстрируя эффективность алпелисиба. воздействие на синтез PI(3,4,5)P3. N=96, 128 и 109 клеток для WT ДМСО, WT алпелисиб, KO ДМСО и KO алпелисиб, соответственно. кВт (продолжение)

Рисунок 3|(продолжение) тест: общий ***P < 0.001,="" множественные="" сравнения;="" дмсо="" дикого="" типа="" по="" сравнению="" с="" ко="" дмсо,="" дмсо="" дикого="" типа="" по="" сравнению="" с="" алпелисибом="" дикого="" типа="" и="" ко="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ко="" алпелисибом,="" все="" ***p="">< 0.0{{7{0}}}1.="" (b)="" репрезентативные="" конфокальные="" микрофотографии="" клеток="" wt="" или="" ko="" hk2,="" обработанных="" дмсо,="" 1{93}}="" мм-="" или="" 50-="" мм="" алпелисибом="" в="" течение="" 16="" часов,="" а="" затем="" зафиксированных="" с="" помощью="" прибора="" гольджи="" и="" помеченных="" с="" помощью="" m="" ch="" {{10}}="" зонд="" xfyve="" pi(3)p="" (пурпурный)="" и="" dapi="" (голубой)="" с="" количественным="" определением="" количества="" pi(3)p-положительных="" точек,="" обнаруженных="" в="" клетках,="" обработанных="" алпелисибом="" в="" различных="" концентрациях="" ,="" как="" указано,="" показывая,="" что="" pi(3)p-положительные="" точки="" уменьшаются="" дозозависимым="" образом.="" клетки="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" и="" 215="" для="" контроля="" wt,="" wt="" 10="" мм,="" wt="" 50="" мм,="" ko="" дмсо="" и="" ko="" 2,5,="" 5,="" 10,="" 25="" и="" 50="" мм="" алпелисиб="" соответственно.="" kw-тест:="" общий="" ***p=""><0,001, множественные="" сравнения;="" дмсо="" дикого="" типа="" по="" сравнению="" с="" ко="" дмсо,="" дмсо="" дикого="" типа="" по="" сравнению="" с="" альпелисибом="" 10="" и="" 50="" мм="" дикого="" типа,="" дмсо="" ко="" по="" сравнению="" с="" 50="" мм="" алпелисиба="" ко,="" все="" ***p=""><0,001; ko="" dmso="" против="" ko="" 2,5="" и="" 5="" мм="" алпелисиба,="" оба="" p=""> 0,9999 (незначимо [ns]); КО ДМСО по сравнению с КО 10 мМ алпелисиб **P=0.0049; КО ДМСО по сравнению с КО 25 мМ алпелисиб ***P=0.0002. ( c ) Репрезентативные широкопольные микрофотографии клеток WT или KO HK2, обработанных ДМСО или 10 мМ алпелисиба, а затем зафиксированных с помощью фиксатора плазматической мембраны и иммуномеченных для PI (4,5) P2 (желтый) и DAPI (голубой), с количественным определением средняя интенсивность мечения PI(4,5)P2 в клетках, показывающая повышенный PI(4,5)P2 плазматической мембраны в клетках KO, который снижается при обработке алпелисибом, особенно в клетках KO. N=126, 112, 85 и 116 клеток для WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO и KO alpelisib соответственно. KW-тест: общий ***P <0,001, множественные="" сравнения;="" wt="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" dmso="" и="" ko="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" alpelisib="" оба="" ***p=""><0,001; дмсо="" дикого="" типа="" по="" сравнению="" с="" алпелисибом="" дикого="" типа="" p="0,4752" (нс).="" (="" d="" )="" репрезентативные="" широкопольные="" микрофотографии="" клеток="" wt="" или="" ko="" hk2,="" обработанных="" дмсо="" или="" 10="" мм="" алпелисиба,="" а="" затем="" зафиксированных="" 4-процентным="" формальдегидным="" фиксатором="" и="" иммуномеченных="" для="" pi="" (4,5)="" p2="" (желтый)="" и="" dapi="" (голубой),="" с="" количественным="" определением="" числа="" pi(4,5)p2-положительных="" точек,="" показывающих="" увеличение="" точек="" pi(4,5)p2="" в="" клетках="" ko,="" которое="" снижается="" при="" лечении="" алпелисибом,="" особенно="" в="" клетках="" ko.="" n="75," 65,="" 52="" и="" 69="" клеток="" для="" wt="" дмсо,="" wt="" алпелисиб,="" ko="" дмсо="" и="" ko="" алпелисиб,="" соответственно.="" kw-тест:="" общий="" ***p=""><0,001, множественные="" сравнения;="" wt="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" dmso="" и="" ko="" dmso="" по="" сравнению="" с="" ko="" alpelisib="" оба="" ***p=""><0,001; дмсо="" дикого="" типа="" по="" сравнению="" с="" алпелисибом="" дикого="" типа="" p=""> 0,99 (нс). а.е., условные единицы. Чтобы оптимизировать просмотр этого изображения, ознакомьтесь с онлайн-версией этой статьи на сайте www.kidney-international.org.

Как ингибитор фосфоинозитид 3-киназы алпелисиб используется при синдроме Лоу/болезни Дента?

1. РЕЗУЛЬТАТЫ

1.1 Ингибиторы PI3K класса I снижают агрегацию актина в клетках OCRL-KO HK2

Мы использовали редактирование гена CRISPR-Cas9 для нокаута (KO) OCRL в клеточной линии HK2, чтобы можно было протестировать PI3K класса I (фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторы характерной агрегации актина в эндолизосомальных компартментах.^7,9,10,14Вестерн-блоттинг подтвердил снижение экспрессии OCRL на 98,0± 0,7% в лизатах клеток KO HK2 (рис. 1b). OCRL KO повторяет фенотип актиновой корзины в клетках HK2, на что указывает повышенное перекрывание между F-актином и ранним эндосомным антигеном 1 (EEA1), количественно оцененное с помощью z-стеков конфокальной микроскопии Airyscan (рис. 1c-e). Это повышенное перекрывание, наблюдаемое в клетках OCRL KO, было обращено вспять обработкой копанлисибом (C), широким спектром PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)ингибитор, который нацелен на p110a и d и, в меньшей степени, на изоформы p110b и g (рис. 1с). С помощью вестерн-блоттинга экстрактов цельных клеток HK2 мы обнаружили, что PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)Регуляторные субъединицы p110 a, b и d были хорошо экспрессированы как в клетках дикого типа (WT), так и в клетках KO, при этом присутствовали только следовые уровни изоформы p110g (дополнительная фигура S1A).

Отличили ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа)специфичность ингибирования F-актина с использованием алпелисиба (A), селективного ингибитора p110a, и GSK2636771 (G) и иделализиба (I), селективных ингибиторов p110b и p110d, соответственно (дополнительная фигура S1A). Хотя лечение алпелисибом давало аналогичное снижение эндосомальной полимеризации актина по сравнению с копанлисибом (рис. 1d), GSK2636771 и иделалисиб мало влияли на накопление актина (рис. 1e). Класс I ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторы не имели повышенной токсичности в отношении OCRL KO по сравнению с немодифицированными клетками, основываясь на анализе MTT (дополнительная фигура S1B).

1.2 Алпелисиб и нокдаун p110a восстанавливают актиновый фенотип в клетках HK2

В наших последующих исследованиях мы сосредоточились на алпелисибе, поскольку он является наиболее селективным и наименее токсичным PI3K.фосфоинозитид 3-киназа)ингибитор, разработанный к настоящему времени, и в настоящее время используется для лечения мозаичной гиперактивации PI3K класса Ia у детей с синдромом PROS/CLOVES.²²Алпелисиб уменьшал актиновые корзины в клетках OCRL KO HK2 в зависимости от дозы (рис. 2а). Эффекты наблюдались при дозе 10 мМ уже через 4 часа после обработки без явной токсичности (дополнительная фигура S2). Чтобы проверить, является ли PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)ингибирование алпелисибом было источником снижения окрашивания актина, мы специально уменьшили его мишень, субъединицу p110a, с помощью siRNA (рис. 2b). По сравнению с обработкой контрольной (перемешанной последовательности) миРНК, миРНК против p110a приводила к истощению белка p110a на 78,3 ± 4,8% и 68,9 ± 7,7% в клетках WT и OCRL KO HK2, соответственно, что отражалось в значительном уменьшении актиновых корзин ( Рисунок 2с).

1.3 Снижение уровней PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 и PI(3)P в обработанных алпелисибом клетках HK2

Чтобы изучить, как на фосфоинозитидные липиды влияет OCRL KO и обработка алпелисибом, мы окрашивали клетки HK2 антителами или белковыми доменами против PI(3,4,5)P3, PI(3)P и PI(4,5)P2, используя оптимизированные условия фиксации для плазматической мембраны или внутриклеточного окрашивания.^24,25PI(3,4,5)P3 имеет диффузную локализацию на плазматической мембране, а обработка алпелисибом (10 мМ) вызывала сильное снижение окрашивания PI(3,4,5)P3 в клетках WT и OCRL KO, как показано на рис. ожидаемый от его механизма действия и специфичности для класса IA ​​PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)p110a (рис. 3а). Ожидается, что PI(3,4,5)P3 будет постепенно дефосфорилироваться по мере того, как мембраны подвергаются эндоцитозу и доставляются в эндосомы.^14,26,27Фиксируя клетки таким образом, чтобы внутриклеточный PI(3)P сохранялся,²⁵мы обнаружили, что PI(3)P punctae также снижался при лечении алпелисибом (дозозависимым образом, что видно из таких низких концентраций, как 10 мМ при обработке в течение 16- часа) как в клетках WT, так и в клетках OCRL KO (рис. 3b). и дополнительный рисунок S2C). Как и ожидалось, нокаут OCRL в клетках HK2 вызывал заметное повышение уровней PI(4,5)P2 как на плазматической мембране (рис. 3c), так и внутриклеточно (рис. 3d) по сравнению с клетками дикого типа.^10,28Лечение алпелисибом заметно снижало повышение PI(4,5)P2, генерируемого OCRL KO, в обоих компартментах, тогда как на клетки дикого типа оно не влияло (рис. 3c и d). Сообщается, что алпелисиб ингибирует PI 4-киназу b с 50 процентной ингибирующей концентрацией 0,5 мМ,¹⁹что является возможным источником снижения PI(4,5)P2. В совокупности наши данные свидетельствуют о том, что алпелисиб ингибирует сборку актина на эндосомах OCRL KO посредством биспецифического воздействия на уровни PI(4,5)P2 и PI(3)P.

Рисунок 4|Алпелисиб устраняет дефекты актина Oral в культуре гуманизированного Ocrl^Y/-PTC мыши (m PTC). ( а ) Репрезентативные конфокальные микрофотографии Z-проекции максимальной интенсивности OcrlY / + или Ocrl.^Y/-m ПТК, обработанные диметилсульфоксидом (ДМСО) или 10 мМ алпелисибом в течение 16 часов, а затем зафиксированные 4-процентным формальдегидным фиксатором и иммуномеченые на актин (фаллоидин) (белый) и 40,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (синий) с количественным определением степени присутствия стрессовых волокон в каждом состоянии, показывающим, что стрессовые волокна теряются в Ocrl.^Y/-m PTC восстанавливаются при лечении алпелисибом. Линии указывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего, а точки данных указывают каждую область визуализации: N =5 областей визуализации на условие (каждая содержит примерно 15–20 клеток). Значимость оценивали с помощью обычного дисперсионного анализа (ANOVA) с критерием множественных сравнений Холма-Сидака, **P=0,001, множественные сравнения; Ocrl Y/+ ДМСО в сравнении с Ocrl^Y/-ДМСО **

P=0.002, окрл^Y/-ДМСО против Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/+ ДМСО по сравнению с Ocrl^Y/- альпелисиб P=0,50 (незначительно [нс]). Стержни=20мм. ( b ) Репрезентативные трехмерные изображения поверхности Ocrl m PTC с большим увеличением, обработанные ДМСО или 10 мМ алпелисибом в течение 16 часов, а затем зафиксированные 4-процентным формальдегидным фиксатором и иммуномеченые для раннего эндосомного антигена 1 (EEA1) (фиолетовый), актин ( фаллоидин, желтый) и DAPI (синий), и количественная оценка, иллюстрирующая восстановление актин-эндосомального перекрытия с помощью алпелисиба. Изображения с меньшим увеличением, показывающие обзоры (продолжение)

Рисунок 4|(продолжение) эти области показаны на дополнительном рисунке S4B и дополнительных фильмах S1 – S3. Линии показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего. N=42, 47 и 45 случайно выбранных полей для OcrlY/++ДМСО, Ocrl^Y/-þ ДМСО и окрил^Y/-- условия альпелисиба, соответственно, в каждом случае объединены из 4 почек мыши на условие. Значимость была проверена с помощью дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса (KW) с тестом множественных сравнений Данна: общее ***P < 0,001,="" множественные="" сравнения;="" ocrly/+="" дмсо="" по="" сравнению="" с="">^Y/-ДМСО и окрил^Y/-ДМСО против Ocrl^Y/-альпелисиб ***P < 0,001;="" ocrly/+="" дмсо="" по="" сравнению="" с="">^Y/-альпелисиб P > 0,99 (нс). Стержни=1 мм. (c) Репрезентативные конфокальные микрофотографии OcrlY/þ или Ocrl.^Y/-m ПТК, обработанные ДМСО или 10-мМ алпелисибом, а затем зафиксированные с помощью аппарата Гольджи и помеченные с использованием зонда m Ch-2xFYVE PI(3)P (пурпурный) и DAPI (голубой), с количественным определением количество PI(3)P-позитивных точек, обнаруженных в клетках. Клетки N=188, 177, 246 и 206 из OcrlY/+ + ДМСО, OcrlY/+ + алпелисиб, Ocrl^Y/-þ ДМСО и окрил^Y/-+ алпелисиб соответственно; клетки объединяли из 3 пероральных почек на группу. Тест KW: общий ***P < 0.001,="" множественные="" сравнения;="" ocrly/+="" дмсо="" по="" сравнению="" с="">^Y/-ДМСО, OcrlY/+ ДМСО по сравнению с OcrlY/+ алпелисибом и Ocrl^Y/-ДМСО против Ocrl^Y/-альпелисиб, все ***P < 0.001.="" стержни="20" мм.="" (d)="" репрезентативные="" конфокальные="" микрофотографии="" ocrly/þ="" или="">^Y/-m PTC, обработанные ДМСО или 10 мМ алпелисиба в течение 16 часов, затем зафиксированные 4-процентным формальдегидным фиксатором и иммуномеченые фосфатидилинозитолом (PI) 4,5-бисфосфатом [PI(4,5) P2] (желтый) и DAPI (голубой), с количественным определением количества PI(4,5)P2-положительных точек, показывающих увеличение точек PI(4,5)P2 в Ocrl^Y/-клеток, который снижается при лечении алпелисибом. N=477, 444, 423 и 494 из OcrlY/+ + ДМСО, OcrlY/+ + алпелисиб, Ocrl^Y/-þ ДМСО и окрил^Y/-+ алпелисиб соответственно; клетки объединяли из 3 пероральных почек на группу. Тест KW: общий ***P < 0.001,="" множественные="" сравнения;="" ocrly/+="" дмсо="" по="" сравнению="" с="">^Y/-ДМСО, OcrlY/+ ДМСО по сравнению с OcrlY/+ алпелисибом и Ocrl^Y/-ДМСО против Ocrl^Y/-альпелисиб, все ***P < 0.001.="" стержни="20" мм.="" чтобы="" оптимизировать="" просмотр="" этого="" изображения,="" ознакомьтесь="" с="" онлайн-версией="" этой="" статьи="" на="" сайте="">

1.4 Алпелисиб уменьшает внутриклеточные фосфоинозитиды и устраняет дефекты цитоскелета в Ocrl^Y/-м PTC

Затем мы проверили, оказывает ли алпелисиб такие же эффекты на первичные клетки клеток PT, полученных из гуманизированной мышиной модели с дефицитом OcrI (Ocrl^Y/-), который повторяет аномальную полимеризацию актина и эндоцитозный дефект, наблюдаемый в клетках, полученных от пациентов.^10,11Мышиные PTC (m PTC) экспрессировали аналогично PI3K класса I (фосфоинозитид 3-киназа) регуляторные субъединицы клеток HK2 как у WT, так и у Ocrl^Y/-мышей и продемонстрировал аналогичный профиль токсичности по отношению к алпелисибу при оценке с помощью анализов МТТ (дополнительная фигура S3). Визуализация с помощью конфокальной микроскопии выявила поразительное нарушение нормальной архитектуры стрессовых волокон F-актина в m PTC из Ocrl.^Y/-по сравнению с мышами OcrlY/+, вероятно, из-за перемещения регуляторных белков актина из их нормального клеточного местоположения в эндосомы, т.к. большие скопления актина окружают эти органеллы и, как полагают, являются источником дефекта переноса.^10,29Лечение ОКРЛ^Y/- m ПТК с алпелисибом (10 мМ) восстанавливали архитектуру стрессовых волокон (рис. 4а).

Как ингибитор фосфоинозитид 3-киназы алпелисиб используется при синдроме Лоу/болезни Дента?

В качестве основной проблемы вСиндром Лоу и болезнь Дента2, это снижение эндосомального переноса и последующая деградация мегалина, мы стремились отличить эндосомальный актин от стрессовых волокон. Мы собрали конфокальные z-стеки лазерного сканирования по всем клеткам, реконструировали картину окрашивания в трехмерных изображениях поверхности и использовали форму / параметры размера для определения точечных актиновых структур и степени, в которой они перекрываются с эндосомальными структурами (дополнительный рисунок S4 и фильмы S1). –С3). Этот анализ показал, что лечение алпелисибом снижает аберрантную полимеризацию F-актина в эндосомах, окрашенных EEA1, в отличие от архитектуры стрессовых волокон (рис. 4b). m PTC, полученные из Ocrl^Y/-мыши показали значительные изменения внутриклеточного окрашивания на PI(3)P (уменьшение) и PI(4,5)P2 (увеличение) по сравнению с m PTC от мышей WT OcrlY/+ (рис. 4c и d). Лечение m PTC от Ocrl^Y/- мышей с alpelisib привело к значительному снижению внутриклеточного окрашивания PI (3) P и PI (4,5) P2 (рис. 4c и d).

1.5 Алпелисиб улучшает поглощение эндоцитами Ocrl^Y/-м PTC

Затем мы оценили, приводит ли влияние алпелисиба на дефекты цитоскелета и везикул, наблюдаемые в m PTC, к изменениям способности эндоцитарного поглощения. Чтобы дифференцировать влияние алпелисиба на связывание и/или интернализацию лиганда, mPTC сначала инкубировали с меченым бычьим сывороточным альбумином (BSA), чтобы вызвать связывание зонда с эндоцитарными рецепторами, а затем инкубировали с питательной средой, чтобы следить за интернализацией альбумина (рис. 5а). Окрл^Y/-показали более низкое связывание Alexa 488-бычьего сывороточного альбумина с плазматической мембраной наряду с нарушением интернализации альбумина по сравнению с клетками OcrlY/þ. Лечение алпелисибом восстановило как связывание, так и поглощение альбумина в Ocrl.^Y/-клетки с 50-процентным общим сохранением эндоцитарного поглощения (рис. 5b и c). Эти данные были подтверждены измерением общего поглощения альбумина (дополнительные рисунки S5a и b). Мы отметили, что соотношение интернализованного/связанного бычьего сывороточного альбумина Alexa оставалось одинаковым в различных условиях (рис. 5d), что означает, что сниженное поглощение альбумина в основном связано с нарушением связывания, а не с дефектом процесса интернализации как такового.

1.6 Алпелисиб улучшает дисфункцию PT и рецептор-опосредованный эндоцитоз в Ocrl^Y/- мышей

Мы проверили потенциальный терапевтический эффект алпелисиба на дисфункцию PT in vivo. Мышам перорально вводили либо носитель, либо алпелисиб (50 мг/кг массы тела в день) через желудочный зонд в течение 6 недель (рис. 6а). Этот режим был выбран в соответствии с предыдущими исследованиями in vivo, демонстрирующими эффективность и безопасность.^22,30В связи с тем, что введение алпелисиба вызывает резистентность к инсулину и гипергликемию,²²лечение алпелисибом приводило к значительному увеличению глюкозурии как у Ocrl Y/+, так и у пероральных^Y/-мышей, что можно рассматривать как биомаркер для дозирования лекарств (дополнительная таблица S1). Через 6 недель лечения алпелисибом Ocrl^Y/-у мышей наблюдалось значительное снижение экскреции с мочой белков LMW CC16 (-34 процентов) и альбумина (-38 процентов) по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (рис. 6b и c), в то время как объем моча и другие параметры не изменились (дополнительная таблица S1). Мыши обоих генотипов, получавшие алпелисиб, показали аналогичное снижение скорости роста по сравнению с контрольными мышами, как описано ранее.²²Тем не менее, как носитель, так и мыши, получавшие лечение, набрали массу тела, что указывает на то, что препарат не оказывает серьезного влияния на постнатальное развитие (рис. 6d и дополнительная таблица S1).

Чтобы проверить, отражает ли действие алпелисиба на низкомолекулярную протеинурию восстановление рецептор-опосредованного эндоцитоза в PT-клетках, мы проследили поглощение in vivo Cy5-меченого b-лактоглобулина в почках мышей. Ocrl, обработанный алпелисибом^Y/-у мышей наблюдалось значительное восстановление поглощения Cy5-меченого b-лактоглобулина, близкое к степени интернализации, наблюдаемой у мышей OcrlY/þ, получавших носитель (рис. 6e). Это было отражено значительным восстановлением экспрессии эндоцитарного рецептора мегалина в клетках PT, что наблюдалось с помощью иммуномечения и вестерн-блоттинга лизатов почек Ocrl, обработанных алпелисибом.^Y/-мышей; обратите внимание, что экспрессия маркера PT AQP1 не изменилась (рис. 6f и g и дополнительные рисунки S5C и D). Эти данные показывают, что PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)ингибитор алпелисибвызывает существенное улучшение эндоцитарного механизма PT и снижает низкомолекулярную протеинурию в гуманизированной мышиной модели синдрома Лоу.

Рисунок 5|Алпелисиб улучшает поглощение гуманизированного Ocrl эндоцитами^Y/-PTC мыши (m PTC). ( а ) Схема, иллюстрирующая эксперимент с отслеживанием импульсов, использованный для изучения связывания и интернализации Alexa 488-бычьего сывороточного альбумина (BSA) в m PTC. Клетки подвергали воздействию Alexa 488-BSA (0,2 мг/мл) в течение 1 часа при 4 градусах, чтобы позволить BSA связываться с рецепторами клеточной поверхности (пульс), а затем нагревали до 37 градусов в клеточной среде. за 20 минут до фиксации, чтобы обеспечить интернализацию лиганда (преследование). (b) Репрезентативные конфокальные микрофотографии OcrlY/+ или Ocrl.^Y/-m PTC, обработанные диметилсульфоксидом (ДМСО) или 10 мМ алпелисиба в течение 16 часов и подвергнутые Alexa 488-BSA (зеленый) эксперименту по импульсной погоне, прежде чем фиксироваться и метиться для 40,6-диамидино{ {6}}фенилиндол (DAPI) (синий). Импульсная фаза эксперимента показана на верхней панели для каждого условия, а последовательность показана ниже. Стержни=20 мм. (c) Количественная оценка Alexa 488-BSA на клеточной поверхности (i) и интернализированного Alexa 488-BSA (ii), оцененная как средняя интенсивность флуоресценции FL на клетку. Алпелисиб восстанавливает восстановленное связывание и интернализацию BSA, наблюдаемое в Ocrl.^Y/-клетки. N=209, 228, 186 и 196 клеток для OcrlY/+ ДМСО, OcrlY/+ алпелисиб, OcrlY/ДМСО и Ocrl^Y/-условия alpelisib, соответственно в (i) и клетках N=203, 183, 199 и 233 для OcrlY/+ ДМСО, OcrlY/+ alpelisib, Ocrl^Y/-ДМСО и окрил^Y/-условия альпелисиба соответственно в (ii), в каждом случае объединенные из 2 почек мыши на условие; каждая точка данных представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции FL в отдельной клетке. Значимость была проверена с помощью дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса (KW) (ANOVA) с критерием множественных сравнений Данна: для (i) BSA клеточной поверхности, общий ***P < 0,001,="" множественные="" сравнения:="" ocrly/+="" дмсо="" против="">^Y/-ДМСО и окрил^Y/-ДМСО против Ocrl^Y/-альпелисиб ***P < {{0}},001;="" ocrly/+="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ocrly/+="" алпелисиб="" p="0,60" (незначительно="" [нс]);="" для="" (ii)="" интернализованного="" бса,="" общий="" ***p="">< 0,001,="" множественные="" сравнения:="" ocrly/+="" дмсо="" против="">^Y/-ДМСО и окрил^Y/-ДМСО против Ocrl^Y/-альпелисиб ***P < 0,001;="" ocrly/+="" дмсо="" по="" сравнению="" с="" ocrly/+="" alpelisib="" p="0,66" (нс).="" (="" d="" )="" количественная="" оценка="" соотношения="" между="" интенсивностью="" флуоресценции="" alexa="" 488-="" bsa="" клеточной="" поверхности="" и="" интернализованной="" alexa="" 488-bsa="" fl,="" не="" показывающая="" существенных="" различий="" в="" соотношениях="" между="" каждым="" состоянием.="" каждая="" точка="" представляет="" собой="" среднее="" значение="" отношения="" в="" поле,="" содержащем="" примерно="" 15–20="" клеток="" (n="13," 13,="" 10="" и="" 11="" случайно="" выбранных="" полей="" для="" ocrly/+="" дмсо,="" ocrly/+="" алпелисиб,="">^Y/-ДМСО и окрил^Y/-alpelisib, соответственно, в каждом случае объединены из 2 почек мыши на условие). Значимость была проверена с помощью KW ANOVA с тестами множественных сравнений Данна: общий P=0,46 (нс), множественные сравнения: OcrlY/+ ДМСО против Ocrl^Y/-ДМСО и окрил^Y/-ДМСО против Ocrl^Y/-алпелисиб P > 0,99 (нс); OcrlY/+ ДМСО по сравнению с OcrlY/+ алпелисибом P=0,84 (нс). Чтобы оптимизировать просмотр этого изображения, ознакомьтесь с онлайн-версией этой статьи на сайте www.kidney-international.org.

Рисунок 6|Алпелисиб улучшает функцию проксимальных канальцев (PT) у мышей OcrlY/L, восстанавливая поглощение лиганда и экспрессию мегалина. (а) Экспериментальная установка. Оральным мышам в течение 6 недель вводили ежедневную пероральную дозу либо 1% карбоксиметилцеллюлозы (носитель), либо алпелисиб (50 мг/кг массы тела). В последний день лечения мышам вводили Cy5-меченый b-лактоглобулин (N=6 Ocrl^Y/-, или 8 окр.^Y/-мышей на группу). (b–d) Показанные значения D указывают на среднее изменение от BL до D42 для условия ± SEM. (b) белок клеток Clara 16 (CC16), (c) выделение альбумина с мочой (оба в течение 15 часов) и (d) массу тела измеряли у мышей OcrlY/-, получавших либо носитель, либо алпелисиб в указанный момент времени. Каждая точка представляет 1 мышь. Значимость оценивали с помощью 2-хвостатого парного критерия Стьюдента; в (b) CC16 (продолжение)

Рисунок 6|(продолжение) изменение выпуска по сравнению с исходным уровнем; + носитель, P=0,9802 (незначительно [нс]), + alpelisib, *P=0,0334; в (с) изменение выхода альбумина по сравнению с исходным уровнем; + носитель, P=0,0502 (нс), + алпелисиб, ***P=0,0006; в (d) изменение массы тела относительно исходного уровня; + носитель, ***P <0,0001, +="" алпелисиб,="" **p="0,0083." (e)="" репрезентативные="" конфокальные="" микрофотографии,="" показывающие="" cy5-помеченный="" b-лактоглобулин="" (пурпурный)="" через="" 15="" минут="" после="" инъекции="" в="" хвостовую="" вену="" и="" помеченный="" для="" 40,6-диамидино-2-фенилиндола="" (dapi)="" (голубой),="" плюс="" количественная="" оценка="" соответствующих="" флуоресцентных="" сигналов="" fl="" от="" почек="" мышей="" ocrl="" (n="412," 500="" и="" 588="" канальцев,="" соответственно,="" для="" носителя="" ocrly/+,="">^Y/-þ транспортное средство и Ocrl^Y/-+ алпелисиб) по 3 мыши на группу лечения. Поглощение b-лактоглобулина восстанавливается при лечении алпелисибом. Стержни ¼ 20 мм. В количественных оценках каждая точка представляет интенсивность флуоресценции FL, нормализованную по площади канальца; нанесенные на график данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Значимость оценивали с помощью теста Крускала-Уоллиса (KW) с последующим тестом множественных сравнений Данна; ***P < 0,001,="" множественные="" сравнения;="" средство="" ocrly/þþ="" по="" сравнению="" с="">^Y/-þ транспортное средство и Ocrl^Y/-þ автомобиль по сравнению с Ocrl^Y/-+ алпелисиб, оба ***P < 0,001.="" (="" f="" )="" вестерн-блоттинг="" и="" денситометрический="" анализ="" уровней="" мегалина="" в="" лизатах="" целых="" почек="" мышей="" oral.="" а-тубулин="" использовали="" в="" качестве="" контроля="" загрузки.="" пониженная="" экспрессия="" мегалина="" в="">^Y/-спасает алпелисиб. При количественном анализе денситометрии каждая точка представляет 1 мышь (N=4 OcrlY/++ носитель и Ocrl^Y/-þ транспортное средство и N=3 Ocrl^Y/-+ мыши алпелисиб); линии показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Значимость оценивали с помощью 2-хвостового непарного t-критерия Стьюдента: OcrlY/++ носитель по сравнению с Ocrl.^Y/-þ транспортное средство; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ автомобиль по сравнению с Ocrl^Y/- þ алпелисиб, *P=0.0246. (g) Репрезентативные конфокальные микрофотографии со вставками с большим увеличением и количественной оценкой интенсивности мегалина (желтый) в PT AQP1+ (пурпурный) из пероральных почек также были помечены для DAPI (голубой), иллюстрирующие восстановление уровней мегалина после лечения алпелисибом. Стержни=20 мм. В количественных оценках каждая точка представляет интенсивность флуоресценции FL, нормализованную по площади канальца; нанесенные на график данные показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего; N=142, 191 и 266 канальцев соответственно для OcrlY/++ носителя, Ocrl^Y/-þ транспортное средство и Ocrl^Y/-+ алпелисиб для 3 мышей на группу лечения. Значимость оценивали с помощью дисперсионного анализа KW с последующим тестом множественных сравнений Данна; общий ***P < 0.001,="" множественные="" сравнения;="" средство="" ocrly/þþ="" по="" сравнению="" с="">^Y/-þ транспортное средство и Ocrl^Y/-þ автомобиль по сравнению с Ocrl^Y/-+ алпелисиб, оба ***P < 0,001.="" чтобы="" оптимизировать="" просмотр="" этого="" изображения,="" ознакомьтесь="" с="" онлайн-версией="" этой="" статьи="" на="" сайте="">

Как ингибитор фосфоинозитид 3-киназы алпелисиб используется при синдроме Лоу/болезни Дента?

2. ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время не существует лечения для облегчения дефекта эндоцитоза, вызывающего дисфункцию PT уСиндром Лоу и болезнь Дента2. Наши результаты показывают, что алпелисиб смягчает аберрантный актиновый фенотип за счет снижения уровней PI(4,5)P2 и PI(3)P, вызывая существенное улучшение эндоцитарного механизма и абсорбционной способности в клеточных системах и гуманизированной мышиной модели для Синдром Лоу/болезнь Дента 2. Эти результаты подтверждают связь между фосфоинозитидными липидами, полимеризацией актина и переносом эндоцитов, что имеет прямое отношение к высокоактивным эпителиальным клеткам, участвующим в важнейших гомеостатических процессах (рис. 7). Учитывая отсутствие эффективных методов лечения и кажущуюся безопасность этого класса PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторов, алпелисиб является многообещающим кандидатом для повторного назначения лекарственного средства вСиндром Лоу и болезнь Дента.

Протеинурия LMW является наиболее постоянным признаком, встречающимся у пациентов сСиндром Лоу и болезнь Дента2 из-за инактивирующих мутаций в OCRL.⁴Эти низкомолекулярные белки могут быть легко обнаружены и количественно определены, предлагая верный биомаркер дефектного рецептор-опосредованного эндоцитоза в PT-клетках. Протеинурия LMW особенно актуальна, поскольку она обнаруживается более последовательно и часто раньше, чем другие растворенные вещества (например, глюкоза, фосфат, аминокислоты), входящие в состав классического «почечного синдрома Фанкони» — по крайней мере, при врожденных нарушениях эндолизосомного пути.¹Здесь мы показываем, что алпелисиб восстанавливает способность апикального эндоцитарного поглощения PT-клеток in vitro и in vivo благодаря восстановлению уровней рецептора мегалина на плазматической мембране. Этот эффект отражается в значительном снижении потери с мочой низкомолекулярных белков (CC16 и альбумина) у Ocrl.^Y/-мышей, получавших алпелисиб в течение 6 недель. Эти эффекты алпелисиба наблюдались в m PTC, которые сохраняют свою апикальную дифференцировку и особенно хорошо подходят для изучения рецептор-опосредованного эндоцитоза в физиологии и патологии.⁹ В частности, мы получили m PTC от модели гуманизированных мышей, экспрессирующих человеческий INPP5B в Ocrl.^Y/-; Inpp5b^-/-фон, что позволяет нам исследовать конкретные последствия потери активности OCRL.^11,23

Спасение от эндоцитоза алпелисибом объясняется его влиянием на актиновый аппарат, что четко проявляется в клетках OCRL KO HK2 и m PTC. Таким образом, наши наблюдения подтверждают и расширяют предыдущие исследования, показывающие связь между контролем баланса фосфоинозитидов и F-актином в раннем эндосомальном пути у пациентов с OCRL и клетками KO.^7,10Функциональная потеря активности OCRL ухудшает деградацию PI(4,5)P2, что, в свою очередь, приводит к неспособности вскрыть покрытые клатрином везикулы, что приводит к аберрантным эндосомальным органеллам в различных типах клеток, включая PT-клетки.^7-10Недавно мы показали, что избыток F-актина снижает рециркуляцию мультилигандного рецептора мегалина к апикальной мембране PT-клеток, вызывая дефектный эндоцитоз и низкомолекулярную протеинурию.¹¹

Наши данные показывают, что механизм действия алпелисиба на эндосомальный актин возникает из-за биспецифического эффекта ингибирования алпелисибом: сначала на продукцию PI(3,4,5)P3 и его превращение в PI(3)P, а затем на производство PI(4,5)P2. Снижение уровня PI(4,5)P2 напрямую противодействует дефициту OCRL и согласуется с предыдущими работами по уменьшению избытка актина и увеличению эндоцитарного оттока за счет снижения уровней фосфатидилинозитол 4-фосфат 5-киназы. , фермент, который генерирует PI(4,5)P2.¹⁰Алпелисиб имеет 0.5 мМ 50-процентную ингибирующую концентрацию в отношении киназы PI4Kb, генерирующей PI(4,5)P2, которая может быть ответственной или может быть результатом более общего воздействия на баланс фосфоинозитидов в результате комбинации OCRL КО и лечение алпелисибом. Мы определили, что класс IA PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)ингибирование алпелисибом имеет отношение к ингибированию актина, поскольку опосредованное миРНК истощение p110a ингибирует накопление актина аналогично лечению алпелисибом и копанлисибом (о котором не сообщается об ингибировании PI4K). В клетках RPE мы ранее наблюдали, что миРНК INPP4A, которая превращает PI(3,4)P2 в PI(3)P, ингибирует сборку актина в клетках OCRL KO, обеспечивая путь от ингибирования PI(3,4,5) Производство P3 к снижению эндосомального PI(3)P. Мы показали, что некоторое количество PI(3)P остается, предположительно пул, продуцируемый в ранней эндосоме PI3K класса III, Vps34, потому что мы обнаружили, что эндосомальный перенос усиливается, а не подавляется при лечении алпелисибом. Сложная корегуляция метаболизма PI и ее значение для инактивации OCRL также были подчеркнуты в недавнем исследовании, в котором некаталитические функции фосфоинозитид 3- фосфатазы PTEN активируют деградацию PI(4,5)P2 посредством PLCXD, облегчая клеточные фенотипы и абсорбцию лиганды в модели рыбок данио.³¹

Облегчение актинового фенотипа за счет снижения уровней PI(4,5)P2 и PI(3)P при лечении алпелисибом согласуется с синергетическим действием PI(4,5)P2 и PI(3)P в рекрутировании SNX9 для активации актиновый механизм в эндосомах Ocrl,¹⁴предполагая очень эффективное совпадение специфичности алпелисиба для манипулирования молекулярной регуляцией активации актина в эндосомах. В свою очередь, как показано ранее, снижение сборки эндосомального актина, в свою очередь, приводит к улучшению эндоцитоза PT в OCRL-дефицитных клетках.¹⁰Потребуется дальнейшая характеристика, чтобы лучше понять, является ли регуляция актина посредством метаболизма фосфоинозитидов истинным источником терапевтического эффекта, который мы наблюдаем при применении алпелисиба в Ocrl.^Y/-модель мыши. Потому что класс I ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа)регулируют пути, которые контролируют рост клеток, пролиферацию, выживание, метаболизм и аутофагию,³²мы не можем исключить, что спасение эндоцитов связано с прямым воздействием на PI(3,4,5)P3 и комбинированным действием на другие пути, модулируемые PI3K класса I. Также требуется дополнительная работа, чтобы проверить, работает ли PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)ингибиторы могут также облегчать неврологические и другие клинические проявления у пациентов с мутациями OCRL.⁴

Недавний опыт применения алпелисиба у педиатрических пациентов с синдромом PROS/CLOVE позволяет предположить, что препарат может хорошо переноситься. Алпелисиб принимается перорально, избирательно воздействует на изоформу PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)класс I и показывает профиль незначительной токсичности по сравнению с ингибиторами пан-PI3K. Поскольку алпелисиб не полностью блокирует PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)активности, тем самым поддерживая функции сигнального пути, он может быть особенно подходящим для длительного применения. Интересно, что гипергликемию, возникающую при применении алпелисиба, можно контролировать путем изменения диеты.²²Поскольку дисфункция PT является первым проявлением заболевания почек, наблюдаемым у детей раннего возраста с болезнью Дента 2 и синдромом Лоу, раннее лечение такой дисфункции PT, приводящее к улучшению метаболического профиля и роста, может поэтому замедлить прогрессирование до хронического заболевания почек и, следовательно, иметь значительное влияние на продолжительность и качество жизни.³³Хотя проявления мутации OCRL особенно широки, недавние исследования, основанные на больших когортах генотипированных пациентов с синдромом Лоу или болезнью Дента 2, не показали значительного влияния типа мутации или локализации мутации на почечную выживаемость.³⁴В совокупности наши данные подчеркивают потенциал повторного использования алпелисиба для лечения дисфункции PT при синдроме Лоу/болезни Дента 2, что обеспечивает основу для быстрого и рентабельного применения в клинических испытаниях на людях.

3. МЕТОДЫ

3.1 Полную информацию можно найти в дополнительных методах.

Клетки HK2 обрабатывали копанлисибом, алпелисибом, GSK2636771 или иделалисибом в указанных концентрациях в течение 16 часов, если не указано иное. Белки экстрагировали стандартными методами из клеток или тканей почек и проводили вестерн-блоттинг с использованием опубликованных или коммерчески доступных антител. Нокдаун миРНК осуществляли с помощью 2 трансфекций за 72 и 24 часа до анализа. Мы использовали OcrlY/+, соответствующие возрасту и полу; Inpp5b^{- /-}; и окрл^Y/-; Inpp5b^-/- однопометные мыши, несущие экспрессию BAC-INPP5B. Первичные культуры m PTC были получены из почек, собранных у 8-недельных мышей Ocrl, и эндоцитарная способность пероральных m PTC была оценена путем измерения поглощения альбумина. Лечение алпелисибом проводилось в дозе 10 мМ в течение 16 часов, если не указано иное. Поглощение альбумина в m PTC оценивали с использованием протокола «импульс-преследование» для оценки апикального связывания и результирующего поглощения. m PTC окрашивали в течение ночи соответствующим первичным антителом и в течение 45 минут подходящими вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором FL, и/или Alexa-488 Phalloidin. Окрашивание PI(3)P на m PTC проводили с использованием доменного зонда FYVE. Анализ изображений был выполнен с помощью CellProfifiler с использованием пользовательских конвейеров для измерения перекрытия актина/EEA1 и количества точек, а также с помощью ImageJ для измерения интенсивности иммунофлуоресценции и обнаруженных краев для расчета оценки стрессовых волокон. Количественные данные выражали как среднее ± стандартная ошибка среднего. Для экспериментов in vivo мышам в возрасте 6 недель вводили носитель или алпелисиб в дозе 50 мг/кг массы тела. Мочу собирали каждые 14 дней, и животных умерщвляли после 42 дней лечения с забором крови и почек. Эндоцитарную способность PT мышей Oral исследовали путем измерения поглощения b-лактоглобулина.

4. РАСКРЫТИЕ

JLG получает финансирование от AstraZeneca для обучения в своей лаборатории. SPJ входит в состав консультативных советов и владеет акциями компаний Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics и Adrestia Therapeutics, а также является научным партнером Ahren Innovation Capital. Все остальные авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

5. БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа была поддержана грантом Европейского исследовательского совета 281971, стипендией Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, стипендией Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, фондом Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, исследовательским грантом Isaac Newton Trust 18.23. (j) в пользу JLG и награду Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z в пользу SPJ, и мы признаем финансирование Института Гердона от Wellcome Trust (092096) и CRUK (C6946/A14492). Мы благодарны Фонду исследований цистинозов (Ирвин, Калифорния), Швейцарскому национальному научному фонду (проектный грант 310030_189044), Программе приоритетов клинических исследований (KFSP) RADIZ (Инициатива по редким заболеваниям, Цюрих) UZH, Швейцарской

Национальный центр компетентности в области исследований (NCCR) Контроль гомеостаза почек (Kidney.CH) за поддержку, а также NIDDK/NIH и Lowe Syndrome Trust/Великобритания за поддержку разработки мышей Oral. Мы признательны Роберту Л. Нуссбауму (Invitae Corporation и UCSF, Сан-Франциско, Калифорния) и Марии Антониетте Де Маттеис (Институт генетики и медицины Telethon, Неаполитанский университет имени Федерико II, Неаполь, Италия) за предоставление основателей колонии оральных мышей;

и Эрику Олингеру (UZH, Цюрих) за плодотворные обсуждения. Мы благодарим Nadine Näegele и Daniela Nieri за техническую помощь при сборе и анализе мочи; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Париж) за то, что он поделился с нами подробным протоколом подготовки алпелисиба к лечению in vivo; а также Ренате Козыраки и Пьеру Веррусту за предоставление реагентов. Мы также благодарим Центр микроскопии и анализа изображений Цюрихского университета (Цюрих, Швейцария) и центр Цюрихской интегративной физиологии грызунов (ZIRP) за предоставление оборудования для получения изображений и техническую поддержку во время экспериментов in vivo.

Как ингибитор фосфоинозитид 3-киназы алпелисиб используется при синдроме Лоу/болезни Дента?

6. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дополнительный файл (PDF)

Дополнительные методы и ссылки.

Таблица S1. Параметры массы тела, мочи и крови с течением времени у мышей Oral, получавших алпелисиб или носитель.

Рисунок S1. Экспрессия изоформы p110 и анализ цитотоксичности доза-реакция препарата в клетках HK2.

Рисунок 2. ПИ3Кингибитор алпелисибвосстанавливает актин-эндосомальное перекрытие и снижает уровни PI(3)P дозозависимым образом через 4 часа после лекарственного лечения в клетках HK2.

Рисунок S3. Экспрессия изоформы p110 и токсичность алпелисиба в Ocrl mPTC.

Рисунок S4. Рабочий процесс анализа перекрытия EEA1/актина в Ocrl mPTC.

Рисунок S5. Алпелисиб восстанавливает поглощение альбумина в Ocrl^Y/-мПТК. Экспрессия Aqp1 не изменяется. Дополнительный файл (фильмы)

Фильм С1. Трехмерная визуализация Imaris перекрытия EEA1/актина в OcrlY/+ mPTC, обработанных ДМСО. Репрезентативное 3D-рендеринг поверхности конфокальной стопки OcrlY/þ mPTC, обработанных ДМСО в течение 16 часов, затем зафиксированных 4-процентным формальдегидным фиксатором и иммуномеченных для EEA1 (фиолетовый), актина (фаллоидин; желтый) и DAPI (синий), иллюстрирующий немного актин/эндосомальная ассоциация. Пруток=5 мм.

Фильм С2. 3D-рендеринг Imaris перекрытия EEA1/актина в Ocrl^Y/-mPTC, обработанные ДМСО. Репрезентативное 3D-рендеринг поверхности конфокальной стопки OcrlY/- mPTC, обработанных ДМСО в течение 16 часов, затем зафиксированных 4-процентным формальдегидным фиксатором и иммуномеченных для EEA1 (фиолетовый), актина (фаллоидин; желтый) и DAPI (синий), иллюстрирующий точечный актин, ассоциированный вблизи эндосомальных структур. Пруток=5мм.

Фильм С3. 3D-рендеринг Imaris перекрытия EEA1/актина в Ocrl^Y/- мПТК, получавших алпелисиб. Репрезентативное 3D-рендеринг поверхности конфокальной стопки OcrlY/- mPTC, обработанных 10 мМ алпелисибом в течение 16 часов, затем зафиксированных 4-процентным формальдегидным фиксатором и иммуномеченных для EEA1 (фиолетовый), актина (фаллоидин; желтый) и DAPI (синий) , иллюстрирующий спасение актиновых точечных структур вокруг эндосом. Пруток=5 мм.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Ван дер Вийст Дж., Бельге Х., Бинделс Р.Дж. М., Девуйст О. Изучение физиологии на основе наследственных заболеваний почек. Physiol Rev. 2019; 99: 1575–1653.

2. Синдром Лой М. Лоу. Orphanet J Rare Dis. 2006; 1:16.

3. Льюис Р.А., Нуссбаум Р.Л., Брюэр Э.Д. Синдром Лоу. В: Адам М.П., ​​Ардингер Х.Х., Пагон Р.А. и др., ред. GeneReviews® [интернет]. Сиэтл (Вашингтон): Вашингтонский университет, Сиэтл; 1993-2020. Доступно по адресу: HTTPS://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Опубликовано 24 июля 2001 г.; Обновлено 18 апреля 2019 г. По состоянию на 8 августа 2019 г.

4. Де Маттеис М.А., Стайано Л., Эмма Ф., Девуйст О. OCRL 5-фосфатазы вСиндром Лоу и болезнь Дента2. Нат Рев Нефрол. 2017; 13: 455–470.

5. Девуйст О., Лучани А. Транспортеры хлоридов и рецептор-опосредованный эндоцитоз в проксимальных канальцах почек. Дж. Физиол. 2015; 593:4151–4164.

6. Чжан С., Джефферсон А.Б., Ауэткиат В., Майерус П.В. Белком, дефицитным при синдроме Лоу, является фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат5- фосфатаза. Proc Natl Acad Sci US A. 1995; 92:4853–4856.

7. Нандес Р., Балкин Д.М., Месса М. и соавт. Роль OCRL в динамике ямок, покрытых клатрином, и их обнажении, выявленная в исследованиях клеток синдрома Лоу. электронная жизнь. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Клеточные и физиологические функции белка синдрома Лоу OCRL1. Движение. 2014; 15: 471–487.

9. Де Лео М.Г., Стайано Л., Вичинанца М. и соавт. Слияние аутофагосомы и лизосомы запускает лизосомальный ответ, опосредованный TLR9 и контролируемый OCRL. Nat Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Вичинанца М., Ди Кампли А., Полищук Е. и соавт. OCRL контролирует транспорт через ранние эндосомы посредством PtdIns4,5P(2)-зависимой регуляции эндосомального актина. EMBO J. 2011; 30: 4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A, et al. Дефицит OCRL нарушает эндолизосомальную функцию в модели гуманизированных мышей дляСиндром Лоу и болезнь Дента. Хум Мол Жене. 2019; 28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD, et al. P-Rex1, PtdIns(3,4,5)P3- и Gbetagamma-регулируемый фактор обмена гуанин-нуклеотидов на Rac. Клетка. 2002; 108: 809–821.

13. Галлоп Дж. Л., Уолрант А., Кэнтли Л. С., Киршнер М. В. Фосфоинозитиды и кривизна мембраны переключают режим полимеризации актина посредством селективного рекрутирования Toca-1 и Snx9. Proc Natl Acad Sci US A. 2013; 110:7193–7198.

14. Daste F, Warrant A, Holst MR, et al. Контроль полимеризации актина за счет совпадения фосфоинозитидов и высокой кривизны мембраны. Джей Селл Биол. 2017;216:3745–3765.

15. Малек М., Кельковска А., Чесса Т. и др. PTEN регулирует передачу сигналов PI(3,4)P2 ниже класса I PI3K(фосфоинозитид 3-киназа). Мол Ячейка. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, et al. Локализация фосфатидилинозитол3-фосфата в клетках дрожжей и млекопитающих. EMBO J. 2000; 19: 4577–4588.

17. Фруман Д.А., Чиу Х., Хопкинс Б.Д. и соавт. ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа)пути в болезни человека. Клетка. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, et al. BAY 80-6946 представляет собой высокоселективный внутривенный PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)ингибитор с мощной активностью р110альфа и р110дельта в опухолевых клеточных линиях и моделях ксенотрансплантата. Мол Рак Тер. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C., Huang A., Chatenay-Rivauday C. и соавт. Характеристика романа и конкретного ПИ3К(фосфоинозитид 3-киназа)альфа-ингибитор NVP-BYL719 и разработка стратегии стратификации пациентов для клинических испытаний. Мол Рак Тер. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA, et al. Открытие NVP-BYL719, мощного и селективного ингибитора фосфатидилинозитол-3 киназы альфа, выбранного для клинической оценки. Bioorg Med Chem Lett. 2013; 23:3741–3748.

21. Андре Ф., Сируэлос Э., Рубовски Г. и др. Алпелисиб для лечения прогрессирующего рака молочной железы с мутацией PIK3CA и положительным гормональным рецептором. N Engl J Med. 2019; 380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH, et al. Таргетная терапия у пациентов с синдромом избыточного роста, связанным с PIK3CA. Природа. 2018; 558: 540–546.

23. Ботвелл С.П., Чан Э., Бернардини И.М. и соавт. Мышиная модель синдрома Лоу/болезни Дента 2 почечной тубулопатии. J Am Soc Нефрол. 2011; 22: 443–448.

24. Чен Р., Кан В.Х., Чен Дж. и др. Моноклональное антитело для визуализации PtdIns(3,4,5)P(3) в клетках. J Гистохим Цитохим. 2002; 50: 697–708.

25. Хаммонд Г.Р., Скьяво Г., Ирвин Р.Ф. Иммуноцитохимические методы выявляют множественные различные клеточные пулы PtdIns4P и PtdIns(4,5)P(2). Биохим Дж. 2009; 422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, et al. Динамика конверсии фосфоинозитидов в клатрин-опосредованном эндоцитарном трафике. Природа. 2017; 552:410–414.

27. Биланж Б., Бедный Ю., Ванхазебрук Б. PI3K(фосфоинозитид 3-киназа)изоформы в клеточной передаче сигналов и транспортировке везикул. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Монжан Р., Аойди Р., Дебуа П. и др. OCRL-мутированные фибробласты от пациентов с болезнью Дента -2 демонстрируют INPP5B-независимую фенотипическую изменчивость по сравнению с клетками синдрома Лоу. Хум Мол Жене. 2015; 24: 994–1006.

29. Сухи С.Ф., Нуссбаум Р.Л. Дефицит PIP2 5-фосфатазы при синдроме Лоу влияет на полимеризацию актина. Am J Hum Genet. 2002;71:1420–1427.

30. Мизрахи А., Шамай Ю., Шах Дж. и др. Опухолеспецифический PI3K (фосфоинозитид 3-киназа)ингибирование путем адресной доставки наночастиц при плоскоклеточном раке головы и шеи. Нац коммун. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, et al. PTEN снижает эндосомальные PtdIns (4,5) P2 независимым от фосфатазы образом через путь PLC. Джей Селл Биол. 2019;218:2198–2214.

32. Джин С., Кигер А.А. Координация между регуляцией и функциями RAB GTPase и фосфоинозитида. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13: 463–470. 33. Девуйст О., Кноерс Н.В., Ремуцци Г. и соавт. Редкие наследственные заболевания почек: проблемы, возможности и перспективы. Ланцет. 2014; 383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M, et al. Долгосрочные почечные исходы у детей с мутациями OCRL: ретроспективный анализ большой международной когорты. Трансплантация нефролового циферблата. 2018;33:85–94.

Из: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.05.040

Авторское право № 2020, Международное общество нефрологов. Опубликовано Elsevier Inc. Это статья в открытом доступе по лицензии CC BY (HTTP://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Институт Кембриджского университета, Теннис Корт Роуд, Кембридж, CB2 1QN, Великобритания. Электронная почта: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; или Оливье Девюйст, Институт физиологии Цюрихского университета, Цюрих, Швейцария. Электронная почта: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.⁶Эти авторы совместно руководили исследованием. Поступила в редакцию 8 августа 2019 г.; пересмотрено 1 мая 2020 г.; принято 15 мая 2020 г.; опубликовано онлайн 9 сентября 2020 г.