для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Санте Принсьеро Берлингерио^1,†, Цзюньлин Хэ^2,†, Лис Де Гроеф ³, Гарольд Татер⁴, Томас Нортон⁴, Питер Баатсен ⁵, Сара Кайроли⁶, Бьянка Гоффредо⁶, Питер де Витте ⁷, Ламбертус ван ден Хевел^1,8, Ханс Дж. Баэльде²и Елена Левченко^1,*

^{Часть I: Почечные и внепочечные проявления у взрослых рыбок данио Модель цистиноза}

¹Лаборатория детской нефрологии, KU Leuven, 3000 Leuven, Бельгия; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (СПБ); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (LvdH)

²Отделение патологии, Медицинский центр Лейденского университета, 2300 RC Лейден, Нидерланды; J.He@lumc.nl (ДД); j.j.baelde@lumc.nl (ХДБ)

³ Исследовательская группа по развитию и регенерации нейронных цепей, KU Leuven, 3000 Leuven, Бельгия; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Группа M3-BIORES, Подразделение инженерии по охране здоровья животных и человека, KU Leuven, 3000 Leuven, Бельгия; harold.taeter@kuleuven.be (ВТ); tomas.norton@kuleuven.be (Теннесси)

⁵Молекулярная нейробиология, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Бельгия; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶отделение детской медицины, лаборатория метаболической биохимии, детская больница Бамбино Джезу, IRCCS, 00146 Рим, Италия; sara.cairoli@opbg.net (СК); biancamaria.goffredo@opbg.net (БГ)

⁷Лаборатория молекулярного биооткрытия, KU Leuven, 3000 Leuven, Бельгия; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Отделение детской нефрологии, Медицинский центр Университета Радбауд, 6525 GA Неймеген, Нидерланды

^*Корреспонденция: elena.levtchenko@uzleuven.be; Тел.: плюс 32-16-34-38-22

^† Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Абстрактный:Цистинозредкое неизлечимое аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное мутациями в гене CTNS. Этот ген кодирует лизосомальный переносчик цистина цистиноз, приводящий к накоплению лизосомального цистина во всех клетках организма, причем в первую очередь поражаются почки. Текущее лечение цистеамином снижает накопление цистина, но не устраняет дисфункцию проксимальных канальцев, повреждение клубочков или потерюпочечныйфункция. В нашем предыдущем исследовании мы разработали модель цистиноза у рыбок данио посредством нонсенс-мутации в гене CTNS и показали, что личинки рыбок данио повторяютпочкафенотип, описанный у человека. В настоящем исследовании мы охарактеризовали взрослуюцистинозмодели рыбок данио и оценили долгосрочные последствия болезни напочкаи внепочечный органов с помощью биохимических, гистологических исследований, исследований фертильности и двигательной активности. Мы обнаружили, что взрослыйцистинозу рыбок данио наблюдается накопление цистина в различных органах, измененная морфология почек, нарушение пигментации кожи, снижение фертильности, изменение двигательной активности и глазные аномалии. В целом, наши данные показывают, что взрослыйцистинозМодель рыбок данио воспроизводит несколько человеческих фенотипов цистиноза и может быть полезна для изучения патофизиологии и долгосрочных эффектов новых методов лечения.

Ключевые слова:почкаболезнь;цистиноз; модель рыбки данио;почечныйи внепочечный проявление; фенотипические особенности взрослых

1. Введение

ЦистинозЭто аутосомно-рецессивное заболевание накопления, вызванное мутациями в гене CTNS, который кодирует лизосомальный котранспортер протонов цистина цистиноз, переносящий цистин из просвета лизосом в цитозоль. В заболевание вовлечено несколько органов, таких как мышцы, яички, глаза и мозг, и среди всего прочего,почкиявляются первыми и наиболее сильно поражаемыми органами [1]. Наиболее частым и тяжелым клиническим вариантом является инфантильный нефропатическийцистинозпри котором первым клиническим проявлением являетсяпочечныйСиндром Фанкони, характеризующийся поражением эпителиальных клеток проксимальных канальцев.

(PTE) реабсорбция, приводящая к потере с мочой аминокислот, глюкозы, белков с низкой и средней молекулярной массой и других метаболитов. Повреждение ПТЭО сопровождается прогрессирующей гломерулярной дисфункцией и, если его не лечить, приводит к терминальной стадии.почказаболевание [1]. Текущий терапевтический подход состоит в применении цистеамина, аминотиола, разрушающего цистин, который разрушает дисульфидный мостик цистеина, что приводит к образованию аминокислоты цистеина и смешанного дисульфида цистеамина и цистеина. Эта последняя молекула может выходить из лизосом через переносчик аминокислот PQLC2 [2]. Однако лечение цистеамином, хотя и снижает накопление лизосомального цистина, лишь задерживает прогрессирование заболевания [3–5]. Поэтому для дальнейшего понимания патогенезацистинози разработка новых rapeuticoption все еще находятся в повестке дня исследований. Было разработано несколько моделей животных, чтобы воспроизвести фенотип цистиноза [6,7]. Одной из наиболее часто используемых моделей является мышь Ctns-/- C57BL/6, у которой развивается накопление цистина и умеренная проксимальная тубулопатия. Однако он не показывает повреждения клубочков, и было обнаружено, что фенотип зависит от генетического фона [8].

На сегодняшний день модели рыбок данио стали привлекательным инструментом для исследования заболеваний человека благодаря ряду преимуществ, таких как их быстрое развитие, высокая плодовитость, более низкая стоимость обслуживания и доступность легко применимых технологий редактирования генов [9]. В предыдущем исследовании мы представили конгенную модель личинок рыбок данио с гомозиготной нонсенс-мутацией в экзоне 8 гена ctns-/-, приводящей к функциональной утрате цистиноза [10], что приводит к накоплению цистина во всем организме, увеличению деформация личинок, задержка развития ипочкананосить ущерб. Однако долгосрочные последствия болезни у взрослых рыбок данио до сих пор не изучены. В настоящем исследовании мы стремились охарактеризоватьпочечныйи внепочечные проявления на модели взрослых рыбок даниоцистиноз.

Нажмите, чтобы ОрганическийЦистанхе при почечной недостаточности

2. Результаты

2.1. Цистин накапливается в Ctns-/- рыбках данио

Цистинозсчитается мультисистемным заболеванием, приводящим к накоплению цистина во всех клетках организма. В нашей предыдущей работе мы обнаружили, что у рыбок данио с цистинозом (ctns-/-) накопление цистина начинается с личиночной стадии развития и в некоторых органах до возраста 8 месяцев [9]. Чтобы оценить, поддерживает ли наша модель накопление цистина на более поздних стадиях заболевания, мы измерили уровни цистина во всем организме.почка, семенники, глаза, мышцы и мозг у 18-месячных ctns-/- рыбок данио по сравнению с самцами данио дикого типа того же возраста. Мы обнаружили 54-кратное увеличение содержания цистина во всем теле (рис. 1A) и 146-кратное увеличение содержания цистина в почках (рис. 1B) у ctns-/- данио по сравнению с данио дикого типа. Более того, мы наблюдали обширное накопление цистина в семенниках, глазах, мышцах и головном мозге (рис. 1C-F) у ctns-/- рыбок данио.

2.2. Почечная манифестация

2.2.1. Ctns-/- Рыбки данио Присутствуют повреждения PTEC

Посколькупочкаявляется наиболее сильно пораженным органом, мы исследовали гистологические характеристики почки с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и периодической кислотой-Шиффа (PAS). Мы отметили наличие мутного отека, гиалиноподобных эозинофильных капель и цитоплазматических вакуолей в PTEC ctns-/- данио (рис. 2B, D), но не у рыбок данио дикого типа (рис. 2A, C). Следует отметить, что повреждения дистальных канальцев обнаружено не было. Кристаллы цистина ранее наблюдались в ПТЭО в виде цитоплазматических вакуолей прямоугольной или полиморфной формы [11]. Поэтому мы исследовали, присутствуют ли эти структуры в канальцах рыбок данио. Мы обнаружили многочисленные цитоплазматические вакуоли в PTEC ctns-/- рыбок данио посредством окрашивания толуидиновым синим (рис. 3B, D, обозначены звездочками). Кроме того, мы обнаружили вакуолярное пространство прямоугольной или полиморфной формы (рис. 3Б, Г, обозначено стрелками). Мы подтвердили это открытие с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (рис. 3F). Эти структуры отсутствовали в PTEC рыбок данио дикого типа (рис. 3А, С, Е). Интересно, что в дополнение к наличию вакуолей полиморфной формы мы наблюдали частичную потерю щеточной каймы в ультраструктуре ПТЭО (рис. 3F).

Рисунок 1. Содержание цистина в гомогенатах данио дикого типа и ctns-/-. (A–F) Содержание цистина во всем теле (A),почка(B), семенники (C), глаза (D), мышцы (E) и мозг (F) у самцов данио дикого типа и ctns-/- 18- месячного возраста. Концентрация цистина выражается в нмоль/мг белка. Каждая точка представляет одну рыбку данио, всего n=3 самцов данио дикого типа и n=3 центов-/- 18- месячных самцов данио; непарный t-критерий с поправкой Уэлча, двусторонний: * p < 0.05;="" **=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Фигура 2.Почкагистология у рыбок данио дикого типа и ctns-/-. (A, B) Репрезентативные изображенияпочечныйканальцы дикого типа (A) и ctns-/- (B) 18- месячных рыбок данио. Детали проксимальных канальцев с гиалиноподобными эозинофильными каплями (черные стрелки) и цитоплазматическими вакуолями (*). Окрашивание H&E. Масштабные полосы представляют 50 мкм. (C, D) Репрезентативные изображения окрашивания PAS почечных канальцев дикого типа (C) и ctns-/- (D) 18- месячных рыбок данио. Детали проксимальных канальцев с гиалиноподобными каплями (черные стрелки) и цитоплазматическими вакуолями (*). ПАС-окрашивание. Масштабные полосы представляют 50 мкм. PT: проксимальный каналец; ДТ: дистальный каналец.

Рисунок 3.Почкакристаллы цистина в PTEC дикого типа и ctns-/- рыбок данио. (A, B) Репрезентативные изображения, окрашенные толуидиновым синимпочечныйпроксимальные канальцы у дикого типа (A) и ctns-/- (B) 18- месячных рыбок данио. Масштабные полосы представляют 50 мкм. (C, D) На рисунках 3C, D показано большее увеличение рисунка 3A, B. Детали проксимальных канальцев почек с цитоплазматическими вакуолями ((D); *), прямоугольными и полиморфными вакуолярными пространствами ((D); черные стрелки). (E, F) Репрезентативные ПЭМ-изображения проксимальных канальцев почек дикого типа (E) и ctns-/- 18- месячных рыбок данио (F). (F) Частичная потеря щеточных границ проксимальных канальцев (PB) и накопление прямоугольных и полиморфных вакуолей (*) наблюдались в проксимальных канальцах почек ctns-/- рыбок данио. На изображении прямоугольника в правом нижнем углу с большим увеличением видны полиморфные вакуоли и большая вакуоль с прямыми сегментами границы мембраны (прямая линия). Масштабные полосы представляют 5 мкм.

2.2.2. Ctns-/- Рыбки данио показывают клубочковую гипертрофию

Поскольку повреждение клубочков обычно следует за поражением ПТЭО, мы оценили гистологию клубочков рыбок данио ctns-/- и обнаружили, что рыбки данио ctns-/- показали значительное увеличение капсулы Боумена (рис. 4B, E) и пучка клубочков (рис. 4B, F), но не пространства Боумена (рис. 4B). , G) по сравнению с самцами данио дикого типа (рис. 4A, E-G). То же самое было подтверждено для клубочкового пучка у самок рыбок данио, несущих мутацию ctns-/- (рис. 4F), и аналогичная тенденция наблюдалась при измерении пространства Боумена и капсулы Боумена (рис. 4Е, G). Пролиферации мезангиальных клеток или гломерулосклероза не наблюдалось. На изображениях ПЭМ мы не наблюдали изменений на базальной мембране клубочков, сглаживания ножки подоцитов или аномально фенестрированных эндотелиальных клеток в клубочках ctns-/- данио (рис. 4D) по сравнению с данио дикого типа (рис. 4C).

Рисунок 4. Морфология клубочков у рыбок дикого типа и у рыбок данио ctns-/-. (A, B) Репрезентативные изображения клубочка дикого типа (A) и ctns-/- (B) 18- месячных рыбок данио. ПАС-окрашивание. Масштабные полосы представляют 50 мкм. (C, D) Репрезентативные ПЭМ-изображения клубочка данио дикого типа ( ctns-/- (D). Масштабные полосы представляют 1 мкм. (E-G) Количественное определение площади поверхности капсулы Боумена (E), гломерулярный пучок (F) и пространство Боумена (G) рыб дикого типа и данио у обоих полов.

2.2.3. У Ctns-/- рыбок данио наблюдается повышенный апоптоз на уровне PTEC

Далее мы исследовали,цистинозвызвал гибель клеток в нашей модели рыбок данио [10,12]. Мы выполнили иммуноокрашивание расщепленной каспазы-3 впочечныйтканях рыбок данио дикого типа и ctns-/-, и мы наблюдали значительное увеличение уровней расщепленного белка каспазы 3 в PTEC рыбок данио ctns-/- (рис. 5B, D, G) по сравнению с рыбками данио дикого типа (рис. 5A, C, Г) у обоих полов. Экспрессия расщепленной каспазы -3 в основном присутствовала в клетках с полиморфными цитоплазматическими вакуолями (фиг. 5B, D). Никакой экспрессии расщепленной каспазы -3 не было в клубочках, как у рыбок дикого типа, так и у ctns-/- рыбок данио (рис. 5E, F).

Рисунок 5. Повышенный апоптоз в PTEC с вакуолями у ctns-/- рыбок данио. (A, B) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания расщепленной каспазой -3 канальцев дикого типа (A) и ctns-старых рыбок данио. Масштабные полосы представляют 50 мкм. (C, D) Нижние панели показывают большее увеличение выделенных областей на верхних панелях. Детали ПТЭО с цитоплазматическими вакуолями (*). Масштабные полосы представляют 50 мкм. (E, F) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания расщепленной каспазой -3 клубочков дикого типа (E) и ctns-/- (F) 18- месячных рыбок данио. Масштабные полосы представляют 50 мкм. (G) Количественное определение трубчатой ​​каспазы -3, окрашивающей положительную область у рыбок дикого типа и данио у обоих полов. Каждая точка представляет одну рыбку данио, всего n=3 рыбок дикого типа и ctns-/- 18- месячных рыбок данио. Двухфакторный дисперсионный анализ с критерием наименьшей значимой разницы Фишера (PLSD): ** p < 0,01;="" ***="" р=""><>

2.3. Внепочечные проявления

2.3.1. Ctns-/- Рыбки данио демонстрируют характерный рисунок гипопигментированной пятнистой кожи.

Цистинозу пациентов часто наблюдается преждевременное старение кожи, гипопигментация и светлые волосы [1,13]. Интересно, что мы наблюдали гипопигментированный пятнистый узор на коже ctns-/- рыбок данио, в то время как у рыб дикого типа был типичный узор в виде черных полос. Фенотип присутствует у обоих полов в течение всей их жизни (рис. 6А, В). Чтобы исследовать разницу в пигментации, мы выполнили окрашивание кожи рыбок данио PAS и обнаружили, что у рыбок данио ctns-/- изменено распределение слоя меланина в эпидермисе, что вызвало появление светлых пятен (рис. 6C, D).

Рисунок 6. Рисунок кожи с гипопигментированными пятнами у рыбок данио ctns-/-. (A, B) Репрезентативные изображения рыбок данио дикого типа (A) и ctns-/- (B) 18- месячных рыбок данио. Масштабные полосы представляют 0,5 см. Черные стрелки указывают на различные полосатые узоры кожи. (C, D) PAS-окрашенные изображения эпидермиса дикого типа (C) и ctns-/- (D) 18- месячных рыбок данио. Черные стрелки выделяют слой меланина. Прерывание в слое меланина присутствует у ctns-/- (D), тогда как у рыбок данио дикого типа оно отсутствует (C). Шкала баров представляет 50 µ

2.3.2. Ctns-/- рыбки данио показывают сперматогенные кисты, обогащенные сперматозоидами

ЦистинозИзвестно, что он влияет на функции яичек, что приводит к азооспермии и бесплодию у пациентов мужского пола [14–16]. Происхождение азооспермии до сих пор неясно, хотя было показано, что сперматогенез на уровне яичек не нарушен. В отличие от пациентов мужского пола, женщины с цистинозом фертильны [17]. В нашей модели рыбок данио и самки, и самцы ctns-/- рыбок данио плодовиты. Чтобы выяснить, влияет ли мутация ctns-/- на анатомию яичка, мы провели окрашивание PAS и обнаружили повышенное накопление сперматозоидов в сперматогенных кистах у рыбок данио ctns-/-.

Рисунок 7. Сперматогенные кисты, обогащенные сперматозоидами, у рыбок данио ctns-/-. (A, B) Репрезентативные окрашенные H&E изображения семенников дикого типа (A) и ctns-/- (B) 18- месячных рыбок данио. Темно-синее и округлое окрашивание представляют сперматозоиды, накопленные в сперматогенных кистах (обозначены звездочками). Масштабные полосы представляют 200 мкм.

2.3.3. Ctns-/- Самки рыбок данио демонстрируют снижение яйценоскости

Чтобы исследовать функциональность репродуктивной системы, мы измерили яйценоскость и процент оплодотворенных яиц как у рыбок дикого типа, так и у рыбок данио ctns-/-. Мы обнаружили, что у самок ctns-/- снижается яйценоскость (рис. 8А) и снижается процент оплодотворенных яиц (рис. 8В) по сравнению с самками дикого типа.

Рисунок 8. Яйценоскость и процент оплодотворенных яиц у рыбок данио дикого типа и ctns-/-. (A) Яйценоскость измерялась как общее количество яиц у рыбок данио дикого типа и ctns-/- 18- месячных рыбок данио. Скорость производства яиц у рыбок данио дикого типа в 1,941 выше, чем у ctns-/- 18-месячных рыбок данио (коэффициент скорости=1,941); 95-процентный ДИ (нижняя граница=1,165, верхняя граница=3,234); регрессионный анализ Пуассона; р=0.011. (B) Процент оплодотворенных яиц измеряли от общего количества яиц. Вероятность оплодотворенной икры у рыбок данио дикого типа выше в 3,504, чем у ctns-/- 18-месячных рыбок данио (отношение шансов=3,504); 95-процентный ДИ (нижняя граница=2,005, верхняя граница=6,124); Логистический регрессионный анализ; р < 0,001;="" н/д:="" не="">

2.3.4. Ctns-/- Рыбки данио демонстрируют снижение двигательной активности

Поскольку мышечная атрофия и слабость были диагностированы уцистинозпациентов, как правило, со второго десятилетия жизни [1,18], мы оценили двигательную активность в нашей модели рыбок данио. Мы обнаружили, что у рыбок данио ctns-/- обоих полов наблюдается пониженная двигательная активность по сравнению с рыбками данио дикого типа, что свидетельствует о нарушении мышечной функции (рис. 9). Однако гистологический анализ ткани скелетных мышц не выявил явных аномалий у рыбок данио ctns-/-.