Защитный эффект и механизм гликозидов Cistanche в модели повреждения реперфузии церебральной ишемии крысы

Абстрактный

 

ЦельИзучить нейропротекторный эффект и механизм гликозидов цистах (GCS) на повреждение реперфузии церебральной ишемии (CIRI) у крыс. Методы сорок восемь мужских крыс Вистар были случайным образом разделены на фиктивные, модель, GC и нимодипиновые группы. Крысовая модель фокального CIRI была установлена ​​с помощью окклюзии средней мозговой артерии. Сенсорные и моторные способности крыс в каждой группе оценивали путем удаления наклеек, баланса и тестов на открытое поле. Площадь церебрального инфаркта была обнаружена с помощью 2,3, {{3} окрашивания хлоридом трифенилтетразолия, для наблюдения за морфологией нервных клеток и терминального дезоксинуклеотидилтрансферазы DUTP использовали маркировку NICK END Lakeling. Уровни экспрессии белков, связанных с апоптозом, BCL -2 Associated X (Bax), B-клеточной лимфомы -2 (BCL -2) ​​и цистеиновая аспиртическая протеаза -3 (каспаза -3) были обнаружены ImmUMISTOCHEM. Результаты по сравнению с Sham Group, показатель неврологического дефицита был значительно увеличен (P<0.05) and the times to remove stickers and passing the balance beam were significantly increased (P<0.05), motor ability was decreased, infarct size was increased, the number of neurons was decreased, and the number of apoptotic cells was increased after CIRI. Bax and caspase-3 expression were significantly increased (P<0.05) and Bcl-2/Bax was significantly decreased (P<0.05). Compared with the Model group, GCs improved the behavioral performance of CIRI model rats, reduced the infarct size, inhibited cell apoptosis, downregulated the expression of Bax and caspase-3 (P<0.05), and up-regulated the expression of Bcl-2/Bax (P<0.05). Conclusion GCs have a neuroprotective effect on CIRI, and may play a role in inhibiting cell apoptosis by regulating the expression of the apoptosis-related factors Bax, Bcl-2, and caspase-3. Keywords glycosides of cistanche; cerebral ischemia reperfusion injury; apoptosis; middle cerebral artery occlusion

 

Высококачественное травяное сырье Cistanch для церебральной ишемии-реперфузионной травмы

 

Ишемический инсультсоставляет около 80% всех ударов и является одним из основных заболеваний, которые угрожают здоровью человека [{1}}]. Церебральное ишемия-реперфузионное повреждение (CIRI)-это осложнение, которое происходит после реперфузионной терапии, такого как внутривенное тромболизис и артериальная тромбэктомия дляИшемический инсульт[4-5]. CIRI может привести к тяжелой неврологической дисфункции и необратимой гибели нейронов. Следовательно, крайне важно найти эффективный план лечения, который фокусируется на нейропротекции.
Cistanche Deserticola является драгоценным местным лекарственным материалом, в основном производимым во внутренней Монголии. Он обладает последствиями пополнения ци и крови, питательной инь и почки, а также регуляции кишечной функции. Гликозиды Cistanche (GCS) являются основными экстрагированными компонентами Cistanche Deserticola, которые могут играть антиоксидативный стресс,Ишемический инсульт, ингибируют апоптоз клеток иИшемический инсульт[6]. Исследования показали, что GC улучшают обучение и когнитивные функции AD за счет снижения накопления свободных радикалов и ингибирования апоптоза клеток [7]; GC способствуют ангиогенезу и нейронному ремоделированию, поддерживают целостность гематоэнцефалического барьера и, таким образом, улучшают CIRI [8]. Тем не менее, до сих пор неясно, может ли GCS улучшить CIRI, регулируя апоптоз клеток для облегчения неврологического дефицита. Следовательно, это исследование направлено на изучение того, оказывают ли GC нейропротекторное влияние на CIRI и могут ли они улучшить CIRI, регулируя апоптоз клеток, выявляет их потенциальное значение применения в профилактике и лечении CIRI, а также обеспечивает теоретическую и экспериментальную основу для лечения CIRI с помощью GCS.

1 материалы и методы

1.1 Экспериментальные животные

Шестьдесят SPF MALE 6- Месячные крысы Wistar Wistar (250-280 g) были приобретены у Beijing Sibeifu Biotechnology Co., Ltd. [scxk (beijing) 2024-0001]. Все экспериментальные животные содержались в стандартизированной комнате для животных экспериментальных экспериментальных центров Baotou Медицинского колледжа внутренней Монголии Университет науки и технологии [Scxk (Mongolia) 2018-0001], с температурой 20-24 степень, влажность 50%-60%и легкое состояние каждые дни и ночью. У них был бесплатный доступ к еде и воде. Этот эксперимент соответствует экспериментальным стандартам этики животных Медицинского колледжа Баоту [Baoyi Lunshen 2022 № (60)]. Принцип 3R следил во время кормления и экспериментального процесса, и была дана гуманная забота.

1.2 Основные реагенты и инструменты
Общее гликозиды Cistanche Deserticola были приобретены у Baoji Cosmai Plant Polysacharide Development Co., Ltd. (Количество производственной партии: KM20220609011), с общим содержанием гликозида, превышающим или равным 85%. GCS может быть полностью растворен в дистиллированной воде и приготовлена ​​в дозу 50 мг/кг, а объем введения рассчитывается в соответствии с весом животного. TTC staining solution (G3005), Nissl staining kit (G1434), high-efficiency RIPA lysis solution (R0010), ECL Plus ultra-sensitive luminescent solution (PE0010), 30% gel preparation solution (A1010), electrophoresis buffer (T1070), transfer solution (D1060), PAGE gel accelerator (T8090), rainbow Маркер белка широкого спектра (PR1910), буфер нагрузки белка (P1015) и т. Д. Были приобретены у Solebao; Иммуногистохимический комплект (PV -9000) и буферный порошок PBS (Zli -9062) были приобретены у Пекин Чжуншан Джинциао; Набор для обнаружения белка BCA (23227) был приобретен у Thermo Scientific; Bax (50599-2- IG), BCL -226593-1- AP) антитела, козьи анти-кроличьи вторичные антитела (SA 00001-2) были приобретены у ProteIntech; Каспаза -3 (AF6311) была приобретена у Affinity; -Актин (52901) был приобретен у SAB.
Подключение потока (2636) была приобретена у Beijing Xinong Technology Co., Ltd.; Slicer (Leica, Германия); оптический микроскоп (Лейка, Германия); Экспериментальная коробка открытого поля (Шанхай Синруан); Пипетка (Эппендорф, Германия); Микроскопическая система визуализации (Лейка, Германия); Электрофорез (Пекин Liuyi Biotechnology Co., Ltd.); Shaker (Пекин Liuyi Biotechnology Co., Ltd.); Визуализация белкового геля

 

Аналитическая система (Tanon Technology, Shanghai); Читатель Microplate (Thermo Fisher, США).

1.3 Экспериментальные методы

1.3.1 Подготовка модели животных

Модель окклюзии средней мозговой артерии крысы (MCAO) была установлена ​​с помощью модифицированного метода шва Zea-Longa [9]. После взвешивания крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 2% пентобарбитала натрия (50 мг/кг). После того, как животные были полностью анестезированы, они были зафиксированы на рабочем столе в положении на спине. После того, как шея была выбрита, она была дезинфицирована йодом. Средний разрез был сделан слева влево, а фасция и мышцы были прямо разделены слой за слоем, чтобы избежать повреждения окружающих нервов, кровеносных сосудов и мышц. Сначала найдите левую общую сонную артерию, разделяйте общую сонную артерию и ее блуждающую нерв, используйте 4-0 для шва, чтобы лигатировать проксимальный конец левой общей сонной артерии, а затем осторожно отделяйте левую внутреннюю сонную артерию и левую аро продушью аретерию вверх аретерий -аретерии, а с помощью аретерии -арота -аретерии, аратор, ара, а, а,, а,,,,,,,,,, ,р,,,,,,,,,, ,пито,,,,,,, тра сказать быть делать жо жить ни жить само наш, нашего нашли нашиз за способ. Разрезясь по разрезу на левой общей сонной артерии для вставки резьбовой пробки, и после того, как заглушка с резьбой проходит через общую сонную артерию во внутреннюю сонную артерию, осторожно отпустите зажиму артерии, чтобы пропустить ниточную пробку, а заглушка потока идет по внутренней сонной артерии, а затем достигает средней целевой артерии, а также исправить платеж с ножом и вытягивает заглушку, и вытянут заглушку, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, а также заглушка, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, и вытягивает заглушку, а также заглушка. Разрез и дезинфицируют с йодом.

 

1.3.2 Экспериментальная группировка животных

В общей сложности 59 крыс были отобраны для этого исследования, из которых 12 были выбраны случайным образом в качестве фиктивной операции, а остальные 47 были использованы для подготовки модели MCAO. После подготовки модели 7 крыс погибли, и 4 крысы не смогли подготовить модель. Оставшиеся 36 крыс были случайным образом разделены на модельную группу и группу лекарственного средства, то есть крысы были случайным образом разделены на следующие 4 группы (12 крыс/группа), фиктивная операционная группа, модельная группа, общий гликозиды цистах -десертикола (GCS, группа 50 мг/кг) и нимодипин (NIM, 20 мг/кг) группа. Шамская группа перенесла ту же хирургическую операцию, что и модельная группа, но без сосудистой лигирования и вставки подключения резьбы; Модельная группа и каждая группа по устранению лекарств создали модель церебральной ишемии-реперфузии, и непрерывное внутрижильное введение началось через 24 часа после операции в течение 14 дней. Предварительный эксперимент был проведен на ранней стадии для изучения доза-эффекта GC, которые составляли 25 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг. Результаты показали, что доза 50 мг/кг была лучшей, поэтому в этом эксперименте было выбрано 50 мг/кг.

 

1.3.3 Оценка неврологической функции

Все крысы в ​​этом эксперименте были оценены с использованием Международного метода оценки модели MCAO (метод оценки Zea-Longa) [9]. Крысы с оценками от 1 до 3 были выбраны из каждой группы для последующих экспериментов, и моделировали крыс с оценками 0 и 4 были исключены. Критерии оценки следующие:

 

1.3.4 Эксперимент по удалению наклейки

Длинная клейкая ленточная полоса 1,2 см × 2. 0 CM была прикреплена к передней части крысы. После тактильной стимуляции крыса сорвала наклейку с зубами. Экспериментальные животные получали тренировку по удалению наклеек за 3 дня до операции, с тренировками два раза в день. Крысы, которые могли разорвать наклейку в течение 30 с, были выбраны для входа в каждую группу. Время для того, чтобы крысы отрывали наклейку, было протестировано перед операцией, и среднее из трех результатов было получено как базовое значение. Время для того, чтобы крысы разорвали наклейку, было записано в каждой группе через 14 дней после операции MCAO. Оценка крыс, которые не кусали наклейку в течение 120 с или не могли отрыть наклейку, была зарегистрирована как 120 с.

 

1.3.5 Эксперимент с балансом баланса

Баланс был сделан длиной 150 см, шириной 4 см и 3 см в высоту. Высота баланса находилась в 80 см от земли и поддерживалась деревянными рамами на обоих концах. Один конец баланса был определен как начальная точка, а другой конец как конечная точка. Клетка была помещена за конечной точкой. Мат длиной 1 м, шириной 1 м и толщиной 12 см помещали под луча баланса, чтобы предотвратить падение крысы. В начале эксперимента крыса помещали в отправную точку, обращаясь к направлению клетки, и было зарегистрировано время, необходимое для того, чтобы крыса проходила через весь баланс. Крысы в ​​каждой группе получали тренировку за 3 дня до операции, 3 раза в день. Время, которое потребовалось для того, чтобы крыса проходила через баланс, было зарегистрировано перед операцией, и время, необходимое для крыс в каждой группе, чтобы пройти через баланс пучок баланса, было зарегистрировано 1 день, 2 дня, 3 дня, 7 дней и через 14 дней после операции MCAO. Максимально разрешенное время для ходьбы по горизонтальному бару составило 120 с.

 

1.3.6 Эксперимент с открытым полевым экспериментом

Поместите каждую группу экспериментальных животных в экспериментальную коробку с открытым полем и используйте программное обеспечение для поведенческого анализа для записи траектории активности и расстояния перемещения крыс в течение 5 минут. Окружающая среда должна быть тихой во время эксперимента, а экспериментальное оборудование протируется чистой водой и спиртом между двумя экспериментами, чтобы предотвратить остаточную информацию предыдущих экспериментальных животных, чтобы повлиять на результаты следующего эксперимента.

 

1.3.7 Окрашивание TTC

После эксперимента крыс взвешивали и анестезировали внутрибрюшинной инъекцией. После этого крысы были убиты, а мозг был вывезен. Ткани мозга промывали физиологическим раствором и помещали в -20 степень в течение 30 минут для нарезки. Мозг был разделен на 5 срезов в корональном положении. Разрезанные ломтики мозга помещали в предварительно разогретый раствор окрашивания TTC и окрашивали в 37 -градусную водяную баню от света в течение 30 минут. После окрашивания они были зафиксированы 4% параформальдегидом. Фиксированные срезы ткани мозга были размещены в порядке и сфотографированы. Животные с сгустками крови у основания черепа и тромбоза артериального кольца были устранены. Программное обеспечение для анализа изображений Image Pro-Plus (IPP) использовалось для расчета области инфаркта головного мозга. Коэффициент площади инфаркта/%=Сумма областей инфаркта каждого секции/сумма областей каждого раздела × 100% [10].

1.3.8

После того, как мозговая ткань была фиксирована с помощью 4% параформальдегида, она была обезвожена с градиентным спиртом, стал прозрачным с ксилолом и полностью погружен в воск в парафиновую ванну, а ткань мозга была встроена в парафин. Толщина парафиновых срезов составляла 5 мкм. Парафиновые срезы последовательно помещали в ксилол, градиентный спирт и промывали дистиллированной водой в течение 5 минут. Срезы помещали в раствор окрашивания NISSL, приготовленный заранее и окрашивали на 60 градусов в течение 40 минут. Срезы были дифференцированы в 95% алкоголе, а дифференциация наблюдалась под микроскопом. Дифференциация была остановлена, когда фон был голубого, а тела NISSL были явно окрашены. Срезы были обезвожены в безводном этаноле, стали прозрачными с ксилолом и запечатаны нейтральной жевательной резинкой. После того, как срезы были высушены, морфология нервных клеток наблюдалась под микроскопом, и изображения собирали и анализировали путем фотографирования в системе сбора изображений.

1.3.9 иммуногистохимическое окрашивание
Рутинное обезвоживание мозговой ткани, внедрение, секция, деэгревация к воде, восстановление теплового антигена высокого давления, промывание PBS 3 раза, 5 минут каждый раз, добавляют эндогенный блокатор пероксидазы, инкубированный при комнатной температуре в течение 10 минут, PBS промыв 3 раза, 5 минут каждый раз. Первичная инкубация антител, 4 градуса в течение ночи, переосмысливается при комнатной температуре в течение 30 минут, промывание PBS 3 раза, 5 минут каждый раз, добавляется раствор для усиления реакции, инкубированный при 37 градусах в течение 25 минут, промывание PBS 3 раза, 5 минут каждый раз, усиленные фермента промывка, гематоксилин, противостояние, восходящее градиент -дегидратация, прозрачный ксилол и герметизация.

 

1.3.10 Окрашивание Тунеля

Dewax the paraffin sections to water, spin dry the sections, add proteinase K working solution, incubate at 37 degree for 25 min, wash with PBS 3 times, 5 min each time, add membrane permeabilization solution, incubate at room temperature for 20 min, wash with PBS 3 times, 5 min each time, add TUNEL reaction solution, mix according to TDT enzyme: dUTP: buffer=1: 5: 50, Инкубируйте при 37 градусах в течение 1 часа, промывайте PBS 3 раза, 5 минут каждый раз, добавляйте раствор окрашивания DAPI, инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут, промывают PBS 3 раза, 5 минут каждый раз, запечатайте срезы антифлуоресцентным гайкой, наблюдайте и собирайте изображения под флуоресцентным микроскопом.

 

1.3.11 Вестерн -блот

После добавления мозговой ткани в буфер лизиса белка, ткань мозга была полностью измельчена с помощью шлифовального стержня, а белок несколько раз разбился ультразмонически в ледяной ванне. Супернатант центрифугировали в течение 15 минут при низкотемпературной ультрацентрифуге. Супернатант был извлечен и концентрацию определяли с использованием набора BCA. Буфер нагрузки белка добавляли и помещали в металлическую ванну 100 градусов для денатурации в течение 5 минут. Подготовлены концентрирующие гель и гель для разделения, и 20 мкг образца добавляли в каждую лунку для электрофореза. После электрофореза мембрану переносили при постоянной скорости потока в течение 2,5 ч, а 5% порошка обезжиренного молока блокировали при комнатной температуре в течение 2 часов; Первичное антитело встряхивали на 4 градуса в течение ночи, а вторичное антитело инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов; полосы были сканированы и проанализированы с использованием системы анализа изображений.

 

1.4 Статистические методы

Все экспериментальные результаты были выражены как среднее ± стандартное отклонение (x  S), и статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9.5. Anona одностороннего использования использовалась для сравнения данных каждой группы, и T-критерий или непараметрический тест использовался для парного сравнения внутри группы. P <0. 05 Указанные статистически значимые различия.