Препаративное выделение и очистка четырех соединений из Cistanches Deserticola YC Ma методом высокоскоростной противоточной хроматографии

1. Введение

Цистанчи пустынныеYC Ma, разновидностьЦистанчикоторый принадлежитОробанховыеСемья, является хорошо известным методом традиционной китайской медицины для лечения почечной недостаточности, женского бесплодия, болезненных белей, нейропраксии и старческих запоров [1]. Это паразитическое растение, широко распространенное на северо-западе Китая. На данный момент несколько соединений, в том числефенилэтаноидные гликозиды (PhG)Из этого вида выделены , иридоиды и лигнаны [2]. Сообщается, что некоторые из PhG обладают антиоксидантной, гепатопротекторной и нейропротекторной активностью [3–6]. Однако процедура выделения и очистки PhG сложна и требует много времени. Более того, классические методы многократной хроматографии не только используют большое количество органических растворителей, но и обеспечивают более низкий выход пробы. Высокоскоростная противоточная хроматография (HSCCC), метод жидкостно-жидкостной распределительной хроматографии без подложки, обеспечивает превосходное извлечение проб по сравнению с некоторыми традиционными методами и широко используется для разделения и очистки различных природных продуктов [7–9]. . Хотя несколько PhG были очищены отЦистанчирода и других HSCCC [10–14], ни в одной статье не сообщалось об очистке актеозида, изоактеозида, сирингалида А 3'-. -L-рамнопиранозид и 2'-ацетилактеозид в одной двухфазной системе.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В этой статье мы сообщаем о простом методе разделения и очистки четырех PhG из C. Deserticola. Наконец, в результате одностадийного разделения были получены 30,9 мг актеозида, 13,0 мг изоактеозида, 12,5 мг сирингалида А, 3'- -L-рамнопиранозид и 7,2 мг 2'-ацетилактеозида. из 297 мг фракции чистотой 99%, 95%, 99% и 98% соответственно. Их структура охарактеризована на основании спектральных данных 1 H- и 13 C-ЯМР и спектров HR-MS. Структуры четырех PhG, выявленных в этом исследовании, показаны на рисунке 1.

2. Результаты и обсуждение.

2.1. ВЭЖХ-анализ неочищенного экстракта

Обогащенную компонентами фракцию экстракта н-бутанола из C. Deserticola анализировали с помощью ВЭЖХ-УФ. Используемая колонка представляла собой Accurasil C18 (250 мм × 4,6 мм, внутренний диаметр 5 мкм) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, город, сокращение штата, США), подвижная фаза - метанол-вода (30:70, по объему). Скорость потока составляла 1 мл/мин. Длина волны детектора была установлена ​​на уровне 254 нм. Хроматограмма ВЭЖХ показана на рисунке 2. Пики с 1 по 4 соответствуют актеозиду (1), изоактеозиду (2), сирингалиду А, 3'- -L-рамнопиранозиду (3) и 2'-ацетилактеозиду (4) соответственно. .

2.2. Выбор двухфазной системы растворителей

Успешное разделение с помощью HSCCC во многом зависит от выбора подходящей двухфазной системы растворителей. Двухфазная система растворителей выбиралась в соответствии со значениями коэффициента распределения (K) каждого целевого компонента, а оптимальный диапазон K должен составлять от {{ 2}}.5 к 2.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНИТЕТА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В эксперименте значения K для целевых компонентов нескольких двухфазных систем растворителей приведены в таблице 1 (хотя для пика 4 результаты оказались несколько выше, результаты оказались приемлемыми). Среди них этилацетат-н-бутанол-этанол-вода (40:6:6:50, об/об/об/об) дает подходящие коэффициенты распределения для целевых соединений. В конечном итоге система растворителей, состоящая из этилацетата–н-бутанола–этанола–воды (40:6:6:50, по объему/объему/объему), была использована для выделения и очистки четырех соединений C. Deserticola, как показано на рис. Рисунок 3. Как показано на рисунке 2, анализ ВЭЖХ каждой фракции HSCCC показал, что четыре чистых PhG (актеозид, 99%; изоактеозид, 95%; сирингалид А, 3'- -L-рамнопиранозид, 99% и 2'- ацетилактеозид 98%) можно было получить из сырой фракции.

3. Экспериментальный

3.1. Аппарат HSCCC

В настоящем исследовании использовалось оборудование для высокоскоростной противоточной хроматографии TBE{{0}}B (Shanghai Tauto Biotech Co., Шанхай, Китай) с тремя препаративными многослойными спиральными разделительными колонками, соединенными последовательно (диаметр пробирки=2,6 мм, общий объем=300 мл) и петля для проб объемом 2{{10}} мл. Радиус вращения или расстояние между осью держателя и центральной осью центрифуги (R) составляло 5 см, а значение изменялось от 0,5 на внутреннем терминале до 0,8 на внешнем терминале (=r/R, где r — расстояние от катушки до вала держателя). Для контроля температуры в эксперименте использовалось устройство циркуляции с постоянной температурой HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Пекин, Китай). Система HSCCC была оснащена насосом постоянного расхода среднего давления модели TBP-5002, УФ-детектором модели TBP-2000, работающим при длине волны 254 нм, и рабочей станцией модели V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument Компания, Шанхай, Китай).

В качестве оборудования для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) использовалась система Agilent 1200, состоящая из бинарного насоса G1312A, автосамплера G1329A, детектора с переменной длиной волны G1314A (VWD), термостатируемого отсека колонки G1316A, дегазатора G1379B и рабочей станции Agilent для ЖХ. . Для определения чистоты использовали alltech 3300 ELSD. Для структурной идентификации соединений использовали Q-TOF-спектрометры Agilent 6520 и Bruker AVANCE III 500-ЯМР. Спектры 1 H и 13 C-ЯМР (при 500 и 125 МГц соответственно) измеряли при комнатной температуре (22 градуса/295,1 К).

3.2. Реагенты и материалы

Этилацетат, н-бутанол и этанол имели чистоту для анализа, а метанол – чистоту для ВЭЖХ. Все растворители были приобретены у компании Tianjin Concord Technology Company (Тяньцзинь, Китай). Для всех растворов и разбавлений использовали воду Milli-Q (18,2 МОм) (Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США). Корневище C. Deserticola было собрано в провинции Внутренняя Монголия Китайской Народной Республики в июне 2009 года. Растение было идентифицировано профессором Лицжуаном Чжаном, а ваучерный образец (№ 20091001) был передан на хранение в нашу лабораторию.

3.3. Подготовка пробы сырой нефти

Порошкообразные высушенные на воздухе мясистые стебли C. Deserticola (1 кг) дважды кипятили с обратным холодильником в водном этаноле (8 л, 60% об./об.) каждый раз по 2 часа. Экстракт упаривали при пониженном давлении и температуре 60 градусов до полного выпаривания этанола. Остаток суспендировали в воде и экстрагировали последовательно три раза хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом, получая 5,16 г н-бутанольного экстракта после выпаривания досуха при пониженном давлении. Затем н-бутановый экстракт разделяли на колонке с силикагелем (200–300 меш) с использованием прогрессивного градиентного элюирования (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) с получением восьми фракций. Фракцию 6 (297 мг) использовали для дальнейшего выделения и разделения HSCCC.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ТРАДИЦИОННЫЕ КИТАЙСКИЕ ЛЕКАРСТВА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Выбор двухфазных систем растворителей

Двухфазные системы растворителей подбирались по коэффициенту распределения (К) целевых компонентов во фракции C. Deserticola. Значения K определяли с помощью анализа ЖХ следующим образом: подходящее количество порошка сырого экстракта (фракция 6) растворяли в нижней фазе системы растворителей и анализировали с помощью ВЭЖХ. Площади пиков записывали как A1. Затем к раствору добавляли равный объем верхней фазы и тщательно перемешивали до достижения равновесия распределения. Затем нижнюю фазу снова анализировали с помощью ВЭЖХ. Площади последних пиков были записаны как A2. Значения K рассчитывались по следующему уравнению: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Приготовление двухфазной системы растворителей и раствора образца

В настоящей работе для разделения HSCCC использовали двухфазную систему растворителей, состоящую из этилацетата–н-бутанола–этанола воды (40:6:6:50, по объему/объему/объему). Каждый растворитель добавляли в делительную воронку и тщательно уравновешивали при комнатной температуре. Незадолго до использования верхнюю и нижнюю фазы разделяли и дегазировали ультразвуком в течение 30 мин. Раствор образца готовили растворением 297 мг Фракции 6 в 15 мл нижней фазы смеси этилацетат-н-бутанол-этанол-вода (40:6:6:50, об./об./об./об.).

3.6. Процедура разделения HSCCC

HSCCC осуществляли следующим образом. Многослойную спиральную колонку сначала заполняли верхней органической неподвижной фазой. Нижнюю водную подвижную фазу затем закачивали в головную часть колонны со скоростью потока 1,5 мл/мин, и в то же время аппарат HSCCC работал со скоростью вращения 900 об/мин. После установления гидродинамического равновесия, о чем свидетельствует элюирование чистой подвижной фазы на выпускном отверстии (примерно через два часа), через инжекционный клапан вводили 15 мл раствора образца, содержащего 297 мг неочищенного экстракта (фракция 6). Выходящий из колонки поток непрерывно контролировали при длине волны 254 нм. Четыре пиковые фракции собирали согласно хроматограмме и затем упаривали при пониженном давлении. Температура аппарата была установлена ​​на уровне 25 градусов.

3.7. ВЭЖХ-анализ и идентификация пиковых фракций HSCCC

Пиковые фракции HSCCC анализировали с помощью HPLC-ELSD. Используемая колонка представляла собой Accurasil C18 (250 мм × 4,6 мм, внутренний диаметр 5 мкм), а подвижная фаза представляла собой метанол-вода (30:70, по объему). Скорость потока составляла 1 мл/мин. ELSD работал при следующих условиях: температура 45 градусов, расход газа 1,6 л/мин. Структурную идентификацию четырех пиковых фракций HSCCC проводили методами HR-ESI-MS, 1 H- и 13C-ЯМР-спектроскопии.

3.8. Структурная идентификация

Фракция I: HR-ESI-MS, наблюдаемая при m/z 623,2001 (M-H)-, рассчитано для C29H35O15, 623,1981. 1 H-ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ м.д.: 1,09 (3H, д, J=6 Гц, CH3 рамнозы), 2,79 (2H, т, J=7,5 Гц, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Гц, H-1 глюкозы), 5,18 (1H, d, J=1 Гц, H{{34) }} рамнозы), 6,27 (1H, d, J=15,5 Гц, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Гц, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, ароматический H). 13C-ЯМР (125 МГц, CD3OD) δ м.д.: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,6 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89 }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). По сравнению с данными, приведенными в литературе [17], фракция I соответствовала актеозиду.

Фракция II: HR-ESI-MS, наблюдалось при m/z 623,1987 (M-H)-, рассчитано для C29H35O15, 623,1981. 1 H-ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ м.д.: 1,25 (3H, д, J=6,5 Гц, CH3 рамнозы), 2,78 (2H, т, J=7 Гц, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Гц, H-1 глюкозы), 5,17 (1H, d, J { {33}} Гц, H-1 рамнозы), 6,28 (1H, d, J=15.5 Гц, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Гц, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, ароматический H). 13C-ЯМР (125 МГц, CD3OD) δ м.д.: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C-), 36,7 (C-), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Спектральные данные 1 Н-ЯМР и 13 С-ЯМР соответствовали данным изоактеозида, приведенным в литературе [18].

Фракция III: HR-ESI-MS, наблюдаемая при m/z 6{{108}}7,2032 (M-H)-, рассчитано для C29H35O14: 607,2032. 1 H-ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ м.д.: 1,09 (3H, д, J=6 Гц, CH3 рамнозы), 2,84 (2H, т, J=7,5 Гц, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Гц, H-1 глюкозы), 5,19 (1H, d, J=1,5 Гц, H{ {35}} рамнозы), 6,27 (1H, d, J=16 Гц, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Гц, Ar- CH=CH-), 6.6–7.1 (7H, ароматический H). 13C-ЯМР (125 МГц, CD3OD) δ м.д.: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C-), 36,4 (C-), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). По данным литературы [18], фракция III соответствовала сирингалиду А 3'- -L-рамнопиранозиду.

Фракция IV: HR-ESI-MS, наблюдаемая при m/z 665,21{{20}} (M-H)-, рассчитано для C31H37O16, 665,2087. 1 H-ЯМР (500 МГц, CD3OD) δ м.д.: 1,09 (3H, д, J=6,5 Гц, CH3 рамнозы), 2,00 (3H, с, OAc), 2,72 (2H, т, J=7,5 Гц, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Гц, H-1 глюкозы), 4,90 (1H, d, J=1 Гц, H-1 рамнозы), 6,29 (1H, d, J=15,5 Гц, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15.5 Гц, Ar-CH=CH-), 6.5–7.0 (6H, ароматический H). 13C-ЯМР (125 МГц, CD3OD) δ м.д.: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C-), 36,4 (C-), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (ОАЦ). Спектральные данные 1 Н-ЯМР и 13 С-ЯМР согласуются с данными 2'-ацетилактеозида [17].

4. Выводы

Разработан HSCCC-метод препаративного разделения и очистки актеозида, изоактеозида, сирингалида А, 3'- -L-рамнопиранозида и 2'-ацетилактеозида из Cistanches Deserticola YC Ma. Настоящее исследование показывает, что HSCCC является очень мощным методом препаративного разделения и очистки биоактивных компонентов из растительного сырья. Кроме того, соединения можно выделить в достаточно больших масштабах с высокой чистотой и затем использовать в качестве эталонных веществ для хроматографии или исследований биологической активности. Этот метод является осуществимым, экономичным и эффективным методом быстрого препаративного выделения сложных природных продуктов.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%