Секретируемый нейтрофильный липокалин, связанный с желатиназой, демонстрирует более сильную способность ингибировать увеличение кисты клеток ADPKD по сравнению с несекретируемой формой Ⅱ

3. Результаты

3.1. Сравнение экспрессии NGAL и пролиферации клеток между клетками M-1 дикого типа и клетками 2L3 ADPKD

Клеточная линия 2L3 была создана путем трансдукции вирусом SV40 первичных эпителиальных клеток почки от мышей Pkd1L3/L3 [17]. В качестве контроля использовали клетки M-1 (линия почечных эпителиальных клеток мыши дикого типа), приобретенные у BCRC (Синьчжу, Тайвань). ПЦР-генотипирование транскриптов Pkd1 клеток 2L3 и M-1 проводилось для проверки генотипов с использованием праймеров до и после первого сайта loxP в интроне 30 целевого аллеля (рис. 1А). В качестве контроля генотипирования использовали ткани мышей Pkd1+/+, Pkd1L3/+ и Pkd1L3/L3. Продукты ПЦР из клеток M-1 показали одну полосу Pkd{{25}/+ дикого типа (WT) (473 п.н.), тогда как продукты ПЦР из клеток 2L3 показали одну полосу Pkd1L3/L3 (507 п.н.). из-за дополнительного сегмента loxP (34 п.н.) (рис. 1Б).

Чтобы охарактеризовать, произошли ли клетки M-1 и 2L3 изпочечные канальцы аналогичного происхождениямы сначала сравнили морфологию двух клеточных линий; Клетки M-1 и клетки 2L3 имели очень схожую морфологию (рис. 1C). Кроме того, для проверки их происхождения было проведено окрашивание лектинов лектином Lotus Tetragonolobus (LTL, маркер дифференцированных проксимальных канальцев, меченный флуоресцеином) и агглютинином Dolichos biflorus (DBA, маркер дифференцированных дистальных канальцев и собирательных трубочек, меченный родамином). из почечных канальцев (рис. 1D). Результаты окрашивания показали, что клетки M-1 и 2L3 были как LTL- (в основном колокализованы с DAPI), так и DBA-положительными (локализованы в цитоплазме) (рис. 1D). Этот результат позволил предположить, что клетки M-1 и 2L3 произошли отпочечные канальцысхожего происхождения и могут иметь схожие характеристики. Результаты ПЦР в реальном времени показали, что клетки 2L3 имели сильно сниженные уровни экспрессии мРНК Pkd1 по сравнению с клетками M-1 (рис. 1E), что согласовывалось с данными, полученными на мышах 2L3 с уровнями экспрессии белка Pkd1, составлявшими лишь 25% таковые у мышей дикого типа [17]. Было продемонстрировано, что мыши 2L3 имеют более высокие уровни NGAL и белка рецептора NGAL (NGAL-R) в почках, чем мыши дикого типа [31]. Результаты ПЦР в реальном времени показали, что уровень экспрессии мРНК Lcn2 был в 15,96-раз выше в клетках 2L3, чем в клетках M-1 (рис. 1F), что согласуется с данными, полученными для мышей 2L3 [31], тогда как не было значительной разницы в экспрессии мРНК Slc22a17 между двумя группами (рис. 1G). Результаты вестерн-блоттинга также показали, что клетки 2L3 имели более высокий уровень экспрессии NGAL, чем клетки M-1, при этом не было значительной разницы в уровне экспрессии NGAL-R между двумя группами (рис. 1H). Клетки и супернатанты клеток M-1 и 2L3 собирали после культивирования в течение 48 часов для количественного определения NGAL в клеточных лизатах и ​​супернатантах (представляющих секретируемый NGAL) с помощью ELISA. В соответствии с результатами вестерн-блоттинга, ELISA показал, что 2L3 имел значительно более высокий внутриклеточный NGAL и секрецию NGAL в супернатанте, чем M-1 (рис. 1I).

Было продемонстрировано, что мыши 2L3 демонстрируют более высокую пролиферацию клеток, чем мыши дикого типа [17]. Были проведены анализы включения MTT и BrdU, чтобы выяснить, продемонстрировала ли клеточная линия 2L3 лучшую жизнеспособность и пролиферацию, чем клетки дикого типа (рис. 2A-C). Репрезентативные изображения показали большее слияние клеток 2L3, чем клеток M-1 после культивирования в течение 48 часов с теми же начальными номерами посева (рис. 2А). Анализы МТТ показали, что клетки 2L3 имели значительно лучшую жизнеспособность, чем клетки M-1, культивированные в течение 24 и 48 часов (рис. 2B). Чтобы сравнить способность к пролиферации клеток M-1 и 2L3, клетки культивировали в течение 24 часов после анализа включения BrdU, который показал, что клетки 2L3 имели значительно лучшую пролиферацию, чем клетки M-1 (рис. 2C). .

НОВЫЕ ТРАВЫ ОТ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЧЕК

3.2. Влияние добавления mNGAL на жизнеспособность и пролиферацию клеток 2L3

Было показано, что введение экзогенного NGAL уменьшает рост кисты in vitro [25]. Наше предыдущее исследование показало, что сверхэкспрессия NGAL на мышиной модели ADPKD (мыши Pkd1L3/L3; NGALTg/Tg) снижает прогрессирование кисты, что сопровождается изменениями в ряде молекулярных путей, участвующих впролиферация клеток, апоптоз, ифиброз[31]. Поэтому мы исследовали влияние рекомбинантного mNGAL на жизнеспособность клеток 2L3 с помощью анализа МТТ (рис. 3). Чистоту рекомбинантного mNGAL (без сигнального пептида), выделенного из E. coli, сначала определяли с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим, что выявило одну полосу 20-kD и очень легкую полосу димера при высоких концентрациях ( Рисунок 3А). Кроме того, стабильность mNGAL в среде для культивирования клеток анализировали с помощью вестерн-блоттинга, который продемонстрировал стабильность mNGAL в среде в течение как минимум 48 часов (рис. 3B). Мы заметили, что mNGAL значительно снизил жизнеспособность клеток 2L3 по сравнению с контрольной группой после лечения в течение 8 часов (рис. 3C). В качестве положительного контроля в этом эксперименте использовался рапамицин, который признан ингибитором mTOR и, как известно, ингибирует пролиферацию эпителиальных клеток и рост кист на мышиной модели PKD [32]. Кроме того, анализ включения BrdU также показал, что обработка mNGAL в течение 24 часов значительно ингибировала пролиферацию клеток 2L3 (рис. 3D). Пролиферация клеток является ключевой особенностью ADPKD, и обнаружение того, что пролиферация клеток 2L3 может быть уменьшена с помощью mNGAL, позволяет предположить, что mNGAL может дополнительно ингибировать образование кист в клетках 2L3.

3.3. Сигнальные пути, на которые влияет добавление mNGAL к клеткам 2L3

Было показано, что сочетание NGAL и NGAL-R связывает внутриклеточное железо и дополнительно индуцирует апоптоз [29]. Кроме того, исследования показали, что NGAL может индуцировать апоптоз на модели ADPKD in vitro и in vivo [25,31]. Чтобы выяснить, может ли mNGAL индуцировать апоптоз клеток 2L3, мы проанализировали апоптоз клеток 2L3 с помощью проточной цитометрии. Основываясь на данных о том, что mNGAL ингибирует пролиферацию клеток 2L3 после обработки mNGAL в течение 8 часов (рис. 3D), мы проанализировали влияние mNGAL на клетки 2L3 как в более ранние (4 часа), так и в более поздние (12 часов) моменты времени.

Для анализа проточной цитометрии требовалось гораздо большее количество клеток и более короткая продолжительность культивирования, чем для ранее проведенных анализов МТТ; поэтому клетки 2L3 высевали на планшеты с лунками 6- и к клеткам применяли более высокую концентрацию mNGAL (600–1200 мкг/мл). Результаты показали, что 1200 мкг/мл mNGAL значительно ингибировали жизнеспособность клеток после 4 и 12 часов обработки, тогда как 600 мкг/мл mNGAL ингибировали жизнеспособность клеток только после 4 часов обработки (рис. 3E). Анализы апоптоза проводили с помощью проточной цитометрии для обнаружения клеток, окрашенных аннексином V-FITC и PI. Аннексин V обладает высоким сродством к фосфатидилсерину (ФС) и используется для идентификации апоптотических клеток с экспонированным ФС [33]. По результатам окрашивания клетки можно разделить на нормальные (AV-/PI-), ранний апоптоз (AV+/PI-), поздний апоптоз (AV+/PI+) и некротические (AV-/PI+). квадрантальные диаграммы (рис. 3F). Клетки на ранней стадии апоптоза сохраняют неповрежденные мембраны, в отличие от клеток на поздней стадии апоптоза с разрушенными мембранами [34]. Результаты показали, что скорость апоптоза клеток 2L3 (включая ранний AV+/PI- и поздний AV+/PI+ апоптоз) была значительно увеличена по сравнению с таковой в контрольной группе после 12 часов лечения mNGAL (1200 мкг/мл; рис. 3F, G). ).

Рисунок 1. Сравнение экспрессии NGAL между клетками M-1 дикого типа и 2L3 ADPKD. (А) Структура аллелей дикого типа и L3 гена Pkd1. ПЦР-генотипирование проводили с использованием праймеров до и после первого loxP в интроне 30 Pkd1. Закрашенные треугольники: loxP; ген устойчивости к неомицину, управляемый промотором mc1 (mc1-neo), фланкированный двумя сайтами loxP, был встроен в интрон 34 Pkd1. (B) ПЦР-генотипирование транскриптов Pkd1 клеток M-1 (473 п.о.) и клетки 2L3 (507 п.н.). Транскрипты Pkd1 мышей дикого типа (+/+), гетерозиготных (L3/+) и гомозиготных (L3/L3) мышей использовали в качестве контроля. RT-qPCR показала, что 2L3 имел значительно более низкий Pkd1 (C) M-1, а клетки 2L3 имели аналогичную морфологию. Масштабная линейка: 100 мкм. (D) Клетки M-1 и 2L3 были окрашены лектином Lotus Tetragonolobus (LTL, помечены флюоресцеином, зеленый) и агглютинином Dolichos biflorus (DBA, помечены мином Рода, красный) и DAPI (синий) и наблюдались с помощью конфокальный микроскоп. Масштабная линейка: 50 мкм. RT-qPCR показала, что 2L3 имел значительно более низкие уровни экспрессии Pkd1 (E) и более высокие Lcn2 (NGAL) (F), чем клетки дикого типа M-1. (G) Нет существенной разницы в уровнях экспрессии Slc22a17 (NGAL-R) между клетками M-1 и 2L3. RQ: относительное количественное определение=2 -ΔΔCt; Gapdh использовался в качестве внутреннего контроля каждого образца. Значения были нормализованы к M-1. (H) Результаты вестерн-блоттинга показали, что 2L3