Маркеры качества Cistanches Herba на основе взаимосвязи антиоксидантного спектра и эффекта

Аннотация: Цель: Установить метод исследования маркеров качества (Q-маркеров)Цистанчес Херба(CH) на основевзаимосвязь антиоксидантного спектра и эффекта, обеспечивающая основу для изучения ее фармакологических веществ и контроля качества. Методы: Сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография (UPLC) использовалась для установления профилей отпечатков пальцев для 10 партий CH. Была создана модель окислительного повреждения клеток с использованием H2O2, а антиоксидантная способность CH была определена на основе полумаксимальной ингибирующей концентрации активных форм кислорода, а также уровнейсупероксиддисмутазаикаталазакакфармакологические показатели. Зависимость спектр-эффект была построена с помощью анализа главных компонент, корреляционного анализа Пирсона и регрессионного анализа частичных наименьших квадратов.активные компонентыбыли подвергнутыфармакологическая валидация. 

Полученные результаты:Профили отпечатков CH были установлены с использованием UPLC, идентифицировав 17 общих пиков. На основе корреляционного анализа спектр-эффект были выбраны девять компонентов. Результаты фармакологической валидации показали, что генипозидовая кислота, 8-эпилогановая кислота,эхинакозид,актеозид, изоактеозид, итубулозид Апроявлял антиоксидантную активность в зависимости от концентрации.

Вывод: В этом исследовании изучались Q-маркеры для CH на основе взаимосвязи «спектр-эффект», предоставляя справочную информацию для основы фармакологического вещества и улучшения стандартов качества.

Ключевые слова:Цистанчес Херба; Q-маркер;соотношение спектр-эффект; антиоксидант

Cistanche Deserticola — это высушенный мясистый стебель с чешуйчатыми листьями Cistanche Deserticola YCMa или Cistanche Tubeulosa (Schenk) Wight, растения, принадлежащего к семейству Orbaceae Cistanche Deserticola. Он теплый по своей природе, сладкий и соленый на вкус; возвращается к меридианам почек и толстого кишечника; он питает ян почек, восполняет эссенцию и кровь, увлажняет кишечник и оказывает слабительное действие, а также является важным лекарством для тонизирования почек и восполнения эссенции [2-3]. Почки хранят эссенцию, а эссенция и кровь происходят из одного источника. Если эссенции и крови недостает, это отразится на общей жизнедеятельности человеческого организма; костный мозг, производящий эссенцию, хранится в костях, а мозг — это море костного мозга. Если эссенции почек недостаточно, кости потеряют питание, а мозг будет недостаточно питаться, что приведет к дегенеративным изменениям костей, таким как рыхлая текстура, потеря зубов, потеря памяти, деменция и снижение иммунной функции [4-6]. Cistanche Deserticola содержит фенилэтаноидные гликозиды, иридоиды, лигнаны и другие структурные компоненты, включая эхинакозид, вербаскозид, вербаскозид, генипиновую кислоту и 8-эпистриановую кислоту. , тубулин А и др. [7]. Текущий контроль качества Cistanche Deserticola в издании «Фармакопеи Китайской Народной Республики» 2020 года оговаривает только содержание эхинакозида и вербаскозида, что не может в полной мере отражать многокомпонентные и многоцелевые характеристики действия традиционной китайской медицины. , что не способствует его контролю качества и оценке.

С целью повышения уровня контроля качества традиционной китайской медицины и оптимизации оценки качества традиционной китайской медицины академик Лю Чансяо предложил новую концепцию маркера качества (Q-маркера) традиционной китайской медицины [8]. Среди них «эффективность» является основным элементом «Пяти принципов» Q-маркера [9], а также основой оценки качества традиционных китайских лекарств.

Учитывая текущий статус исследований плохой корреляции между стандартами качества и эффективностью лекарств, изучение Q-маркеров традиционных китайских лекарств и установление более научных и разумных стандартов качества имеет большое значение для улучшения качества традиционных китайских лекарств. Взаимосвязь «спектр-эффект» связывает хроматографические пики отпечатков пальцев традиционной китайской медицины с конкретными фармакодинамическими данными для поиска эффективных веществ традиционной китайской медицины, тем самым отражая неотъемлемое качество традиционной китайской медицины [10]. Создание математической модели спектральной эффективности может прояснить QMarker традиционной китайской медицины с точки зрения «холистического взгляда», предоставляя больше возможностей для последующего контроля качества традиционной китайской медицины, формулирования стандартов качества и проверки активных ингредиентов. В этом исследовании используются отпечатки пальцев в сочетании со скоростью половинного ингибирования активных форм кислорода (ROS IC50), содержанием супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы (CAT) для изучения взаимосвязи спектра и эффекта традиционной китайской медицины, а также используется анализ главных компонентов. (PCA)), корреляционный анализ Пирсона (PCC) и регрессионный анализ частичных наименьших квадратов (PLS) для всестороннего анализа Q-маркера Cistanche Deserticola и обеспечения основы для его контроля качества.

1 материал

1.1 Образец

Cistanche Deserticola была собрана в уезде Ютянь Синьцзяна и на базе посадки Cistanche Deserticola Good Agricultural Practice (GAP) во Внутренней Монголии. Исследователь Чжан Теджун из Тяньцзиньского фармацевтического научно-исследовательского института Co., Ltd. идентифицировал его как Cistanche Tubeulosa (Schenk) Wight и Cistanche Deserticola.

YC Ma, подробная информация представлена ​​в таблице 1.

1.2 Тестовое лекарство

Эхинацеазид (номер партии: 111670-201907, чистота: 91,8%) и вербаскозид (номер партии: 111530-201914, чистота: 95,2%) были приобретены в Китайском институте контроля пищевых продуктов и лекарств; изорескозид (номер партии: 61303-13 -7), салидрозид (номер партии: 10338-51-9), 8-эпистрихноевая кислота (номер партии: 82509-41-9), генипиновая кислота (номер партии: Z24A10X95926) , тубероза B (номер партии: 112516-04-08), 2-ацетилэвгенолгликозид (номер партии: 94492-24-7) были приобретены у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., чистота выше или равна 98%; Гликозид А цистанхе (номер партии: MUST -20062806, чистота: 98,51%), флоридин А (номер партии: MUST19110102, чистота: 98,57%) были приобретены у Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; хроматографически чистый ацетонитрил и муравьиную кислоту приобретали у компании Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Очищенная вода (Ханчжоу Wahaha Group Co., Ltd.). витамин Е (VE, V8010, компания Beijing Solarbio); диметилсульфоксид (ДМСО, D2660-100ML, Sigma Company, США); CellTiter 96® AQueous набор для обнаружения пролиферации клеток в одном растворе (G3580, Promega Company, США); Обнаружение CAT Набор (S0051), набор для обнаружения активности СОД (S0101M) и набор для обнаружения ROS (S0033S) были приобретены у Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Инструменты

жидкостный хроматограф сверхвысокого разрешения Waters H-class-PDA (Waters Company, США); электронные весы Sartorius BT25S (компания Sartorius, Германия); Высокоскоростная настольная центрифуга H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); СпектраМакс М5

Ридер для микропланшетов (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Биологический микроскоп WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 ячейки

В этом эксперименте использовали клетки эмбриональной почки человека. Клетки HEK 293 были приобретены в банке клеток Китайской академии наук.

2 метода

2.1 Создание карты отпечатков пальцев

2.1.1 Приготовление исследуемого раствора: взвешивают 2 г лекарственного материала Cistanche Deserticola, добавляют в 10-кратное количество воды, нагревают и кипятят с обратным холодильником 3 раза, каждый раз по 1 ч, центрифугируют при 1.0 ×105об·мин-1 в течение 15 мин (радиус центрифуги 300 мм). Объедините надосадочную жидкость и концентрируйте, чтобы получить маточный раствор с массовой концентрацией 100 мг·мл-1, разбавьте его в 10 раз, и отфильтровать его через микропористую мембрану фильтра 0,22 мкм, чтобы получить его.

2.1.2 Приготовление смешанного эталонного раствора

Примите 8-эпистрихновую кислоту, салидрозид, эхинацеазид, цистанхегликозид А, генипиновую кислоту, вербаскозид, антоцианозид А, изорбаскозид и 2'-ацетилэвгенол. Эталонные вещества гликозида и ангиозида B отмеряли в соответствующих количествах и точно взвешивали. Добавьте 50% раствор метанола для растворения и приготовьте смешанный раствор стандартного вещества с массовой концентрацией 20 мкг·мл–1.

2.1.3 Хроматографические условия

колонка ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм); подвижная фаза — ацетонитрил (А) ~ 0,1% раствор муравьиной кислоты (Б), программа градиентного элюирования (0 ~ 6 мин, 5 % ~ 8 % А; 6 ~ 10 мин, 8 % ~ 15 % А). 10–13 мин, 15–19 % А, 13–20 мин, 19–25 % А); длина волны обнаружения – 237 нм; скорость потока – 0,4 мл·мин–1; температура колонки 40 градусов; объем инъекции составляет 3 мкл.

2.1.4 Выбор эталонного пика

В хроматограмме сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) Cistanche Deserticola пик с наибольшей площадью пика, умеренным временем удерживания и хорошим разделением был выбран в качестве эталонного пика фингерпринт-спектра. 2.1.5 Методологическое исследование. Проверка прецизионности: отберите пробу Т1 и приготовьте испытуемый раствор в соответствии с методом, указанным в 2.1.1. Введите образец 6 раз подряд и запишите отпечаток пальца. Результаты показывают, что относительное стандартное отклонение площади каждого пика составляет 0,10%~4,61%. RSD относительного времени удерживания составляет 0,08%~1,32%, что указывает на хорошую точность прибора.

Испытание на повторяемость: Возьмите образец Т1 и параллельно приготовьте 6 образцов испытуемого раствора в соответствии с методом, указанным в 2.1.1, и непрерывно вводите образец. Результаты показывают, что относительное стандартное отклонение площади пика каждого хроматографического пика составляет 1,35%~4,80%, а относительное стандартное отклонение времени удерживания составляет 0,10%~1,80%, что соответствует требованиям отпечатка пальца и показывает, что повторяемость инструмент хороший.

Тест на стабильность: возьмите образец Т1 и приготовьте тестируемый раствор в соответствии с методом, описанным в 2.1.1, введите образцы для тестирования через 0, 2, 4, 8 и 12 часов и запишите отпечатки пальцев. Рассчитанное ОСО относительной площади каждого хроматографического пика составляет 0,53%~4,82%, а ОСО относительного времени удерживания составляет 0,09%~2,17%, что соответствует требованиям отпечатка пальца и указывает на то, что тестируемый продукт стабилен в течение 12 часов.

2.2 Исследование антиоксидантного действия Cistanche Deserticola

2.2.1 Приготовление маточника Cistanche Deserticola:Отбирают маточный раствор по п.2.1.1, фильтруют и стерилизуют, а перед применением разводят питательной средой до необходимой концентрации.

2.2.2 Влияние Cistanche Deserticola и положительного контроля VE на жизнеспособность клеток HEK 293

Создайте нормальную группу (клеточная суспензия), группу введения Cistanche Deserticola (25, 50, 100, 200, 400 мкг·мл–1), группу VE (20, 40, 60, 80, 100 мкмоль·л–1), каждый Установите по 6 дублирующих лунок для каждой концентрации и культивирования в течение 24 часов. Добавьте по 20 мкл реагента CellTiter 96® AQueous в каждую лунку для определения жизнеспособности клеток. Продолжайте культивирование в течение 2 часов. Используйте считыватель микропланшетов для определения значения поглощения (ОП) каждой лунки при 490 нм. Рассчитайте выживаемость клеток по формуле (1). Выживаемость (%)=(экспериментальная группа OD/холостая группа OD) × 100% (1)

2.2.3 Влияние Cistanche Deserticola на АФК, индуцированные H2O2, в клетках HEK 293

Клетки разделяли на нормальную группу (клеточная суспензия) и группу введения Cistanche Deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 мкг·мл–1 Cistanche Deserticola и 60 мкм·л–1 H2O2) и культивировали в течение 24 часов. Следуйте инструкциям набора для обнаружения АФК для последующих операций, непосредственно наблюдайте за окрашиванием клеток через микроскоп и используйте устройство для чтения микропланшетов для определения интенсивности флуоресценции каждой группы. В настройках параметров использовалась длина волны возбуждения 488 нм и длина волны излучения 525 нм. Эксперимент был повторен три раза.

2.2.4 Влияние Cistanche Deserticola на H2O2-индуцированную СОД клеток HEK 293

Разделите клетки на нормальную группу (клеточная суспензия) и модельную группу.

(60 мкм·л–1 H2O2), группа VE (60 мкм·л–1 VE и 60 мкм·л–1 H2O2), группа введения Cistanche Deserticola (100 мкг·мл–1 Cistanche Deserticola и 60 мкм·л–1 H2O2), собрать клетки после 24 ч культивирования, добавить раствор для подготовки проб СОД для лизирования клеток, центрифугировать при 4 градусах, 12000 об/мин-1 в течение 5 мин (радиус центрифуги 300 мм), отобрать супернатант. В качестве образца для тестирования используйте комплект для обнаружения СОД. Выполните следующие действия. Эксперимент был повторен три раза.

2.2.5 Влияние Cistanche Deserticola на H2O2-индуцированную CAT в клетках HEK 293

Следуйте методу, описанному в 2.2.4, и групповому введению, добавьте лизирующий раствор, центрифугируйте при 4 градусах, 12000 об/мин-1 в течение 10 минут (радиус центрифуги 300 мм), возьмите надосадочную жидкость и следуйте инструкциям Комплект обнаружения CAT. Последующие операции. Эксперимент был повторен три раза.

2.2.6 Статистический анализ

Для статистического анализа использовалось программное обеспечение SPSS 26.0. Каждая группа данных была представлена ​​(±±()). Односторонний дисперсионный анализ проводился на данных, которые соответствовали нормальному распределению. Если дисперсии были равны, использовался метод наименьшего значимого различия. Если дисперсии были неравномерными, для построения графиков использовался метод Даннетта T3 и P.<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Корреляционный анализ спектра-эффекта антиоксиданта Cistanche Deserticola

2.3.1 PCA Площади общих пиков 10 партий Cistanche Deserticola, у которых были установлены отпечатки пальцев, были стандартизированы по значению Z и преобразованы в матрицу данных порядка 10 × 17, которая была импортирована в программное обеспечение SPSS 26.0. для ПКА.

2.3.2 PCC Используйте SPSS 26.0 для проведения двумерного анализа для изучения взаимосвязи спектральной эффективности между отпечатками пальцев Cistanche Deserticola и антиоксидантами.

При проверке значимости используется двусторонний тест (T) с P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Импортируйте экспериментальные результаты стандартизированной площади пика и антиоксиданта Cistanche Deserticola в программное обеспечение SIMCA-P 14.1, установите площадь пика в качестве переменной X и установите фармакодинамический индекс в качестве переменной Y для выполнения PLS.

2.4 Проверка антиоксидантной активности Q-маркера Cistanche Deserticola

2.4.1 Приготовление маточного раствора действующего вещества

Точно взвесьте соответствующие количества генипиновой кислоты, 8-эпистрихновой кислоты, эхинацеазида, вербаскозида, изоребаскозида и антоцианозида А и добавьте ДМСО, чтобы растворить их до концентрации 10 ммоль·л–1 для контроля. решение продукта.

2.4.2 Влияние активных ингредиентов на цитотоксичность HEK 293

После инкубации клеток HEK 293 в течение 24 часов добавляли 100 мкл растворов действующего вещества по п. 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 мкмоль·л–1) В каждую лунку добавляли разные концентрации и продолжали стимуляцию. Реагент CellTiter 96® A в виде одного водного раствора добавляли к клеткам через 24 часа для определения жизнеспособности клеток.

2.4.3 Антиоксидантное действие активных ингредиентов на клетки HEK 293, индуцированные H2O2-

Клетки были сгруппированы следующим образом: нормальная группа, модельная группа, группа VE были сгруппированы, как в 2.2.4, экспериментальная группа (0.781, 1,563, 3,125 мкм·л–1 активного ингредиента и 60 мкм·л–1). H2O2), культивировали в течение 24 ч. Определите внутриклеточные уровни АФК, содержание ферментов СОД и КАТ согласно методам 2.2.3, 2.2.4 и 2.2.5 соответственно.

Служба поддержки Wecistanche

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин для получения дополнительных технических характеристик:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop