Прогнозируйте роль LncRNA в старении почек на основе секвенирования РНК Ⅱ

Корреляция днРНК Gm43360 и ее потенциальных мРНК-мишеней

LncRNA Gm43360 была выбрана для исследования, поскольку она соединяла две сети коэкспрессии lncRNA-mRNA. Уровень экспрессии Adra1a положительно коррелировал (rho=0.8650, p=0.026) с уровнем Gm43360, Csnk1a1 (казеинкиназа 1A1) коррелировал отрицательно (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (рис. 5а). Для дальнейшей проверки корреляции днРНК Gm43360 и ее потенциальных целевых мРНК Adra1a и Csnk1a1 в этом исследовании была создана плазмида сверхэкспрессии днРНК Gm43360. Экспрессия Csnk1a1 снизилась, как и ожидалось, и экспрессия Adra1a также снизилась, но незначительно. Затем мы разрушили lncRNA Gm43360 с помощью siRNA, чтобы определить, была ли затронута экспрессия ее целевых мРНК. Как и ожидалось, Csnk1a1 был увеличен в нокдаун-клетках lncRNA Gm43360 по сравнению с группой отрицательного контроля siRNA (рис. 5b). Десять, мы обнаружили роль днРНК Gm43360 в клеточном цикле. Результаты набора для подсчета клеток-8 (CCK-8) показали, что днРНК Gm43360 способствует жизнеспособности клеток (рис. 5c). Результаты показали, что днРНК Gm43360 увеличивает процент клеток S-фазы и снижает процент клеток G1-фазы по сравнению с отрицательным контролем (рис. 5г). Белки Te p53 и p21 участвовали в регуляции клеточного цикла и, таким образом, были маркерами старения клеток. Уровни экспрессии р53 и р21 были значительно снижены в группе со сверхэкспрессией по сравнению с контрольной группой. Уровни экспрессии p53 и p21 были значительно повышены в группе siRNA по сравнению с контрольной группой siRNA (рис. 5e). Сверхэкспрессия днРНК Gm43360 снижала количество SA- -gal-позитивных клеток, а -gal-позитивных клеток увеличивалось в группе трансфекта Gm43360 (рис. 5f). В совокупности эти результаты показали, что днРНК Gm43360 ингибирует старение эпителиальных клеток почечных канальцев путемингибирование экспрессии Csnk1a1.

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ НАТУРАЛЬНЫЙ ОРГАНИЧЕСКИЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНШИ С 25% ЭХИНАКОЗИДА И 9% АКТЕОЗИДА ДЛЯ ФУНКЦИИ ПОЧЕК

Обсуждение

В этом исследовании мы оценили данные об экспрессии мРНК в почках молодых и старых мышей и провели биоинформационный анализ, который раскрыл функции аберрантно экспрессируемых мРНК. Мы наблюдали 347 мРНК с повышенным уровнем экспрессии и 355 мРНК с пониженной регуляцией, а также 130 днРНК с повышенным уровнем экспрессии и 91 днРНК с пониженной регуляцией впочки старой мыши по сравнению с почками молодой мыши. Кроме того, было показано, что эти мРНК участвуют в путях, связанных со старением, таких какокислительного фосфорилирования, сигнальный путь AMPK, сигнальный путь Wnt, сигнальный путь Rap1 и возрастные заболевания, которые продемонстрировали функции дифференциально экспрессируемых мРНК в патогенезе старения почек.

Длинная некодирующая РНК NEAT1 является защитным фактором прогрессирования фиброза почек в эпителиальных клетках почечных канальцев [21]. По совпадению, в наших результатах секвенирования днРНК NEAT1 экспрессировалась на более низких уровнях в почках старых мышей, чем у молодых мышей, что согласуется с предыдущими результатами. LincRNA-Gm4419 ускоряет воспаление и фиброз с помощью воспалительных механизмов, опосредованных NF-kB/NLRP3, при диабетической нефропатии [22]. В результатах нашего секвенирования мы также обнаружили, что экспрессия Gm4419 была выше в почках старых мышей, чем у молодых мышей, но существенной разницы не было. LncRNA Gm43360 расположена на хромосоме 5 (Chr5:122494022–122494908, 2887 п.н.). По данным UCSC Genome Browser, Gm43360 расположен в интроне гена, кодирующего белок Atp2a2. Однако на сегодняшний день сообщений об участии днРНК Gm43360 в развитии заболеваний не поступало. В этом исследовании нокдаун lncRNA Gm43360 способствовал старению эпителиальных клеток почечных канальцев. Кроме того, в результатах секвенирования мы идентифицировали множество дифференциально экспрессируемых днРНК и исследовали их.

LncRNA были классифицированы на цис-регуляцию и транс-регуляцию на основании механизмов регуляции lncRNA. Цис-действующие днРНК могут влиять на экспрессию соседних генов, в зависимости от цис-действующих элементов, таких как промоторы, энхансеры и регуляторные последовательности, которые представляют собой расстояния между днРНК и мРНК менее 100 т.п.н. Транс-действующие днРНК относятся к днРНК, покидающим место трансфекции и действующим на удаленных сайтах (т.е. расстояние между днРНК и мРНК составляет более 100 т.п.н.) [23]. ДнРНК MAAT увеличивает экспрессию соседнего гена Mbnl1 посредством цис-регуляторного модуля [24]. lncRNA Pnky играет роль трансдействующего регулятора в развитии коры [25]. В этом исследовании наблюдалась трансрегуляторная взаимосвязь между днРНК Gm43360 и Csnk1a1. Csnk1a1 — ген-супрессор опухолей [26], кодирующий белок, участвующий в клеточном цикле и процессе клеточного деления [27]. Снижение регуляции Csnk1a1 вызываетвоспалительный процесс, связанный со старениемответ с остановкой роста колоректальных опухолей [26]. Уровень Csnk1a1 был снижен, когда уровень Gm43360 был повышен; таким образом, вполне вероятно, что днРНК Gm43360 участвует встарение почеккрегуляция экспрессии Csnk1a1.

Выводы

Наше исследование сети коэкспрессии днРНК-мРНК встарение почеквыявили, что днРНК, lncRNA Gm43360, может играть защитную роль при старении почек, и расширили наше понимание механизмов, участвующих встарение почек

Материалы и методы

Образцы Молодые (3-месячные) и старые (24-месячные) самцы мышей C57BL/6J были приобретены в Центре экспериментальных животных Университета Сямэнь и выращивались в стандартной среде. Все мыши имели свободный доступ к пище и воде. Мышей акклиматизировали в новом помещении в течение месяца, прежде чем их умертвили. Перед сбором образцов мышей анестезировали уретаном путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 750 мг/кг. Молодых и старых мышей забивали в один и тот же день.Остаточная почка мышиткань использовали для секвенирования в каждом анализе. РНК-секвенирование и гистопатологию проводили наотдельные почкиот той же мышки. Ткань почек собирали у мышей. Одну почку сразу погружали в 10% нейтральный забуференный формалин для последующей заливки срезов, а другую почку разделяли на несколько тканей и немедленно помещали в жидкий азот, а затем хранили при -80 градусах. Исследование было поддержано Комитетом по этике Первой дочерней больницы Сианьского университета Цзяотун (Шэньси, Китай) (№ 2018-G-164). Все методы проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами по этике животных. Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями ARRIVE.

Гистопатология почек

Образцы почечной ткани молодых и старых мышей фиксировали в 10% растворе параформальдегида на ночь. Десять срезов были обезвожены, залиты парафином и нарезаны толщиной 4- мкм. Трихроматическое окрашивание PAS и Массона проводили с использованием стандартных протоколов. Изображения фиксировались камерой и измерялась область положительного окрашивания. Площадь изображений гистопатологической камеры рассчитывалась с помощью Image-Pro Plus 6.0.

Окрашивание SA‑gal

Активность SA{{0}}гал анализировали с использованием набора для окрашивания SA- -гал (Cell Signaling Technology #9860) в соответствии с протоколом производителя. Измеряли площадь положительного окрашивания и подсчитывали SA- -gal-положительные клетки с использованием Image-Pro Plus 6.0.

Создание и секвенирование библиотеки экстракции РНК

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 были использованы для создания библиотеки секвенирования. После экстракции тотальной РНК мРНК очищали от тотальной РНК (5 мкг) с использованием Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, Калифорния, США) с двумя циклами очистки. После очистки мРНК расщепляли на короткие фрагменты с использованием двухвалентных катионов при высоких температурах (Магниевый модуль фрагментации РНК (NEB, кат. e6150, США) при 94 градусах 5-7 мин). Затем расщепленные фрагменты РНК подвергли обратной транскрипции для получения кДНК с помощью обратной транскриптазы SuperScript™ II (Invitrogen, кат. 1,896,649, США), которую затем использовали для синтеза U-меченных двухцепочечных ДНК с помощью ДНК-полимеразы I E. coli ( NEB, кат. m0209, США), РНКаза H (NEB, кат. m0297, США) и раствор dUTP (Termo Fisher, кат. R0133, США). Затем к тупым концам каждой нити добавляли А-основание, подготавливая их к лигированию с индексированными адаптерами. Каждый адаптер содержал выступ Т-основания для лигирования адаптера с фрагментированной ДНК с А-хвостом. К фрагментам лигировали адаптеры с двумя индексами, а выбор размера осуществляли с помощью шариков AMPureXP. После обработки U-меченных двухцепочечных ДНК термолабильным ферментом UDG (NEB, кат. m0280, США) лигированные продукты амплифицировали с помощью ПЦР в следующих условиях: начальная денатурация при 95 градусах в течение 3 минут; 8 циклов денатурации при 98 градусах в течение 15 с, отжига при 60 градусах в течение 15 с и удлинения при 72 градусах в течение 30 с; и затем окончательное разгибание под углом 72 градуса в течение 5 минут. Средняя длина вставки для конечных библиотек кДНК составила 300±50 п.о. Наконец, мы выполнили парное секвенирование 2×150 п.о. (PE150) на Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Ханчжоу, Китай) в соответствии с протоколом производителя [28].

Биоинформатический анализ. Последовательность и фильтрация чистых чтений.

Библиотека кДНК, созданная по технологии из объединенной РНК изобразцы почекмышей секвенировали и запускали с помощью платформы секвенирования Illumina NovaseqTM 6000. Используя метод секвенирования парных концов РНК компании Illumina, мы секвенировали транскриптом, получив в общей сложности миллионы чтений парных концов размером 2×150 п.н. Считывания, полученные с помощью секвенаторов, включают необработанные считывания, содержащие адаптеры или основания низкого качества, которые могут повлиять на последующую сборку и анализ. Таким образом, чтобы получить высококачественные чистые чтения, чтения дополнительно фильтровались с помощью Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Параметры были следующими:

1) удаление операций чтения, содержащих адаптеры;

2) удаление ридов, содержащих полиА и поли;

3) удаление ридов, содержащих более 5% неизвестных нуклеотидов (N);

4) удаление некачественных прочтений, содержащих более 20% некачественных (значение Q меньше или равно 20) оснований.

Качество десяти последовательностей было проверено с помощью FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9). включая содержание Q20, Q30 и GC чистых данных. После этого было получено в общей сложности G bp очищенных ридов с парных концов. Необработанные данные о последовательностях были отправлены в наборы данных NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) под номером доступа GSE154223.

Эталонным геномом/аннотацией был Mus_musculus.GRCm38. Источником и версией аннотации гена, используемой для анализа, был Ensembl_v88.

Сборка транскриптов

Во-первых, Cutadapt [29] использовался для удаления ридов, содержащих загрязнение адаптера, базы низкого качества и неопределенные базы. Качество десяти последовательностей было тщательно проверено с использованием FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Мы использовали Bowtie2 [31] и Hisat2 [32] для сопоставления считываний с геномом мыши. Сопоставленные чтения каждого образца были собраны с помощью StringTie [33]. Десять, все стенограммы изобразцы почекбыли объединены для реконструкции полного транскриптома с использованием сценариев Perl. После создания окончательного транскриптома для оценки уровней экспрессии всех транскриптов использовались StringTie [33] и EdgeR [34].

Идентификация LncRNA

Прежде всего, были отброшены транскрипты, перекрывающиеся с известными мРНК, а также транскрипты длиной менее 200 п.н. Затем мы использовали CPC [35] и CNCI [36] для прогнозирования транскриптов с потенциалом кодирования. Все стенограммы с оценкой CPC<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Анализ дифференциально экспрессируемых генов (DGE)

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 считались дифференциально экспрессируемыми генами.

Прогнозирование целевых генов и функциональный анализ днРНК

Чтобы изучить функцию функции lncRNAs, мы предсказали цис-целевые гены lncRNAs. LncRNAs могут играть цис-роль, воздействуя на соседние гены-мишени. В этом исследовании кодирующие гены из 100, 000 выше и ниже были выбраны с помощью сценария Perl. Затем мы продемонстрировали функциональный анализ генов-мишеней для днРНК с помощью скриптов BLAST2GO [39]. Полная ссылка на команды находится в свободном доступе: Jie-Li/README.md по адресу main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Категории генной онтологии (GO) и анализ Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG)

Биоинформатический анализ секвенирования РНК проводился с использованием инструментов OmicStudio (http://www.omicsudio.cn/tool). Анализ функционального обогащения Gene Ontology (GO) и анализ обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) [37–39] использовались для анализа биологических функций предсказанных генов-мишеней. GO-анализ проясняет основные биологические процессы по трем аспектам: состав клеток, молекулярные функции и биологические процессы (http://www.geneontology.org/). В ходе анализа сначала все дифференциально экспрессируемые гены и фоновые гены помещаются в базу данных GO. Каждый элемент картируется, количество генов в каждом элементе рассчитывается, а гипергеометрическое распределение используется для проверки гипотезы и получения значения P результата обогащения. Чем ниже значение P, тем более значим результат обогащения. KEGG — это ресурс базы данных, который анализирует дифференциально экспрессируемые мРНК методами генетической биологии для изучения важных путей, связанных с генами-мишенями (https://www.genome.jp/kegg/). Результаты выражаются значениями p; чем ниже значение p, тем более значим результат обогащения.

qRT-ПЦР

GAPDH использовали в качестве эндогенного контроля. Затем рассчитывали относительные уровни экспрессии неизвестных генов. Все праймеры были разработаны и синтезированы специально для этого эксперимента. Праймеры для GAPDH поступили в продажу. Специфичность праймеров Adra1a и Csnk1a1 определяли по одному пику на кривой плавления.

Создайте сеть коэкспрессии мРНК-днРНК

Трансрегуляция была основана на исследованиях, а затем рассчитывалась транс-энергия. Чем меньше была транс-энергия, тем выше возможность связывания. Затем также рассчитывали коэффициент корреляции мРНК-днРНК. Сеть мРНК-днРНК была построена путем выбора коэффициента корреляции Спирмена, превышающего 0,9. Сеть коэкспрессии мРНК-днРНК была построена с использованием программного обеспечения Cytoscape (v3.7.1).

Культура клеток

Эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек мыши (MRPT-EpiC) культивировали в среде эпителиальных клеток животного (EpiCM-a, кат. № 4131), содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS, кат. № 0010) и добавку для роста эпителиальных клеток (животное). (EpiCGS-a, кат. № 4182) без антибиотиков во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов и 5% CO2. Культуральную среду меняли каждые 2–3 дня. Клетки в логарифмической фазе роста субкультивировали, когда рост достигал 90%. Клеточную суспензию, расщепленную трипсином, высевали в планшеты с 6-лунками по 2*104 -5*104 клеток в каждой лунке. Все клетки, использованные для трансфекции, принадлежали ко 2-му и 5-му поколениям.

Плазмидная конструкция и трансфекция клеток

Плазмида сверхэкспрессии lncRNA Gm43360 была сконструирована компанией GeneChem (Шанхай, Китай). Основой плазмиды был GV658, а промотор CMV управлял экспрессией днРНК. Клонированная нуклеотидная последовательность представлена ​​в дополнительном материале. Для нокдауна днРНК Gm43360 три днРНК ENS ДОЛЖНЫ00000197656-нацеливаться на siRNA (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; и днРНК Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') были разработаны и синтезированы в GenePharma (Шанхай, Китай). Согласно протоколу производителя клетки трансфицировали 2500 нг плазмиды или 100 пмоль миРНК с 6 мкл трансфекционного реагента Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, США) на лунку. Уровни экспрессии РНК и белка определяли через 48 часов после трансфекции, и каждый эксперимент повторяли не менее трех раз. Количественную ПЦР в реальном времени использовали для подтверждения эффективности сверхэкспрессии и нокдауна днРНК Gm43360.

Вестерн-блот-анализ

Культивируемые клетки промывали ледяным PBS, добавляли 120 мкл буфера RIPA («Heart», Китай) и добавляли ингибитор протеазы и PMSF («Heart», Китай) на 30 мин на льду. После сбора клеток в различные микроцентрифужные пробирки определяли количественную концентрацию белка. К каждому образцу добавляли загрузочный буфер, а затем кипятили в течение 7 минут. Тридцать микрограммов образца разделяли с помощью 12% SDS-PAGE (Beyotime, Китай) и электропереносили на мембраны из ПВДФ (Thermo Fisher, США). Затем мембраны блокировали 5% молоком. Мембраны инкубировали со специфическими первичными антителами: анти-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), анти-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) и анти-GAPDH (1:3000, Profintech). , 60004-1-Ig) в течение ночи при 4 градусах. После промывки TBST мембраны инкубировали со вторичным антителом в течение 1 ч при комнатной температуре. Белковые полосы наблюдали с помощью набора для хемилюминесценции (Millipore, США). Экспрессию GAPDH использовали для нормализации уровней белка.

Анализ клеточной пролиферации

Способность пролиферации клеток определяли с помощью набора для подсчета клеток-8 (CCK-8). Через сорок восемь часов после трансфекции в каждую лунку добавляли 90 мкл новой среды и 10 мкл раствора CCK-8 (Beyotime, C0042). Клетки инкубировали в течение 1–4 ч при 37 градусах в 5% CO2 и измеряли при длине волны 450 нм с помощью универсального микропланшетного ридера (Bio-Tek, США).

Проточный цитометрический анализ

Клетки высевали в 6-луночные планшеты за день до трансфекции. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки трипсинизировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Затем клетки фиксировали в 70% этаноле при температуре 4 градуса не менее 4 часов. После центрифугирования к клеткам добавляли красящий раствор РНКазы А и йодида пропидия (PI), а затем клетки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Окрашенные Те клетки анализировали с использованием ACEA NovoCyte (Biosciences, США).

статистический анализ

Данные измерений по нормальному распределению представлены как среднее ±SD. Разницу между двумя разными группами определяли с использованием двустороннего непарного t-критерия Стьюдента, а значение p < 0,05 считалось статистически значимым. Все расчеты проводились с использованием GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., США).

Рекомендации

1. Дочерти М.Х., О'Салливан Э.Д., Бонвентре Дж.В., Ференбах Д.А. Клеточное старение почек. J Am Soc Нефрол. 2019;30(5):726–36.

2. Партридж Л., Дилен Дж., Слагбум П.Е. На пути к решению глобальных проблем старения. Природа. 2018;561(7721):45–56.

3. Пан JX. LncRNA H19 способствует развитию атеросклероза, регулируя сигнальные пути MAPK и NF-kB. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8.

4. Уоссон К.В., Абиньяно Г., Гермес Х., Малааб М., Росс Р.Л., Хименес С.А., Чанг Х.И., Фегхали-Боствик К.А., Дель Галдо Ф. Длинная некодирующая РНК HOTAIR управляет EZH2-зависимой активацией миофибробластов при системных заболеваниях. склероз посредством микроРНК 34а-зависимой активации NOTCH. Энн Ревматик Дис. 2020;79(4):507–17.

5. Луо Дж., Ван К., Йе С., Сунь Ю., Лян Л., Сяо Ю., Сюй В., Ню Ю., Ченг Л., Майти С.Н. и др. LncRNA-p21 изменяет нейроэндокринную дифференцировку рака простаты, индуцированную антиандрогеном энзалутамидом, посредством модуляции передачи сигналов EZH2/STAT3. Нац Коммун. 2019;10(1):2571.

6. Ван Ю, Ян Л, Чен Т, Лю Х, Го Ю, Чжу Ц, Тонг Икс, Ян В, Сюй Ц, Хуан Д и др. Новая днРНК MCM3AP-AS1 способствует росту гепатоцеллюлярной карциномы, воздействуя на ось miR-194-5p/FOXA1. Мол Рак. 2019;18(1):28.

7. У Ю, Куо ХК. Функциональная роль и сети некодирующих РНК в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. J Biomed Sci. 2020;27(1):49.

8. Ли З, Ван З. Старение почек и заболевания, связанные со старением. Adv Experiment Med Biol. 2018;1086:169–87.

9. Ван Х, Вртиска Т.Дж., Авула Р.Т., Уолтерс Л.Р., Чаккера Х.А., Кремерс В.К., Лерман Л.О., Рул А.Д. Возраст, функция почек и факторы риска по-разному связаны с кортикальным и медуллярным объемом почки. Почки Int. 2014;85(3):677–85.

10. Лин Кью, Хоу С, Дай Ю, Цзян Н, Линь Ю. LncRNA HOTAIR нацелена на миР-126-5p, чтобы способствовать прогрессированию болезни Паркинсона через RAB3IP. Биол Хим. 2019;400(9):1217–28.

Служба поддержки Wecistanche — крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин для получения дополнительных технических характеристик:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop