Экстракт свиной плаценты увеличивает клеточный уровень NAD в эпидермальных кератиноцитах человека

Лучшие травы для борьбы со старением — Herbal Cistanche

Никотинамидадениндинуклеотид(НАД) является классическим кофактором многих окислительно-восстановительных реакций и присутствует во всех живых клетках в окисленной (НАД плюс) и восстановленной (НАДН) формах. NAD plus также известен как незаменимый ко-субстрат для потребляющих NAD plus ферментов, таких как сиртуин (SIRT) и поли-АДФ-рибозополимераза (PARP). Поскольку эти ферменты играют центральную роль в различных биологических процессах, включая репарацию ДНК, митохондриальный метаболизм и устойчивость к стрессу, несбалансированный гомеостаз НАД влияет на их ключевые процессы1. Уровни NAD в тканях/органах снижаются с возрастом, что приводит к несбалансированному гомеостазу NAD2–6. Таким образом, в настоящее время существует консенсус в отношении того, что поддержание уровня НАД способствует профилактике и лечению старения и возрастных заболеваний7. НАД биосинтезируется различными путями, включая биосинтез de novo из триптофана, путь Прейсса-Хэндлера из никотиновой кислоты и путь спасения из никотинамида (NAM)8. У млекопитающих путь спасения является основным путем поддержания клеточных уровней NAD9. В этом пути NAM превращается в никотинамидмононуклеотид (NMN) с помощью NAM фосфорибозилтрансферазы (NAMPT), а затем превращается в NAD с помощью аденилилтрансфераз NMN. Никотинамидрибозид (NR) превращается в NMN с помощью NR-киназ, а затем интегрируется в путь спасения. Было показано, что промежуточные метаболиты НАД, такие как NMN и NR, повышают уровни НАД в различных клетках и тканях и улучшают течение возрастных заболеваний10,11.

Экстракт плаценты (ПЭ) широко используется в народной медицине для заживления ран. ПЭ является богатым источником многочисленных биоактивных компонентов, включая аминокислоты, нуклеиновые кислоты, жирные кислоты, минералы, витамины, гормоны, биоактивные пептиды, цитокины и факторы роста. Известно, что он обладает различной фармакологической активностью, такой как противовоспалительное, антиоксидантное, регенеративное и иммуномодулирующее действие12. Таким образом, подкожные и внутримышечные инъекции человеческого PE (HPE) клинически использовались для лечения ряда заболеваний, включая симптомы менопаузы и хронические заболевания печени13. Кроме того, HPE используется клинически в качестве средства против морщин, главным образом в азиатских странах, из-за его влияния на рост клеток и синтез коллагена14. Поскольку в некоторых странах, таких как Япония, использование ВФЭ ограничено медицинскими применениями, свиной ПЭ (СИЗ) был недавно разработан в качестве альтернативы ВФЭ и использовался в качестве исходного ингредиента в здоровой пище и косметике. Исследование in vivo с использованием модели контактного дерматита на мышах показало, что местное СИЗ оказывает противовоспалительное и антиоксидантное действие на кожу15. Клинические исследования показали, что местное СИЗ полезно для лечения хронических незаживающих ран и предотвращения образования морщин16,17. Кроме того, было проведено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое исследование с участием здоровых взрослых женщин, чтобы подтвердить пользу для кожи при пероральном приеме СИЗ, и оно показало, что состояние кожи в группе, принимавшей СИЗ, значительно улучшилось18. Эти отчеты подтверждают концепцию о том, что обработка СИЗ может облегчить или предотвратить старение кожи.

PE традиционно используется в качествесредство против старения, и многочисленные клинические исследования установили егоантивозрастные свойства. Однако механизм, лежащий в основе омолаживающего действия ПЭ, остается неясным. Этот отчет показал, что PPE содержит несколько предшественников NAD, таких как NMN и NR, и повышает внутриклеточные уровни NAD в нормальных эпидермальных кератиноцитах человека (NHEK). Наши результаты позволяют по-новому взглянуть на механизм, с помощью которого ПЭ оказывает омолаживающее действие, поддерживая внутриклеточный гомеостаз НАД.

Полученные результаты

СИЗ повышает внутриклеточный уровень НАД. Чтобы выяснить, изменяет ли PPE состояние клеточного NAD, мы культивировали NHEK в среде с добавлением PPE и количественно определяли их внутриклеточные уровни NAD плюс и NADH. Результаты показали, что PPE значительно увеличивал количество как NAD plus, так и NADH в NHEK дозозависимым образом (рис. 1A). Общий уровень НАД (НАД плюс НАДН) в клетках, обработанных 1 мг/мл ФФЭ, был примерно в 1,5 раза выше, чем в необработанных клетках (рис. 1А). Кроме того, во временном эксперименте наблюдалось значительное повышение уровней NAD plus , NADH и общего NAD через 4 часа после обработки 1 мг/мл PPE (рис. 1B). Анализ Te {{10}}(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) подтвердил, что {{20} }.5–2 мг/мл PPE не влияли на метаболическую активность клеток, тогда как 5 мг/мл PPE или положительный контроль (0,2% Triton X-100 [TX-100]) проявляли значительную клеточную токсичность (рис. 1С). Поскольку NAD почти не обнаруживался в самом PPE (данные не показаны), эффект PPE, производящий NAD, по-видимому, не был связан с притоком NAD, полученного из PPE, в NHEK. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что PPE может повышать внутриклеточный уровень NAD. Активными ингредиентами СИЗ являются небольшие молекулы, а не белки. Чтобы определить, повышает ли PPE клеточный биосинтез NAD посредством реакции NAMPT в пути утилизации NAD, мы провели анализ восстановления NAD с использованием ингибитора NAMPT FK866 (рис. 2A). FK866 значительно снижал общий уровень НАД через 24 ч после добавления (рис. 2В).

Интересно, что, несмотря на отсутствие активности NAMPT в NHEK, PPE подавлял FK{{0}}, индуцированное истощением NAD, дозозависимым образом (рис. 2B). Во многих сообщениях показано, что ПЭ содержит белки, такие как цитокины и факторы роста13,19,20. Поэтому мы предположили, что некоторые биологически активные белки или NAMPT свиньи, содержащиеся в PPE, могут усиливать внутриклеточный биосинтез NAD в NHEK. Для подтверждения нашей гипотезы мы разделили ПФЭ на высокомолекулярные и низкомолекулярные (ВМ, НМ) фракции с помощью центробежного фильтрующего устройства (отсечка: 3 кДа). Поскольку анализ восстановления NAD с использованием FK866 показал влияние PPE на биосинтез NAD более четко, чем в отсутствие FK866 (рис. 1A и 2B), мы приступили к идентификации активных ингредиентов в PPE. используя этот анализ. Неожиданно HMW-PPE потребовалась высокая концентрация 1 мг/мл для значительного восстановления уровней NAD, в то время как LMW-PPE явно улучшил вызванное FK 866- истощение NAD даже при низкой концентрации 0,25 мг/мл (рис. 2С и D). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что основными активными ингредиентами СИЗ являются небольшие молекулы размером менее 3 кДа, а не белки, такие как факторы роста и цитокины.

PPE содержит предшественники NAD, такие как NMN и NR. Далее мы разделили LMW-PPE на 12 фракций, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с обращенной фазой, и исследовали, какая фракция способствовала восстановлению вызванного FK 866- истощения NAD. Типичная хроматограмма ВЭЖХ LMW-PPE показана на рис. 3А. Анализ восстановления Te NAD показал, что только фракция 3 отчетливо повышала уровни NAD в обработанных FK 866- NHEK (рис. 3B). Предшественники NAD, такие как NMN и NR, повышают внутриклеточные уровни NAD без вмешательства NAMPT в различных клеточных линиях, включая NHEKs10,21. Поскольку LMW-PPE по-прежнему увеличивал содержание NAD в NHEK, даже когда NAMPT ингибировался FK866, мы предположили, что предшественники NAD, содержащиеся в PPE, усиливают внутриклеточную продукцию NAD. Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали фракцию 3, используя жидкостную хроматографию-тандемную масс-спектрометрию (ЖХ-МС/МС) для обнаружения предшественников НАД. Результаты показали, что три ионных пика, соответствующие NMN (m/z 335→123), NR (m/z 255→123) и NAM (m/z 123→80), были обнаружены во фракции 3 ( Рис. 3С). Количественный анализ показал, что концентрация NMN, NR и NAM, содержащихся в целом СИЗ, составляла 0,22, 17,62 и 0,14 нг/мг соответственно (таблица 1). Эти результаты свидетельствуют о том, что по крайней мере три предшественника NAD, NMN, NR и NAM, присутствуют в PPE и участвуют во внутриклеточном усилении NAD.

Рисунок 2. PPE улучшает истощение NAD за счет FK866 в NHEK. (A) Спасительный путь биосинтеза НАД. Te NHEK предварительно обрабатывали FK866 в течение 30 минут и инкубировали с целым PPE (B), HMW-PPE (C) или LMW-PPE (D) в указанных концентрациях в течение 24 часов. Общие уровни NAD определяли с использованием набора для анализа NAD plus/NADH. †п<0.05 and ††p<0.01, in comparison with the indicated groups.

Местное применение СИЗ на реконструированном эпидермисе человека повышает уровень НАД в тканях. Основными активными ингредиентами, усиливающими НАД эффект СИЗ, являются небольшие молекулы, которые, как ожидается, будут иметь более высокую трансдермальную абсорбируемость, чем более крупные белки, такие как факторы роста. Таким образом, местное нанесение СИЗ на кожу представляется подходящим вариантом для повышения уровня НАД в тканях кожи. Чтобы выяснить, влияет ли местное применение СИЗ на уровни НАД в эпидермисе ниже рогового слоя, 3-мерно реконструированный эпидермис человека (RHE) обрабатывали СИЗ со стороны рогового слоя и культивировали в среде с присутствием или отсутствием FK866 (рис. 4А). Местное применение СИЗ повышало уровень НАД на 9,1% (незначительно) или на 7,3% (значительно) в отсутствие или в присутствии FK866 соответственно (рис. 4B). PPE не влиял на метаболическую активность клеток при тестировании до 10 мг/мл, тогда как 1 процент TX-100 заметно снижался (рис. 4C). Эти результаты свидетельствуют о том, что активные ингредиенты СИЗ могут проникать в подроговицу кожи и повышать уровень НАД в коже, не вызывая вредных последствий.

Попросить больше:

Электронная почта: wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/тел.: плюс 86 15292862950