Фитохимический анализ, In-vitro, антипролиферативный, антиоксидантный, часть 1

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Фон:Rumex rothschildianus — единственный представитель уникальной секции рода Rumex семейства Polygonaceae. Этот вид представляет собой очень редкий небольшой двудомный однолетник, эндемик Палестины, который традиционно используется в пищу и для лечения различных заболеваний. Таким образом, текущее исследование было направлено на скрининг химических компонентов, антиоксидантов, анти-амилазы, анти-глюкозидазы, прогнозирования и цитотоксического действия четырех фракций растворителей листьев R. rothschildianus.

Методы:Сухой порошок листьев R. rothschildianus экстрагировали четырьмя растворителями с разной полярностью. Было проведено несколько качественных и количественных фитохимических тестов для определения компонентов экстрактов. Колориметрический анализ использовали для количественного определения фенолов, флавоноидов и дубильных веществ. Были проведены анализы in vitro для оценки экстрактов на антиоксидантную, анти-амилазную, анти-глюкозидазную активность и прогнозирование ингибирующей активности, а также цитотоксичность с помощью анализа MTS в отношении линии клеток карциномы шейки матки (HeLa) и линии клеток рака молочной железы. (МКФ7).

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Полученные результаты:Ацетоновая фракция листьев R. rothschildianus показала наиболее значительнуюантиоксидантактивности, благодаря наибольшему содержанию флавоноидов и фенолов, со значением ICso 6,3±0,4 мкг/мл по сравнению с 3,1±0,9 мкг/мл для тролокса, и относительно ингибирующая активность липазы. Ацетоновая фракция показала наиболее сильную активность со значением IC50 26,3±{{10}},6 мкг/мл по сравнению с IC50 положительного контроля орлистата 12,3 мкг/мл. Тот же экстракт оказался наиболее мощным ингибитором α-амилазы и α-глюкозидазы со значениями IC50 19,1±0,7 мкг/мл и 54,9±0,3 мкг/мл соответственно по сравнению с до 28,8, 37,1±0,3 мкг/а акарбозы соответственно. Гексановая фракция показала 99,9-процентное ингибирование клеток HeLa и 97,4-процентное ингибирование клеток MCF7.

Вывод:Ацетоновая фракция листьев R. rothschildianus может служить источником биоактивных соединений для лечения окислительного стресса. Точно так же гексановая фракция указывает на многообещающий противоопухолевый потенциал R. rothschildianus. Ясно, что эти первоначальные показания требуют дальнейшей очистки от потенциально активных соединений и, в конечном счете, исследований in vivo для определения их эффективности.

Ключевые слова:Rumex rothschildianus, антиоксидант, липаза, амилаза, тролокс, фитохимия, антипролиферативная активность

Фон

Растения использовались в качестве лечебных средств с древних времен. Корни, семена, кора, листья и цветы использовались в лечебных целях. В настоящее время синтетические лекарства доступны и эффективны при лечении широкого спектра заболеваний; однако некоторые люди по-прежнему предпочитают лекарственные травы, поскольку они считаются менее вредными для человеческого организма [1,2]. Лекарственные растения по определению являются источником фитохимических соединений, обладающих терапевтической активностью. Эти свойства зависят от присутствия различных вторичных метаболитов, таких как фенолы, терпеноиды и алкалоиды [3]. Румекс Ротшильдианус Ааронс. является единственным представителем уникальной секции рода Rumex семейства Polygonaceae. Этот вид является очень редким небольшим двудомным однолетником, эндемиком Палестины. Он имеет среднюю высоту 45 см и характеризуется прямостоячими стеблями с прикорневыми черешковыми листьями, короткоопушенными у основания и короткозаостренными на верхушке. Цветки имеют диаметр 3-4 мм, а пестичные цветки имеют диаметр около 2 мм с кожистым перепончатым слоем [4]. Румекс spp. широко распространены в разных регионах Турции и представлены 22 видами. Некоторыми из наиболее распространенных видов являются R.patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus и R. caucasicus — многолетние растения, распространенные в средней и восточной Анатолии на высоте {{10 }} м над уровнем моря. Род Rumex широко используется в традиционной медицине Турции для лечения таких заболеваний, как запор, диарея и экзема [5, 6]. Род также обладает слабительным, мочегонным, жаропонижающим, ранозаживляющим и противовоспалительным действием. Многие люди в восточной части Турции используют молодые листья Rumex spp. в качестве консерванта в сырах, а также для придания пищевому аромату [7].

Были проведены различные исследования видов Rumex, например, для некоторых видов сообщалось об антимикробной активности. Некоторые биоактивные фитохимические вещества ранее были обнаружены в Rumex vicarious L, такие как каротиноиды, токоферолы, полифенолы, флавоноиды и аскорбиновая кислота, которые играют роль антиоксидантов и естественных детоксицирующих агентов. Диетическое потребление фитохимических антиоксидантов, таких как каротиноиды,фенолы, а такжефлавоноидыможет защитить от неинфекционных заболеваний у людей, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания и другие проблемы со здоровьем, связанные с окислительным стрессом [5, 8]. Известно, что вредные свободные радикалы играют важную роль во многих серьезных проблемах со здоровьем, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидный артрит, катаракта,Болезнь Альцгеймераи другие дегенеративные заболевания, связанные со старением. Антиоксиданты являются полезными компонентами, которые нейтрализуют эти свободные радикалы, прежде чем они смогут атаковать клетки, и, следовательно, они предотвращают повреждение клеточных белков, липидов иуглеводы. Для лечения заболеваний человека было предложено множество как природных, так и синтетических антиоксидантов. Такой интерес к роли антиоксидантов в здоровье человека вызвал исследования в области пищевой науки и лекарственных трав, оценивающие функцию трав как антиоксидантов. Антиоксидантное действие включает способность поглощать свободные радикалы, ингибировать перекисное окисление липидов, способность хелатировать ионы металлов, а также восстанавливающую способность [9,10].

Рак является одной из самых глобальных проблем здравоохранения. Разработка и открытие новых противоопухолевых препаратов остаются чрезвычайно важными из-за различных факторов. Эти факторы включают лечение, которое может вызвать серьезные побочные эффекты или может быть довольно дорогим. Альтернативы, более безопасные с биологической точки зрения и более доступные по цене, по-прежнему весьма желательны [11-14].

Несколько видов растений считаются потенциальными источниками биоактивных молекул, таких как атропин из листьев белладонны, кокаин из листьев коки, винкристин из растения барвинок и многие другие, которые до сих пор играют важную роль в современной медицине [15,16].

Полезные терапевтические эффекты могут быть получены при смешивании вторичных продуктов, присутствующих в лекарственных растениях. Эти соединения в основном представляют собой вторичные метаболиты, такие как алкалоиды, стероиды, дубильные вещества, флавоноиды и фенолы, которые синтезируются и откладываются в определенных частях этих растений [17,18]. В настоящем исследовании исследуется in vitro анти-амилазная, анти- -глюкозидазная, антилипазная, антипролиферативная и антиоксидантная активность различных фракций, экстрагированных из листьев R. rothschildianus.

Методы

Растительный материал, химикаты и инструменты

Листья R. rothschildianus были собраны в западных регионах Палестины в период с февраля по март 2018 г. Они были идентифицированы доктором Нидалом Джарадатом из лаборатории фармакогнозии Национального университета Ан-Наджа под кодом образца ваучера Pharm-PCT{{3} }. Все химикаты были приобретены у Sigma-Aldrich. Спектрофотометр-УФ/Вид (Jenway Degree 7135, Стаффордшир, Великобритания), фильтровальная бумага (Whitman № 1, Вашингтон, США), шейкер (Memmert 531-25-1, Стокгольм, Швеция), ротационный испаритель (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Германия), кофемолка (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Китай), электронные весы (Radwag, AS 220/c/2, Торунска, Польша), сублимационная сушилка-BT85 (Millrock Technology, Китай) и криоэксикатор (Mill-rock technology, BT85, Kingston, США).

Приготовление экстрактов и фракционирование

Сухой порошок листьев R. rothschildianus экстрагировали путем последовательного добавления растворителей в зависимости от их полярности, начиная с неполярного растворителя гексана, затем ацетона (полярный апротонный органический растворитель), метанола (полярный спирт) и, наконец, дистиллированной воды (а полярный протонный растворитель). Для каждой экстракции около 25 г измельченных высушенных листьев помещали в 0.51 гексан на 72 часа в шейкере со скоростью 100 оборотов в минуту при 25°С. Сначала заменили гексан на 0,5 л ацетона, а затем заменили эквивалентные объемы метанола и воды. Инкубацию в растворителях проводили, как описано выше для гексана. Каждую органическую фракцию фильтровали и концентрировали в вакууме на роторном испарителе, а водную фракцию сушили с помощью лиофилизатора. Наконец, все сырые фракции хранились при 4 градусах [19,20].

Выход каждой фракции рассчитывали по следующей формуле:

Предварительная фитохимическая оценка

Проведены фитохимические скрининг-тесты листьев R. rothschildianus в четырех фракциях для выявления активных вторичных метаболитов. Качественные результаты были выражены как (плюс) для присутствия и (-) для отсутствия биоактивных фитохимических веществ [10,21].

Определение общего содержания фенолов (TPC)

Процедура определения TPC была основана на методике Cheung et al. TPC выражали в миллиграммах эквивалентов галловой кислоты на грамм сухой массы листьев (мг GA/г сухой массы). Свежеприготовленный 7,5-процентный раствор карбоната натрия готовили, помещая 7,5 г Na2CO3 в мерную колбу и доводя объем до 100 мл дистиллированной водой. Стандартный эталонный раствор (раствор галловой кислоты) готовили путем растворения 100 мг галловой кислоты в дистиллированной воде до конечного объема 100 мл. Исходя из этого, выполняли серийные разведения для получения растворов галловой кислоты с концентрацией 100, 70, 50, 40 и 10 мкг/мл). Исходные растворы фракций листьев готовили путем растворения 100 мг растительного экстракта в дистиллированной воде и доводили до общего объема 100 мл. Реакционные смеси готовили путем смешивания 0,5 мл раствора каждой фракции с 2,5 мл 10-процентного реактива Фолина-Чокальтеу, который растворяли в воде с 2,5 мл 7,5-процентного раствора бикарбоната натрия. Пробирки с образцами инкубировали в течение 45 минут при 45°С. Затем оптическую плотность каждого измеряли на спектрофотометре при длине волны 765 нм. Рабочие образцы готовили в трех экземплярах для каждого аналитического испытания, из которых рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение [21].

Определение общего содержания флавоноидов (ОКФ)

TFC в четырех фракциях листьев R. rothschildianus оценивали с использованием калибровочной кривой рутина (стандартное эталонное соединение). Результаты выражали в миллиграммах эквивалента рутина на грамм сухой массы экстракта листьев (мг РУ/г сухой массы). Калибровочную кривую для рутина строили с использованием серийных разведений, полученных из исходного раствора с концентрацией 1{{10}}0 мкг/мл. Для приготовления маточного раствора 10 мг рутина растворяли в 10 мл дистиллированной воды, а затем разбавляли до 100 мл. Затем исходный раствор разбавляли для получения рутина в концентрациях 10, 30, 40, 50, 70 и 100 мкг/мл. Для приготовления рабочего раствора 0,5 мл раствора каждой фракции смешивали с 3 мл метанола, 0,2 мл 10-процентного AlCl3, 0,2 мл 1М ацетата калия и 5 мл дистиллированной воды, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Предыдущие шаги повторяли для каждой из фракций, после чего измеряли оптическую плотность при длине волны 415 нм. Для холостого контроля вместо экстракта пробы готовили рабочий раствор с дистиллированной водой. Образцы готовили в трех экземплярах для каждого аналитического испытания, из которых рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение [22].

Определение общего содержания танинов (TTC) Протокол Sun et al. был использован для определения TTC в четырех фракциях листьев R. rothschildianus, что является наиболее часто используемой процедурой. Катехин использовали в качестве эталонного соединения для построения калибровочной кривой. Готовили раствор с концентрацией 1{8}}0 мкг/мл в метаноле, из которого производили серию разведений для получения концентраций катехина 10, 30, 50, 70 и 100 мкг/мл. Свежеприготовлен 4-процентный раствор ванилина в метаноле. Исходные растворы фракций с концентрацией 100 мкг/мл готовили с использованием метанола в качестве растворителя. Для получения рабочего раствора 0,5 мл раствора каждой фракции смешивали с 3 мл раствора ванилина и 1,5 мл концентрированной HCl. Смесь оставляли стоять на 15 мин, а затем измеряли оптическую плотность при 500 нм, используя рабочий раствор с метанолом вместо экстракта образца в качестве контроля. Все рабочие образцы были проанализированы в трех повторностях, из которых были рассчитаны средние значения и значения стандартного отклонения. Общий танин в каждой фракции выражали в эквивалентах катехина (мг CAE/г сухой массы листьев) [23].

Метод антиоксидантной активности

Анализ удаления свободного 2,2-дифенил-пикрилгидразилового (DPPH) радикала использовали для измерения антиоксидантной активности в различных фракциях листьев R. rothschildianus. Исходный раствор каждой растительной фракции с концентрацией 10000 мкг/мл готовили в метаноле. Кроме того, также готовили раствор тролокса с концентрацией 1000 мкг/мл (эталонный стандарт). Серию разведений готовили из исходных растворов для каждой фракции, получая шесть серийных разведений с концентрациями 2, 5, 10, 20, 50 и 100 мкг/мл. Один мл каждого разведения экстракта смешивали с 1 мл 0,002 г/мл DPPH в метаноле. Добавляли 1 мл метанола, чтобы получить конечный рабочий объем 3 мл. Раствор DPPH был свежеприготовленным, так как он был очень чувствителен к свету. Холостым контролем серии концентраций служил ДФПГ в метаноле в соотношении 1:2 без добавления экстракта. Все рабочие растворы инкубировали при комнатной температуре (25°С) в темноте в течение примерно 30 мин. Затем измеряли оптическую плотность с помощью спектрофотометра при длине волны 517 нм. Следующее уравнение использовали для расчета процента ингибирования DPPH для каждой растительной фракции с Trolox в качестве стандартного соединения:

где Ag — зарегистрированная абсорбция холостого раствора, а Ats — зарегистрированная абсорбция испытуемого раствора образца [21].

Анализ ингибирования свиной панкреатической липазы

Исходные растворы с концентрацией 5{{13}0 мкг/мл готовили из каждой растительной фракции в 10% ДМСО. Из них была сделана серия разведений из пяти концентраций 50, 100, 200, 300 и 400 мкг/мл. Исходный раствор свиной панкреатической липазы в буфере Tris-HCl с концентрацией 1 мг/мл готовили непосредственно перед использованием. Субстрат, п-нитрофенилбутират (PNPB), готовили путем растворения 20,9 мг в 2 мл ацетонитрила. Для каждого рабочего раствора 0,1 мл панкреатической липазы свиньи смешивали с 0,2 мл растительной фракции из каждого члена серии разведений. Добавляли трис-HCl до конечного объема рабочих растворов 1 мл и инкубировали при 37°С в течение 15 мин. После инкубации в каждую пробирку добавляли по 0,1 мл раствора п-нитрофенилбутирата. Затем смесь инкубировали еще 30 мин при 37°С. Активность панкреатической липазы определяли путем измерения гидролиза PNPB в п-нитрофенолят при 410 нм с использованием УФ-спектрофотометра. Ту же самую процедуру повторяли с использованием орлистата в качестве стандартного эталонного соединения. Процентное ингибирование липазы растительными фракциями рассчитывали по следующему уравнению:

где Ap — зарегистрированная абсорбция холостого раствора, а Ats — зарегистрированная абсорбция раствора испытуемого образца [24]. Ингибиторный анализ а-амилазы

A100 мг каждой фракции растворяли в нескольких миллиметрах 10% ДМСО, а затем дополнительно растворяли до 100 мл в 0,02 М Na HPOq/. NaH-PO4, 0,006 М NaCl, pH 6,9 с получением окончательного исходного раствора с концентрацией 1000 мкг/мл. Из них были приготовлены следующие разведения 10, 50, 70, 100 и 500 мкг/мл с использованием 10% ДМСО в качестве разбавителя. 0,2 мл свиной панкреатической -амилазы с концентрацией 2 ЕД/мл смешивали с 0,2 мл

растительную фракцию и инкубировали в течение 10мин при 30 градусах. После инкубации добавляли 0,2 мл свежеприготовленного 1-процентного раствора крахмала в воде, после чего пробирки инкубировали еще не менее трех минут. В этот момент реакцию останавливали добавлением 0,2 мл окрашивающего реагента 3,5-динитросалициловой кислоты (DNSA) и разбавляли 5 мл дистиллированной воды перед нагреванием при 90°С в течение 10 мин в водяной бане. ванна. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры и измеряли оптическую плотность при 540 нм. Пустой контроль готовили с использованием тех же количеств, которые описаны выше, но заменяя растительную фракцию 0,2 мл буфера. Акарбозу использовали в качестве стандартного эталона в соответствии с процедурой, описанной выше. Ингибирующую активность α-амилазы рассчитывали по следующему уравнению:

где Ag: поглощение холостого образца, а Ar — поглощение испытуемого образца [25].

Эта статья взята из Jaradat et al. Дополнительная медицина и методы лечения BMC (2021) 21:107