Количественное протеомное исследование раскрывает путь фибриногена при поликистозной болезни печени Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Результаты
3.1. Почки и печень действуют по разным кистозным механизмам
Предыдущие исследования показали, что ранняя инактивация гена Pkd1 (до p12) провоцирует быстрое развитие поликистозной болезни (кистозное окно), тогда как инактивация после p14 приводит к позднему образованию кист через 4–5 месяцев с легким фенотипом (некистозное окно). [19]. Используя ту же ортологическую модель ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], мы исследовали, соответствует ли это окно развития почек по времени аналогичному окну развития печени. Чтобы провести прямое сравнение с нашими предыдущими исследованиями [37], мышей стимулировали тамоксифеном для инактивации гена Pkd1 на 14-й (p14) и 12-й (p12) послеродовые дни и умерщвляли в возрасте 30 дней (p30). Интересно, что мы наблюдали кистозный фенотип в оба момента времени с разной степенью заболевания (легкой и тяжелой), что позволяет предположить, что почки и печень имеют независимые кистозные окна развития (рис. 1а) и/или возможные разные сроки и прогрессирование заболевания. . Никаких различий между самцами и самками в этом убойном возрасте между обоими окнами инактивации не обнаружено (для каждой группы мутантов использовали n=6). Животные с мутантом p14 имели более мягкий фенотип, чем группа мутантов p12, с более низкими значениями кистозного индекса, количества кист и функции печени в соответствии с уровнем ЩФ в сыворотке (рис. 1b-d). Это первое исследование, показывающее различные окна/механизмы развития недостаточности печени и почек Pkd1. Эти молекулярные различия предстоит определить в будущих исследованиях.
Рисунок 1. Характеристика кистозного фенотипа печени на 3-й день 0 стадии стадии p12 и p14. Делеция Pkd1 в p12 приводит к более тяжелому цистогенезу. ( а ) Репрезентативные макроскопические и микроскопические изображения гематоксилин-эозина, окрашенные из печени мышей Pkd1cond/cond;Tam-Cre дикого типа (WT, Pkd1cond/cond;Tam-Cre-) и мутанта (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+) ) с делецией гена Pkd1, индуцированной тамоксифеном на 14-й день постнатального развития (группа p14) и 12-й день (группа p12). Всех мышей умерщвляли на этапе p30. Масштабная линейка, 2 мм (верхняя панель) 100 мкм (нижняя панель). n представляет количество образцов на группу, а Bd означает желчный проток. (б, в) Печеночный кистозный индекс и количество кист разных фенотипов. (d,e) Значения ЩФ и АЛТ в сыворотке крови. Столбцы представляют собой средние значения ± SEM во всех случаях. p <0,05 по t-критерию Стьюдента (двусторонний) считался значимым результатом. ns не представляет значения. * р < 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001.
Нажмите, чтобы получить траву цистанхе при заболевании почек
3.2. Протеомный анализ «Дробовик» и SWATH-MS в PLD
Как указано на рисунке 2, мы провели дифференциальный анализ протеома на обеих кистозных стадиях (p12 — тяжелая кистозная болезнь и p14 — легкая кистозная болезнь) у мутантов (KO) по сравнению с животными дикого типа (WT), чтобы идентифицировать и охарактеризовать соответствующие молекулярные механизмы, участвующие в цистогенезе печени и прогрессировании заболевания.
Рисунок 2. Иллюстрированная схема рабочего процесса. Мы использовали мышиную модель ADPKD (Pkd1cond/cond; мыши Tam-Cre), в которой генетическая инактивация Pkd1 индуцировалась введением тамоксифена на 10-й день постнатального периода (p10) и p11 (быстрое прогрессирование заболевания) или p15 и p16 (замедленное прогрессирование заболевания). ) в соответствии с переключением развития почечного цистогенеза, что определяет две группы исследования, названные p12 и p14 соответственно [19]. Для обеих групп мы использовали n, равное или превышающее шесть особей дикого типа (WT) и мутантов (KO) в каждом состоянии, и всех животных умерщвляли при p30. Мы изучили дифференциальный протеом печени WT и KO при обеих степенях тяжести кистозной болезни печени (рис. 1), используя как количественный протеомный SWATH-MS, так и зависимый от данных анализ DDA-MS. Из белков со значительным изменением численности мы использовали биоинформатику. Рисунок 2. Иллюстрированная схема рабочего процесса. Мы использовали мышиную модель ADPKD (мыши Pkd1cond/cond;Tam-Cre), в которой генетическая инактивация Pkd1 индуцировалась введением тамоксифена на 10-й день постнатального периода (p10) и p11 (быстрое прогрессирование заболевания) или p15 и p16 (замедленное прогрессирование заболевания). ) в соответствии с переключением развития почечного цистогенеза, что определяет две группы исследования, названные p12 и p14 соответственно [19]. Для обеих групп мы использовали n, равное или превышающее шесть особей дикого типа (WT) и мутантов (KO) в каждом состоянии, и всех животных умерщвляли при p30. Мы изучили дифференциальный протеом печени WT и KO при обеих степенях тяжести кистозной болезни печени (рис. 1), используя как количественный протеомный SWATH-MS, так и DDA-MS-анализ, основанный на данных. Что касается белков со значительным изменением численности, мы использовали инструменты биоинформатики для обнаружения новых терапевтических мишеней и путей, участвующих в заболевании. Наконец, мы подтвердили эти цели, используя сначала стратегии in silico (анализ DDA против SWATH) и, наконец, in vivo, а также RT-qPCR, вестерн-блоттинг и иммуногистохимию. p означает послеродовой день
Характер экспрессии белка при цистогенезе печени Сначала мы провели протеомный масс-спектрометрический анализ с помощью дробовика, зависимого от данных, DDA-MS или DDA. Данный анализ позволяет охарактеризовать протеом по полным и индивидуальным образцам, обеспечивая наличие/отсутствие белков с высокой чувствительностью, но не обеспечивая их количественную оценку. Мы рассматривали исключительно все белки, экспрессируемые дифференциально в более чем пяти независимых образцах из шести образцов, для стадий p14 и p12 дикого типа и мутантных особей соответственно (рис. S1). При p14 были идентифицированы 1 эксклюзивный белок WT (или пониженная регуляция при заболевании) и 7 эксклюзивных белков MUT (активация повышенная), а при p12 наблюдались восемь эксклюзивных белков WT и шесть эксклюзивных белков MUT (рис. S1).
Затем мы использовали метод, который позволил нам количественно оценить дифференциально экспрессируемые белки. Мы провели количественный протеомный анализ SWATH-MS на тех же образцах, которые мы использовали для DDA, получив ~ 1500 белков на образец и более 2000 белков в каждой исследовательской группе. Сначала мы выполнили нормализацию суммы общей площади (TAS), чтобы оценить, что наши выборки соответствуют нормальному шаблону распределения, как показано на рисунках S2 и S3. Затем мы изучили белок со значительными различиями между группами дикого типа и мутанта. В таблице 1 показаны белки со значительным изменением численности с двукратным увеличением (повышающая регуляция) или снижением (понижающая регуляция) и значительным скорректированным значением p (согласно параметрическому t-критерию Стьюдента) в WT против Образцы MUT на p14 и p12. В общей сложности шесть белков показали значительные различия в количестве белков между группами WT p14 и MUT-p14 (пять белков с повышенным уровнем экспрессии и один белок с пониженной регуляцией). Между WT-p12 и MUT-p12 26 белков (20 белков с повышенной регуляцией и 6 белков с пониженной регуляцией) показали значительные различия (рис. 3a и таблица 1). Графически эти вариации можно наблюдать с помощью вулканических графиков, которые были созданы путем построения логарифмических (2)-кратных изменений для всех идентифицированных белков в зависимости от их p-значения -log(10) (рис. 3b). Существенные различия между уровнями содержания белка можно визуализировать на тепловой карте с индивидуальными значениями в соответствии с областями спектральной библиотеки, а также уровнем ее кластеризации при анализе тепловой карты кластера (рис. 3c и S4). Эти кластеры, обнаруженные с помощью анализа SWATH-MS, помогают нам идентифицировать те качественно разделенные образцы, которые необходимо учитывать для количественного анализа (рис. S5). Был проведен неконтролируемый многомерный статистический анализ с использованием анализа главных компонентов (PCA) для сравнения данных между образцами (рисунок S6). Данные тепловой карты и PCA продемонстрировали воспроизводимость среди трех экземпляров образца, поскольку три повтора были тесно кластеризованы в обоих анализах. Мы можем наблюдать как в PCA, так и в кластерном анализе тепловой карты (рисунки S5 и S6), как некоторые образцы сгруппировались неправильно, перекрываясь между обоими кластерами. Тем не менее, мы видим тенденцию к разделению данных в кластерах дикого типа и мутантов. Меньшее количество белков со значительными различиями в р14 по сравнению с р12 может быть оправдано различной степенью тяжести (рис. 2), что позволяет предположить, что количество белков и путей увеличивается в зависимости от тяжести и статуса заболевания кистозного фенотипа.
3.3. Кластеризация, обогащение путей и анализ межбелкового взаимодействия экспрессии генов в PLD
Чтобы установить функцию, связанную с дифференциально экспрессируемыми белками, выявленными с помощью анализа SWATH-MS, мы использовали несколько биоинформатических инструментов и форм анализа. Анализ терминов и путей генной онтологии (GO) проводился с использованием FunRich [39,40], String [41] и Reactome [42]. Белки были отсортированы с помощью анализа обогащения генов FunRich. Что касается биологического процесса, наиболее обогащенная группа белков для группы р14 (легкая кистозная форма) была связана с транспортом жирных кислот и биосинтезом простагландинов, а для группы р12 (тяжелая кистозная форма) - с активностью фибриногена/фибрина, адгезией между клетками/матриксом и метаболическими процессами. процесс (рис. 4а, верхняя панель). ANXA2 и комплекс фибриногена были двумя наиболее обогащенными клеточными компонентами в группах p14 и p12 соответственно. Кроме того, внеклеточное пространство было клеточным компонентом с самым высоким процентом белков в обеих группах (рис. 4а, нижняя панель). Аналогично, тот же анализ был установлен с помощью строкового анализа, идентифицировавшего различные метаболические процессы как основной биологический процесс, а внеклеточное пространство как наиболее обогащенный клеточный компонент; соответствует результатам GO (рис. S7a). Наконец, мы повторили анализ с помощью платформы Reactome и обнаружили, что обмен веществ и иммунная система являются наиболее обогащенными путями (рисунок S7b).
Для исследования возможных белок-белковых взаимодействий (взаимодействий с экспериментальными данными) также проводился белок-белковый или кластерный анализ на основе строкового анализа. Многочисленные белковые взаимодействия были идентифицированы в разных группах (рис. S8), но один кластер в p14 и другой в p12 были наиболее релевантными, исходя из количества взаимодействий между белками и уровня экспрессии (рис. 4b). Кластер p14- содержит белок аннексина А2 (ANXA2_P07356), связанный с несколькими клеточными функциями, такими как фибринолиз, подвижность клеток (в эпителиальных клетках), белок, родственный актину. взаимодействия цитоскелета и клеточного матрикса [43], взаимодействующие с двумя другими белками, участвующими во внутриклеточном транспорте липидов (FABP1_P12710 и FABP5_Q05816). Интересно, что в кластере p12- была идентифицирована еще одна значимая группа белков с очень сильным белок-белковым взаимодействием между несколькими фибриногенами (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22) }}E9PV24 и FIBGG_Q8VCM7). Фибриногены участвуют в росте гепатоцитов и опосредуют распространение тромбоцитов, интерстициальный коллаген и фиброзные поражения [44]. Кроме того, было обнаружено, что дополнительные белки взаимодействуют с фибриногенами (рис. S8), такие как сывороточный амилоидный p-компонент (SAMP_P12246), гемопексин (HEMO_Q91X72) или оксидаза гидроксикислот 2 (HAOX{). {37}}Q9NYQ2). В соответствии с результатами строк, ANXA2 и комплексы фибриногена также были наиболее обогащенными клеточными компонентами, выявленными с помощью анализа FunRich (рис. 4a). Интересно, что при сравнении данных, полученных с помощью анализа DDA и SWATH, мы подтвердили, что несколько белков, идентифицированных с помощью SWATH, также были идентифицированы с помощью анализа DDA, в том числе несколько белков, связанных с комплексом фибриногена (SAMP/Apcs и S10A9/S100a9; таблица S3).
3.4. Валидация анализа SWATH-MS раскрывает фибриногеновый комплекс как новый молекулярный механизм, связанный с PLD
На основании этих данных мы выбрали из анализа SWATH-MS (рис. S9) измененные белки, связанные с комплексом фибриногена на стадиях p12 и p14, для проверки in vivo с помощью RT-qPCR, вестерн-блоттинга и иммуногистохимии, чтобы установить их возможное подтверждение. мишени болезней. Восемь из 10 этих выбранных белков были подтверждены на уровне мРНК с помощью RT-qPCR (рис. 5); один с повышенным уровнем регуляции на стадии 14-(ANXA2_P07356) и в группе p12- (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 и FIBG_Q8VCM7), и один нижний- регулируется в группе p12 (HAOX2_Q9NYQ2). Интересно, что экспрессия генов двух белков с большим или меньшим количеством взаимодействий с группой фибриногена (ILK и S10A9) была единственной, которая не была подтверждена (рис. 5c).
Повышение регуляции комплекса фибриногена (белки ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG и HAOX2) было дополнительно подтверждено анализом вестерн-блоттинга (WB) (рис. 6). В целом экспрессия генов и WB полностью соответствовали протеомным данным SWATH-MS. Наконец, мы также провели иммуногистохимическую проверку комплекса фибриногена в образцах мутантной и поликистозной печени (рис. 7). Окрашивание фибриногена сильно усиливалось в эпителиальных клетках, выстилающих кисты, и в расширениях желчных протоков (рис. 7а). Эти результаты впервые раскрывают фибриногеновый комплекс как возможный путь, связанный с печеночным цистогенезом, и как возможную будущую терапевтическую мишень для PLD.
Рисунок 5. Проверка возможных целей PLD с помощью RT-qPCR. Экспрессия генов от 8 до 10 выбранных мишеней коррелировала с данными SWATH-MS. RT-qPCR выбранного целевого аннексина A2 p14 с повышенным уровнем экспрессии (Anxa2) (a); повышенная регуляция p12 нацелена на компонент p-амилоида, сыворотку (Apcs, ген SAMP), фибриноген-подобный 1 (Fgl1), бета-цепь фибриногена (Fgb), гемопексин (Hpx), альфа-цепь фибриногена (Fga), гамма-цепь фибриногена (Fgg) (b), интегрин-связанная киназа (Ilk) и S10{{30}} кальцийсвязывающий белок A9 (S100a9) (c); и пониженная регуляция целевой оксидазы гидроксикислот p12 (Hao2) (d). n=6 использовали для каждой группы белков. Gapdh использовался как ген домашнего хозяйства. Столбцы представляют собой средние значения ± SEM. Использовался t-критерий Стьюдента с двумя хвостами, и значение p <0,05 считалось значимым. нс: незначительно (р больше или равно 0,05), * р < 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001.
Рисунок 7. Комплекс фибриногена активируется в кистозном эпителии. (а, б) Репрезентативные изображения иммуногистохимии фибриногена в желчных протоках (верхняя панель) и паренхиме печени (нижняя панель) (а) и его количественная оценка (б). n=6 использовалось для каждой группы. Иммуногистохимический анализ показал повышение уровня фибриногена через кистозный эпителий. Образцы соответствовали группе р12. Масштабные линейки представляют собой 100 мкм. Bd означает желчный проток. Столбцы представляют собой средние значения ± SEM. Использовался t-критерий Стьюдента с двумя хвостами, и значение p <0,05 считалось значимым. *** р < 0,001.
Служба поддержки Wecistanche - крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:
Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Телефон:+86 15292862950
Магазин для получения дополнительных технических характеристик:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
