Секретируемый нейтрофильный липокалин, связанный с желатиназой, демонстрирует более сильную способность ингибировать увеличение кисты клеток ADPKD по сравнению с несекретируемой формой Ⅲ

3.4. Влияние mNGAL на образование кист клеток 2L3 в 3D-культуре

Пролиферация клетоканомально увеличивается у мышей 2L3 и приводит к образованию и увеличению кист [17]. На основании предыдущих результатов, что mNGAL ингибируетПролиферация клеток 2L3 в 2D-культуре(Рисунок 3), мы предположили, что mNGAL может дополнительно ингибировать образование кист в клетках 2L3. Чтобы выяснить, может ли mNGAL ингибировать образование кист в клетках 2L3, мы создали трехмерную культуральную платформу, которая обеспечила подходящую среду с Matrigel для образования кист (рис. 6). Клетки высевали в планшеты с 96-лунками (1000 клеток/лунку) поверх предварительно сформированного матригеля на ночь. После того, как клетки были прикреплены к гелю, к клеткам добавляли еще матригеля, чтобы сформировать сэндвич-паттерн (рис. 6А). Клетки поддерживали в 3D-культуре при 37 ◦C и 5% CO2 в течение не менее 5 дней для образования цист. Кисты в 3D-культуре увеличивались в размерах с увеличением времени культивирования (рис. 6B). Чтобы подтвердить, что сферические конструкции, наблюдаемые в 3D-культуре, представляют собой кисты с просветом, мы фиксировали и окрашивали их с помощью DAPI и антител к E-кадгерину и актину для идентификации клеточных ядер, межклеточной адгезии и апикальной мембраны соответственно. Различные оптические z-срезы кисты 2L3 в 3D-культуре от верхнего (слой 1) до среднего (слой 5) наблюдались с помощью конфокальной микроскопии, и просвет был подтвержден внутри сферической кисты (рис. 6C, дополнительный материал).

Мышиный NGAL (NP_032517.1) и человеческий NGAL (NP_005555.2) представляют собой белки 200-аа и 198-аа соответственно, и оба имеют {{6 }}aa сигнальный пептид для секреции, расположенный на N-конце белка NGAL (рис. 7A). Сравнение последовательностей показало 62% идентичности и 80% положительности между NGAL мыши и NGAL человека. Было показано, что мышиный NGAL имеет два сайта N-связанного гликозилирования на аспарагине (Asn, N) по а.к. 81 и 85, тогда как человеческий NGAL имеет один сайт по а.к. 85 (рис. 7А), что указывает на разницу между ними в посттрансляционной модификации.

Рисунок 7. Влияние трансфекции pN + LS и pN - LS на экспрессию NGAL и пролиферацию клеток в клетках 2L3. (A) Выравнивание белков NGAL мыши (NP_032517.1) и человека NGAL (NP_005555.2). Сигнальные пептиды 20-аа показаны синим цветом. Два зарегистрированных сайта N-связанного гликозилирования на Asn (N) по адресу 81 и 85 мышиного NGAL и один по адресу 85 NGAL человека отмечены звездочкой (*). Идентификаторы: сплошная линия; позитивы: парные точки. Приведенная выше информация о последовательности взята из программы BLASTP на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI). (B) Постройте диаграмму mNGAL с (pN + LS) или без (pN - LS) секретируемой лидерной последовательностью Igκ на векторе pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd. (C) Результат гель-электрофореза подтвердил конструкцию pN + LS (647 п.н.) и pN - LS (587 п.н.), расщепленную NheI и NotI. (D) Хронология заражения и отбор клеток 2L3 с pN + LSи pN − LS соответственно. Клетки 2L3 инфицировали pN + LS или pN - LS в 6а-луночном планшете в первый день. Селекцию с бластицидином начинали на второй день, и среду меняли каждые 3 дня. После отбора в течение недели клетки собирали для анализа с помощью RT-QPCR, вестерн-блоттинга и ELISA. (E) Обнаружение экспрессии репортерного eGFP для изучения эффективности трансфекции pN + LS и pN - LS на второй день. Около 10% клеток были инфицированы конструкцией GFP. Масштабная линейка: 50 мкм. Результаты RT-qPCR показали, что pN + LS и pN - LS имели более высокую экспрессию Lcn2 (представляла общий уровень NGAL) (F) и c-myc (представляла уровень трансфицированного экзогенного NGAL) (G) по сравнению с контрольной группой. (H) Не было значительной разницы в Slc22a17 (NGAL-R) между группами. RQ: относительная количественная оценка=2-∆∆Ct; Gapdh использовался в качестве внутреннего контроля каждого образца. Значения были нормализованы к контрольной группе. (I) Результаты вестерн-блоттинга показали, что pN + LS и pN - LS имели более высокую экспрессию NGAL, чем контрольная группа. (J) ИФА показало, что клетки pN + LS и pN - LSсекретировали значительно больше NGAL, чем контрольная группа, в то время как количество секретируемого NGAL клетками pN - LS было значительно меньше, чем клетками pN + LS. (K) Включение BrdU показало, что клетки pN + LS и pN - LS имели более низкий коэффициент пролиферации клеток, чем контрольная группа, тогда как клетки pN - LS имели более высокий, чем клетки pN + LS. Для определения значимости между двумя группами был проведен t-критерий Стьюдента (n=3 в RT-qPCR и ELISA, n=4 в вестерн-блоттинге и включении BrdU). *p < 0.05; ** p < {{10}}.01; *** p < 0,001 против 2L3 в каждой группе; # р < 0,05; ### p < 0,001 по сравнению с группой pN + LS; нс: существенной разницы нет.

В этом исследовании мы использовали лидерную последовательность мышиной Igκ-цепи (LS) [44], а не исходный сигнальный пептид mNGAL, чтобы обеспечить повышенную секрецию экзогенного белка mNGAL. Для сверхэкспрессии секретируемого или несекретируемого NGAL использовали NGAL с LS или без него в векторах pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd, а именно pN + LS и pN - LS, которые показаны на рисунке 7B. Два промотора, pCMV и hPGK, использовались для управления независимой экспрессией двух белков: NGAL-c-myc-His6 и eGFP. Чтобы гарантировать вставку конструкции, NheI и NotI использовали для расщепления двух плазмид, и результаты гель-электрофореза показали полосу 647-bp от pN + LS и полосу 587-bp от pN - LS. (из-за отсутствия лидерной последовательности 60-bp) (рис. 7C).

Для заражения pN + LS и pN-SP в клетки 2L3 к клеткам добавляли полибрен и лентивирус и инкубировали при 37 ◦C в течение 24 часов с последующей селекцией бластицидином (рис. 7D). Обнаружение экспрессии GFP проводили с помощью флуоресцентной микроскопии после заражения (рис. 7E). Инфицированные клетки собирали через неделю после отбора бластицидина для RT-qPCR, вестерн-блоттинга и ELISA для анализа уровня экспрессии NGAL (рис. 7F-J). Результаты RT-qPCR показали, что инфицирование клеток 2L3 pN + LS и pN - LS приводило к увеличению экспрессии Lcn2 (рис. 7F) и Lcn2-c-myc (рис. 7G), что представляло собой уровни общего количества и экзогенный NGAL соответственно, при этом не было различий в уровнях экспрессии Slc22a17 (NGAL-R) (рис. 7H). Результаты вестерн-блоттинга показали, что клетки pN + LS и pN - LS имели более высокие уровни внутриклеточной экспрессии NGAL, чем контрольные клетки 2L3 (рис. 7I). Результаты ELISA для клеточного супернатанта показали, что клетки pN + LS и pN - LS имели значительно более высокие уровни секретируемого NGAL, чем контрольная группа клеток 2L3 (рис. 7J). Кроме того, количество NGAL, секретируемое клетками pN - LS, было значительно меньше, чем количество, секретируемое клетками pN + LS (рис. 7J), в то время как обе группы имели схожие уровни экспрессии NGAL (рис. 7I). Это открытие подтвердило наше предсказание о том, что сверхэкспрессия NGAL без сигнального пептида (pN-LS) ограничивает секрецию NGAL, несмотря на наличие высокого уровня внутриклеточного NGAL. Чтобы выяснить, ингибирует ли пролиферацию клеток секретируемый NGAL, а не несекретируемый NGAL, был проведен анализ включения BrdU, который показал, что клетки pN + LS и pN - LS имели значительно более низкую пролиферацию, чем контрольная группа (рис. 7K). Кроме того, клетки pN-LS имели значительно более высокую пролиферацию, чем клетки pN+LS (рис. 7K). Эти результаты позволили предположить, что секреция NGAL клетками 2L3 необходима для ингибирования пролиферации клеток.

3.6. Эффекты сверхэкспрессии психики, приводящие к сигнальным путям в клетках 2L3

Основываясь на наших предыдущих результатах, показывающих, что mNGAL может ингибировать пути ERK и AKT в клетках 2L3 (рис. 4) и дополнительно снижать пролиферацию клеток (рис. 3) и увеличение кист (рис. 6), мы использовали вестерн-блоттинг, чтобы проанализировать, являются ли ERK и AKT пути были затронуты в клетках pN + LS и pN - LS (рис. 8). Результаты вестерн-блоттинга показали, что группы pN + LS и pN - LS имели значительно более низкое соотношение p-ERK (T202/Y204)/ERK, чем контрольная группа, а группа pN - LS имела более высокое соотношение p-ERK. (T202/Y204)/ERK, чем группа pN + LS (рис. 8А). Соотношение p-AKT (S473)/AKT было ниже в группе pN + LS, чем в контрольной группе, тогда как клетки pN - LS существенно не отличались от таковых в контрольной группе и группах pN + LS (рис. 8B). Соотношение p-CREB (S133)/CREB было значительно выше в группе pN-LS, чем в группе pN+LS, при этом ни pN+LS, ни pN-LS не показали существенных отличий от контрольной группы (рис. 8C). Эти результаты показали, что pN + LS и pN - LS имели статистически значимые различия в соотношении p-ERK/ERK (рис. 8А), в то время как группа pN + LS не показала лучшего эффекта в AKT (рис. 8B) и CREB (рис. 8B). Рисунок 8C) Активация.

В соответствии с предыдущими результатами, согласно которым применение mNGAL может вызывать апоптоз (рис. 3) и аутофагию в клетках 2L3 (рис. 5), а также уменьшать пролиферацию клеток (рис. 3) и увеличение кист (рис. 6), мы использовали вестерн-блоттинг для изучения влияния на апоптоз. и аутофагия в клетках pN + LS и pN - LS (рис. 9). Результаты вестерн-блоттинга показали, что клетки pN + LS имели значительно более высокое соотношение расщепленной/прокаспазы -3 (рис. 9А) и расщепленной/про-PARP (рис. 9В), чем контрольная группа; Клетки pN - LS не показали существенной разницы в соотношении расщепленной/прокаспазы -3 (рис. 9А) и расщепленной/про-PARP (рис. 9В) по сравнению с контрольной группой, а также в соотношении расщепленной /прокаспаза-3 была значительно ниже, чем в группе pN + LS (рис. 9B). Эти результаты продемонстрировали, что сверхэкспрессия секретируемого NGAL, а не несекретируемого NGAL, индуцирует апоптоз в клетках 2L3.

Более высокое соотношение LC3B II/LC3B I (рис. 9C) и более низкое соотношение p62/GAPDH (рис. 9D) было выявлено в клетках pN + LS по сравнению с контрольной группой; Клетки pN-LS не имели существенной разницы в соотношении LC3B II/LC3B I (рис. 9C) и p62/GAPDH (рис. 9D) по сравнению с контрольной группой, а соотношение LC3B II/LC3B I было значительно ниже, чем в контрольной группе. группа pN + LS (рис. 9C). Этот результат показал, что сверхэкспрессия секретируемого NGAL, а не несекретируемого NGAL, вызывает аутофагию в клетках 2L3.

3.7. Влияние сверхэкспрессии mNGAL на образование кист клеток 2L3 в 3D-культуре

Основываясь на предыдущих результатах, согласно которым mNGAL ингибировал пролиферацию клеток 2L3 и увеличение кист в 2D- и 3D-культуре соответственно (рис. 3 и 6), мы предположили, что сверхэкспрессия секретируемого NGAL может дополнительно ингибировать увеличение кист клеток 2L3 посредством ингибирования пролиферации клеток (рис. 3 и 6). Рисунок 7К).

Чтобы исследовать влияние сверхэкспрессии NGAL в клетках 2L3 на образование кист, контрольные клетки 2L3, клетки pN + LS и pN - LS обрабатывали форсколином в дни 1–3, чтобы вызвать образование кист. Диаметры, площадь и количество кист измеряли ежедневно после индукции форсколином (рис. 10А). Кисты контрольных клеток 2L3, клеток pN + LS и pN - LS в 3D-культуре росли в зависимости от дней культивирования (рис. 10B) и демонстрировали очевидные различия в размере кист с 4 по 8 день. значительно меньшие диаметры кист (рис. 10C) и площади (рис. 10D), чем в контрольной группе с 4 по 8 день, тогда как в группе pN - LS диаметр кист был значительно меньший, чем в контрольной группе на 6 и 8 дни (рис. 10C). Существенной разницы в площади кисты между контрольной группой и группой pN-LS не было. Кроме того, на 8-й день группа pN-LS имела значительно больший диаметр и площадь кист, чем группа pN+LS (рис. 10C, D). Хотя не было значительной разницы в скорости увеличения числа кист среди контрольных клеток, клеток pN + LS и pN - LS (рис. 10E), в группах pN + LS и pN - LS наблюдался значительно более низкий процент крупных (диаметр > 100 мкм) кисты, чем в контрольной группе (рис. 10F) с 4 по 8 день. Эти результаты показали, что pN + LS и pN - LS ингибировали увеличение кисты, в то время как ингибирующий эффект pN - LS был слабее, чем у pN + LS. . Это открытие показало, что сверхэкспрессия секретируемого mNGAL обладает превосходной способностью ингибировать увеличение кисты клеток 2L3 в 3D-культуре, чем несекретируемый mNGAL.

- Был проведен тест для определения значимости между группами (n=3). * p < 0.05; *** p < 0,001 по сравнению с контрольной группой; # p < 0,05 по сравнению с группой pN + LS

каспаза{{0}} (А) и расщепленный/про-PARP (В), чем в контрольной группе, что представляет собой индукцию апоптоза секретируемым mNGAL. Клетки pN - LS не имели существенной разницы в соотношении расщепленного/прокаспазы-3 и расщепленного/про-PARP по сравнению с контрольной группой. Клетки pN + LS имели более высокое соотношение LC3B II/LC3B I (C) и более низкое соотношение p62 (D) по сравнению с контрольной группой. Клетки pN-LS не имели существенной разницы в соотношении LC3B II/LC3B I и p62 по сравнению с контрольной группой. Тубулин, Винкулин и ГАФД использовали в качестве внутреннего контроля каждого образца. Значения были нормализованы к контрольной группе. Для определения значимости между группами (n=3) применяли t-критерий Стьюдента. * р < 0.05; ** р < 0.01; *** p < 0,001 по сравнению с контрольной группой; # р < 0,05; ## p < 0,01 по сравнению с группой pN + LS.

Рисунок 9. Влияние сверхэкспрессии белка mNGAL на апоптоз и аутофагию в клетках 2L3. Результаты вестерн-блоттинга показали, что клетки pN + LS имели значительно более высокое соотношение расщепленной/прокаспазы-3(А) и расщепленной/про-PARP (В), чем в контрольной группе, что представляло собой индукцию апоптоза. секретируемым mNGAL. Клетки pN-LS не имели существенной разницы в соотношении расщепленного/прокаспазы-3 и расщепленного/про-PARP по сравнению с контрольной группой. Клетки pN + LS имели более высокое соотношение LC3BII/LC3B I (C) и более низкое соотношение p62 (D) по сравнению с контрольной группой. Клетки pN-LS не имели существенной разницы в соотношении LC3B II/LC3B I и p62 по сравнению с контрольной группой. Тубулин, Винкулин и ГАФД использовали в качестве внутреннего контроля каждого образца. Значения были нормализованы к контрольной группе. Для определения значимости между группами был проведен t-критерий Стьюдента.

(п {{0}}). * p < 0.05; ** р < 0.01; *** p < 0,001 по сравнению с контрольной группой; # р < 0,05; ## p < 0,01 по сравнению с группой pN + LS