Pin1 усугубляет повреждение почек, вызванное ишемией и реперфузией у крыс через Nrf2/HO-1-опосредованный стресс эндоплазматического ретикулума
Jul 17, 2023
Абстрактный
1. Цель
Исследовать роль пептидилпролилцис/трансизомеразы 1 (Pin1) в почечной ишемии-реперфузии (I/R) и лежащий в ее основе механизм.
2. Методы
Создав in vitro и in vivo модели I/R почек, роль Pin1 исследовали с помощью молекулярных анализов.
3. Результаты:
При почечной И/Р уровень эндогенного Pin1 повышался в почках с нарушением И/Р. Подавление Pin1 с помощью юглона обеспечивало защиту от I/R-опосредованной дисфункции почек и снижало индуцированный I/R стресс эндоплазматического ретикулума (ER) in vivo. В соответствии с результатами in vivo, репрессия Pin1 с помощью юглона или нокдаун гена с помощью si-Pin1 обеспечивали цитопротекцию и ограничивали вызванный гипоксией/реоксигенацией (H/R) стресс ER в клетках HK-2. В то же время дальнейшее исследование показало, что сигналы Nrf-2/HO-1 были связаны со стрессом Pin1 и ER в ответ на I/R почек. Кроме того, сигнальный путь Nrf-2/HO-1 был инактивирован после того, как почки подверглись воздействию И/Р, о чем свидетельствует снижение активности Nrf-2/HO{{18}. }} уровней. Кроме того, ингибирование Pin1 заметно восстанавливало инактивацию Nrf-2/HO-1.
4. Вывод
Pin1 модулирует I / R-опосредованное повреждение почек при стрессе ER в зависимости от пути Nrf 2- HO -1 при I / R повреждении.
Ключевые слова
NIMA-взаимодействующая пептидилпролилизомераза. Ишемия. Реперфузия. NF-E2-Связанный фактор 2. Гемоксигеназа-1. Стресс эндоплазматического ретикулума.
Нажмите здесь, чтобы узнать о влиянии Цистанхе на функцию почек
Введение
Ишемически-реперфузионное (И/Р) повреждение почек, считающееся одним из основных стимулов, предрасполагающих почки к острому повреждению почек (ОПП), может нарушать функцию почек после трансплантации почки и частичной нефрэктомии1. Примечательно, что механизмы, посредством которых I/R приводит к повреждению почек, сложны и множественны, при этом в патогенез вовлечены различные поврежденные стимулы, включая апоптоз, стресс ER, аутофагию и окислительный стресс2,3. Предыдущие исследования были посвящены изучению перспективных терапевтических средств для защиты от И/Р-индуцированного ОПП, таких как дистанционное ишемическое прекондиционирование, посткондиционирование и новые фармакологические вмешательства4,5. Тем не менее, на доклинической стадии было подтверждено мало работы. Следовательно, необходимо определить потенциальные механизмы и исследовать новые терапевтические мишени при И/Р почек.
Pin1 выполняет свою функцию, эффективно способствуя конформационным изменениям белков-субстратов посредством специфической идентификации фосфорилированных пептидных связей Ser/Thr-Pro6. Pin1 катализирует изомеризацию белков-субстратов и изменяет функциональную активность целевых фосфопротеинов, чтобы контролировать многие биологические процессы, включая онкогенез и развитие, транскрипцию генов и окислительно-восстановительный баланс7. Недавний отчет показал, что Pin1 был связан с прогрессированием ишемического инсульта путем нацеливания на трансактивацию p538. Другое исследование показало, что подавление Pin1 ограничивает ишемическое повреждение кишечника, и эти эффекты были опосредованы p66Shc-индуцированным митохондриальным гомеостазом6. Однако еще предстоит выяснить, опосредует ли Pin1 дисфункцию почек в контексте повреждения I/R.
Сигнальный путь, связанный с ядерным фактором и эритроидным 2-фактором 2/гемоксигеназой-1 (Nrf2/HO-1), связан с различными клеточными биологическими процессами, включая стресс ER. Сообщалось, что Nrf2/HO-1 является вышестоящим регулятором стресса ER во время ОПП9,10. Однако остается неизвестным, коррелирует ли Pin1 с экспрессией Nrf2/HO-1 и стрессом ER. Здесь мы показали, что подавление Pin1 ослабляет индуцированный I / R стресс ER у крыс, и исследовали задействованные механизмы.
Цистанхе добавка
Методы
1. Животное, создание модели I/R
Самцов крыс Sprague-Dawley (SD) (180–200 г, возраст 8 недель) получали из Центра животных Шанхайской академии наук (Шанхай, Китай). Проект осуществлялся в соответствии с Принципами ухода за лабораторными животными (публикация NIH № 8023, пересмотренная в 1978 г.). Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Аньхойского медицинского университета (номер утверждения: LLSC20210858). Животных содержали в условиях свободного доступа к пище и воде с циклом 12-ч света и 12-ч темноты. Модель I/R была выполнена в соответствии с хорошо зарекомендовавшим себя методом11. Вкратце, был сделан срединный разрез брюшной полости, и были обнажены обе почки. Основные почечные артерии и вены идентифицировали с помощью стереотаксического микроскопа с последующей правосторонней нефрэктомией. Затем левые почечные артерии и вены перекрывали на 45 мин нетравматическими микроаневризматическими зажимами. Через 45 мин ишемии почки брюшную полость вновь вскрыли и сняли зажимы. Почки осматривали не менее 1 мин, чтобы убедиться в восстановлении крови. Брюшную полость ушивали непрерывными 4-0 полипропиленовыми швами. Почечные ткани и кровь получали в различные моменты времени реперфузии (6, 12, 24 ч). Имитация операции состояла из идентичной процедуры без наложения зажимов микроаневризмы на левых почечных артериях и венах.
2. Группы животных
Семьдесят две крысы были случайным образом разделены на следующие группы (n=8): группа имитации (n=8) - крысы подвергались только операции имитации; Группа И/Р 6 ч (n=8), группа И/Р 12 ч (n=8) и группа И/Р 24 ч (n=8) - крысы, страдающие ишемией. в течение 45 мин и различных периодов реперфузии; Группа И/Р (n=8) - крысы подвергались только инсульту И/Р; Группа И/Р плюс ДМСО (n=8) — крысам вводили равное количество ДМСО перед установлением И/Р; И/Р плюс юглон (2,5 мг∙кг–1) группа (n=8), И/Р плюс юглон (5 мг∙кг–1) группа (n=8), И/Р плюс группа юглона (10 мг∙кг–1) (n=8) — крысам вводили внутрибрюшинно различные дозы юглона (1 раз в сутки) за три дня подряд до проведения И/Р хирургического протокола.
3. Анализы сыворотки
Концентрацию азота мочевины крови (АМК) и Cr в сыворотке крови определяли с помощью коммерческого набора (компания Nanjing Jiancheng, Китай) согласно инструкции производителя.
4. Клеточная культура и лечение
Линию клеток почки человека (HK-2) культивировали в полной среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Invitrogen, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина и стрептомицина, во влажной среде, содержащей 5 процентов CO2 при 37 градусах. Для создания имитирующей гипоксическую атмосферу модели H/R клетки инкубировали в гипоксическом инкубаторе с 1% O2, 94% N2 и 5% CO2 в течение 12 часов. Затем для реоксигенации клетки культивировали в нормоксическом инкубаторе в течение 2, 4 и 6 часов. Контрольные клетки культивировали во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С.
5. Трансфекция малой интерферирующей РНК (миРНК)
Для трансфекции клетки HK-2 культивировали в среде без FBS. Специфические siРНК или негативные siРНК (GenePharma, Китай) трансфицировали в клетки с использованием реагента Lipofectamine 2000 в течение 6 часов. Затем среду заменяли полной средой с добавлением 10% FBS.
Цистанхе трубчатая
6. Гематоксилин и эозин (H&E)
Ткани почек разрезали на срезы толщиной 4 мкм с последующей фиксацией и заливкой в парафин. Затем срезы использовали для оценки гистологических повреждений с помощью H&E. Гистологические оценки проводились в соответствии с ранее установленными критериями Jablonski et al.12. Морфологические изменения были измерены двумя патологоанатомами, которые ничего не знали о группе лечения.
7. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
Тотальную РНК из клеток или тканей почек готовили с использованием тризола (Invitrogen, США) с последующим синтезом в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems, США). кПЦР проводили с использованием SYBR Green (BioRad). Последовательности праймеров, нацеленных на определенные гены, были перечислены следующим образом: R-Pin1: 5΄-GCTCAGGCCGTGTCTACTACTTC-3΄ (F), 5΄-TCCGAGATTGGCTGTGCTTC-3΄ (R); R- -актин: 5΄-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3΄ (F), 5΄-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3΄ (R). Относительные уровни экспрессии мРНК измеряли по значениям Ct и нормализовали по GAPDH.
8. Вестерн-блоттинг
Образцы общего белка готовили из клеток или тканей почек с использованием набора для экстракции белка методом радиоиммунопреципитации (RIPA). Первичные антитела, использованные в этом разделе, перечислены следующим образом: Pin1 (1:1000, Abcam), p-eIF2 (1:1000, Cell Signaling Technology), eIF2 (1:1000, Cell Signaling Technology), CHOP (1:1000, Cell Signaling Technology), GRP78 (1:1000, Cell Signaling Technology), Nrf2 (1:1000, Abcam), HO-1 (1:1000, Cell Signaling Technology) и -актин (1:5000, Boster Биологическая технология). Каждая полоса плотности была измерена с использованием изображения J.
9. Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8)
Жизнеспособность клеток измеряли с помощью набора для обнаружения CCK-8 (Beyotime Biotechnology, #C0037) в соответствии с инструкциями.
10. Статистический анализ
Данные, собранные в каждой экспериментальной группе, были представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Нормальное распределение данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Поскольку распределение нормальности данных было соблюдено, группы сравнивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественного сравнения Тьюки, чтобы определить, какие группы различались при попарном сравнении. Предварительный размер выборки и апостериорный анализ мощности были рассчитаны с использованием пакета G-power. Размер выборки был рассчитан для теста ANOVA, который использовался для проверки основной гипотезы исследования. В результате анализа размера выборки, выполненного с использованием предыдущих данных исследования, было обнаружено, что 80 крыс, по 8 в разных группах, необходимо было привлечь к исследованию, чтобы выявить существенные различия в группах, использующих 80-процентную мощность. (1- =0,80), ошибка=0,05 (95-процентный доверительный интервал) с двусторонней гипотезой. P <0,05 считался статистически значимым.
Цистанхе порошок
Обсуждение
Мы подчеркнули нашу работу над ролью Pin1 в почечной И/Р и исследовали связанный с этим механизм. Результаты показали, что Pin1 может быть вовлечен в I/R-повреждение почек. Одновременно ингибирование Pin1 обеспечивало нефропротекцию против I/R, нарушения функции почек и повреждения тканей. Кроме того, уровни Pin1 повышались после H/R in vitro, а ингибирование Pin1 предотвращало стресс эндоплазматического ретикулума, вызванный H/R. Более того, дальнейшее исследование показало, что стресс эндоплазматического ретикулума регулируется Pin1 независимо от пути Nrf2/HO-1. Таким образом, эти новые результаты показали, что Pin1 может быть многообещающей терапевтической мишенью для почечной И/Р.
Pin1 считается ключевым фактором для регуляции биологических процессов путем модификации структуры белка-мишени. Он может связываться с мотивом p-Ser/Thr-Pro, катализировать цис-транс-изомеризацию, а также добавлять еще один уровень посттрансляционной регуляции13,14. Предыдущие исследования показали, что повышенная экспрессия Pin1 способствует патогенезу и прогрессированию церебрального и кишечного I/R повреждения6. Наше исследование показало результаты, согласующиеся с предыдущими отчетами.
Кроме того, мы исследовали различные концентрации ингибиторов Pin1 против повреждения I/R и H/R. Ингибирование Pin1 может облегчить нарушение функции почек и структурные повреждения, вызванные И/Р. Эксперименты in vitro также показали, что ингибитор Pin1 может защищать нарушенную жизнеспособность клеток HK-2, вызванную H/R. Таким образом, ингибирование Pin1 может защитить от повреждения I/R почек. Отрицательный контроль (без вмешательства или без нефрэктомии) в этом исследовании не группировался. Основываясь на нашем предыдущем исследовании, у него не было различий в почечной функции или структурных повреждениях между группой с ложной операцией и группой отрицательного контроля.
Ишемия-реперфузия — серьезное осложнение, которое обычно возникает при трансплантации почки, частичной нефрэктомии, операциях на сердце и других крупных операциях6. Соответствующие механизмы I/R почек включают некроз, митохондриальную дисфункцию, апоптоз, стресс ER и окислительный стресс15. Среди них стресс ЭР считается одним из ключевых механизмов. В предыдущем исследовании сообщалось, что лечение дексмедетомидином облегчало опосредованное инфарктом миокарда ОПП за счет ограничения стресса эндоплазматического ретикулума16. Другое исследование показало, что повреждение почек с нарушением I / R было предотвращено лечением фактором роста фибробластов2 в зависимости от модуляции стресса эндоплазматического ретикулума путем активации сигналов PI3K / AKT и MEK-ERK1 / 217. Наше исследование показало, что экспрессия белков ЭР, связанных со стрессом, повышалась после процессов I/R и H/R. Кроме того, ингибирование Pin1 с помощью ингибитора in vivo или si-RNA in vitro может ослаблять повышенную экспрессию белков, связанных со стрессом ER, индуцированную I/R или H/R. Эти результаты показали, что Pin1 усугубляет повреждение I/R почек за счет усиления стресса ER in vivo и in vitro.
В физиологических условиях Nrf2 располагался и соединялся с белком Keap1 в цитоплазме. При различной стрессовой стимуляции Nrf2 отсоединяется от Keap1 и перемещается в ядро, а затем способствует экспрессии HO-118. Предыдущие исследования обнаружили, что путь Nrf2/HO-1 был связан со стрессом ER во время процесса I/R. Сообщалось, что повышенный уровень Nrf2/HO-1 снижает индуцированный I/R апоптоз сердечных клеток и повреждение миокарда за счет ослабления сигнальных молекул, связанных со стрессом эндоплазматического ретикулума19. Другое исследование показало, что пептид положения спирали B играет ключевую роль в уменьшении острого повреждения легких путем активации Nrf2/HO-1, который ограничивает стресс ER в эпителиальных клетках легких20. Мы показали, что уровни Nrf2/HO-1 снижались, а белки, связанные со стрессом ER, повышались при стимулах I/R и ингибировании сигналов Nrf2/HO-1, активируемых Pin1, таким образом защищая почки от I /R стимуляция. Чтобы дополнительно продемонстрировать взаимосвязь между Nrf2 / HO -1 и стрессом ER, мы провели эксперименты in vitro с ингибитором Pin1 и ингибитором Nrf2. Комбинированное лечение ингибитором Pin1 и ингибитором Nrf2 может обратить вспять сниженную экспрессию белка, связанного со стрессом эндоплазматического ретикулума, вызванную ингибированием Pin1, что указывает на то, что Nrf2/HO-1 играет ключевую роль в регуляции между Pin1 и стрессом эндоплазматического ретикулума.
Цистанхе капсулы
Заключение
Ингибирование Pin1 обеспечивало защиту от повреждения I/R и ограниченного повреждения почек в зависимости от регуляции Nrf2/HO-1. Этот эффект может возникать за счет модуляции стресса ER при стимулах I / R. Эти результаты показали, что Pin1 является многообещающей терапевтической мишенью при повреждении I/R почек.
Рекомендации
1. Ронко С., Белломо Р., Келлум Дж. А. Острое поражение почек. Ланцет. 2019;394(10212):1949-64. https://doi.org/10.1016/ S0140-6736(19)32563-2
2. He L, Wei Q, Liu J, Yi M, Liu Y, Liu H, Sun L, Peng Y, Liu F, Venkatachalam MA, Dong Z. ОПП при ХБП: усиленное повреждение, подавленное восстановление и лежащие в его основе механизмы. почки инт. 2017;92(5):1071-83. https://doi.org/10.1016/j. вязать.2017.06.030
3. Хан С.Дж., Ли Х.Т. Механизмы и терапевтические мишени острого ишемического повреждения почек. Клиническая клиника почек. 2019;38(4):427-40. https://doi.org/10.23876/j.krcp.19.062
4. Zhang Y, Zhang JJ, Liu XH, Wang L. Супрессия CBX7 предотвращает стресс эндоплазматического ретикулума, вызванный ишемией-реперфузией, через путь Nrf-2/HO-1. Am J Physiol Renal Physiol. 2020;318(6):F1531-8. https://дои. org/10.1152/ajprenal.00088.2020
5. Wang L, Chen Z, Weng X, Wang M, Du Y, Liu X. Комбинированное ишемическое посткондиционирование и озоновое посткондиционирование обеспечивают синергетическую защиту от почечной ишемии и реперфузионного повреждения за счет ингибирования пироптоза. Урология. 2019;123:296.E1-8. https://doi.org/10.1016/j.urology.2018.10.015
6. Feng D, Yao J, Wang G, Li Z, Zu G, Li Y, Luo F, Ning S, Qasim W, Chen Z, Tian X. Ингибирование p66Shc-опосредованного митохондриального апоптоза посредством нацеливания на пролил-изомеразу Pin1 ослабляет кишечные ишемия/реперфузия у крыс. Clin Sci (Лондон). 2017;131(8):759-73. https://doi.org/10.1042/CS20160799
7. Ли Т.Х., Пасторино Л., Лу КП. Пептидил-пролил-цис-транс-изомераза Pin1 при старении, раке и болезни Альцгеймера. Эксперт Rev Mol Med. 2011;13:e21. https://doi.org/10.1017/S1462399411001906
8. Балаганапати П., Байк С.Х., Маллиланкараман К., Соби К.Г., Джо Д.Г., Арумугам Т.В. Взаимодействие между Notch и p53 способствует гибели нейронов при ишемическом инсульте. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1781-95. https://дои. орг/10.1177/0271678X17715956
9. Чжао В., Хуан XD, Чжан LX, Ян XJ, Ван Л.Х., Чен Ю.С., Ван Д.Х., Ву Г.Л. Предварительное лечение гидрохлоридом пенегиклидина улучшает состояние, вызванное ОПП, вызванным рабдомиолизом, путем активации пути Nrf2/HO-1 и уменьшения стресса эндоплазматического ретикулума у крыс. ПЛОС Один. 2016;11(3):e151158. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151158
10. Чжан Г.З., Чжан К., Ян С.К., Чжан З., Чен С., Хоу Б.Дж., Юань Дж.Ю. VASPIN уменьшает воспаление и стресс эндоплазматического ретикулума в эпителиальных клетках почечных канальцев путем ингибирования HMGB1 и облегчает повреждение почек при ишемии-реперфузии. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(17):8968-77. https://doi.org/10.26355/eurrev_202009_22839
11. Ван Л., Чэнь З.И., Лю И., Ду И., Лю Х.Х. Окислительное посткондиционирование озоном ингибирует окислительный стресс и апоптоз при почечной ишемии и реперфузионном повреждении посредством ингибирования сигнального пути МАРК. Препарат Des Devel Ther. 2018;12:1293-301. https://doi.org/10.2147/DDDT.S164927
12. Jablonski P, Howden BO, Rae DA, Birrell CS, Marshall VC, Tange J. Экспериментальная модель для оценки восстановления почек после тепловой ишемии. Трансплантация. 1983;35(3):198-204. https://doi.org/10.1097/00007890- 198303000-00002
13. Лу КП. Зависимая от фосфорилирования изомеризация пролила: новый механизм регуляции клеточного цикла. Прог Клеточный Цикл Рез. 2000;4:83-96. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-4253-7_8
14. Лу К.П., Финн Г., Ли Т.Х., Николсон Л.К. Цис-транс-изомеризация пролила как молекулярный таймер. Nat Chem Biol. 2007;3:619- 29. https://doi.org/10.1038/nchembio.2007.35
15. Джеймс М.Т., Бхатт М., Панну Н., Тонелли М. Отдаленные результаты острого повреждения почек и стратегии улучшения лечения. Нат Рев Нефрол. 2020;16(4):193-205. https://doi.org/10.1038/s41581-019-0247-z
16. Tang C, Hu Y, Gao J, Jiang J, Shi S, Wang J, Geng Q, Liang X, Chai X. Предварительное лечение дексмедетомидином ослабляет вызванное реперфузией миокарда острое повреждение почек и стресс эндоплазматического ретикулума у человека и крысы. Жизнь наук. 2020;257:118004. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118004
17. Tan X, Tao Q, Li G, Xiang L, Zheng X, Zhang T, Wu C, Li D. Фактор роста фибробластов 2 ослабляет реперфузионное повреждение при ишемии почек посредством ингибирования стресса эндоплазматического ретикулума. Front Cell Dev Biol. 2020;8:147. https://дои. org/10.3389/cell.2020.00147
18. Лобода А., Дамулевич М., Пыза Э., Йожкович А., Дулак Дж. Роль системы Nrf2/HO-1 в развитии, реакции на окислительный стресс и заболеваниях: эволюционно законсервированный механизм. Cell Mol Life Sci. 2016;73(17):3221-47. https://дои. орг/10.1007/с00018-016-2223-0
19. Wang J, Lu L, Chen S, Xie J, Lu S, Zhou Y, Jiang H. Повышающая регуляция оси PERK/Nrf2/HO-1 защищает ткани миокарда мышей от повреждений, вызванных ишемией-реперфузией. за счет уменьшения стресса эндоплазматического ретикулума. Сердечно-сосудистая диагностика Ther. 2020;10(3):500-11. https://doi.org/10.21037/cdt-20-126
20. Bi XG, Li ML, Xu W, You JY, Xie D, Yuan XF, Xiang Y. Поверхностный пептид Helix B защищает от острого повреждения легких за счет снижения окислительного стресса и стресса эндоплазматического ретикулума посредством активации Nrf2/HO{{6} } сигнальный путь. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(12):6919-30. https://doi.org/10.26355/eurrev_202006_21683
Хунлинь Юй 1, Гуаньцзюнь Цзян 2, Вэй Ху 3, Чанген Сюй 4.
1. Доктор медицинских наук. Кафедра радиологии – Первая дочерняя больница Аньхойского медицинского университета – Аньхой, Китай.
2. Доктор медицинских наук. Отделение урологии – Пятая больница Уханя – Ухань, Китай.
3. Доктор медицинских наук. Отделение андрологии – Первая дочерняя больница – Медицинская школа Хэнъян – Университет Южного Китая – Хунань, Китай.
4. Доктор медицины. Отделение урологии – Центральная больница г. Ухань – Медицинский колледж Тунцзи – Хуачжунский научно-технический университет – Хубэй, Китай.
