Как растительное вещество Актеозид ингибирует опухолевые клетки?

Контакт: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

АБСТРАКТНЫЙ

Натуральные продукты характеризуются чрезвычайным структурным разнообразием и, таким образом, они предлагают уникальный источник для идентификации новых противоопухолевых агентов. Здесь мы сообщаем, что растительное веществоактеозидвыделение передовыми фитохимическими методами из листьев Lippia citriodora показало повышенную цитотоксичность в отношении метастатических опухолевых клеток; действовал в синергии с различными цитотоксическими агентами и сенсибилизированными хеморезистентными раковыми клетками.Актеозидот herba cistanchceне был токсичен в физиологических клеточных контекстах, при этом увеличивал окислительную нагрузку, влиял на активность протеостатических модулей и подавлял матриксные металлопротеиназы в клеточных линиях опухоли. Внутрибрюшинное или пероральное (через питьевую воду) введениецистанчеактеозид в модели меланомы мыши повышается регуляция антиоксидантных реакций в опухолях; тем не менее, только внутрибрюшинная доставка подавляла рост опухоли и вызывала противоопухолевые иммунные реакции. Масс-спектрометрический идентификационный/количественный анализ показал, что внутрибрюшинная доставкаактеозидв результате значительно более высокая, по сравнению с пероральным приемом, концентрация соединения в плазме и опухолях обработанных мышей, что позволяет предположить, что именно in vivo противоопухолевый эффект зависит от пути введения и достигнутой концентрации в опухоли. Наконец, исследования молекулярного моделирования и анализы ферментативной активности показали, что актеозид ингибирует протеинкиназу С. В конечном счете, актеозид обещает стать химическим каркасом для разработки новых противоопухолевых агентов.

Ключевые слова:Актеозид, Рак, Природные соединения, Окислительный стресс, Протеостаз, Иммуномодуляция

Цистанче противоопухолевое, нажмите здесь, чтобы получить образец

1. Введение

Канцерогенез характеризуется дерегуляцией нескольких клеточных сигнальных путей и связан с повышенным клеточным окислительным, репликативным, метаболическим, генотоксическим и протеотоксическим стрессом [1]. Чтобы адаптироваться и преодолеть эти фенотипы стресса, злокачественные клетки регулируют (помимо онкогенов) несколько неонкогенных путей, направленных либо на подавление, либо (по крайней мере) облегчение продолжающегося стресса. Среди различных неонкогенных путей, которые, как было обнаружено, часто повышаются во время опухолевого генеза, являются модули сети протеостаза (PN) вместе с клеточными антиоксидантными реакциями [2,3].

Ключевыми компонентами PN являются два основных механизма деградации, а именно аутофагиально-лизосомный путь (ALP) и убиквитин-протеасомный путь (UPP), а также сеть клеточных молекулярных шаперонов. ALP в основном участвует в деградации белковых агрегатов и поврежденных органелл [4], в то время как UPP разрушает нормальные короткоживущие белки и невосстанавливаемые неправильно свернутые или развернутые белки [5–8]. Протеасома 26Seukaryotic состоит из регуляторных частиц 19S (RP) и частицы 20 Score (CP); последний состоит из четырех сложенных гептамерных колец (два α типа, окружающие два β типа), которые образуют бочкообразную структуру. Активность химотрипсин-подобной (CT-L), трипсин-подобной (T-L) и каспазоподобной (C-L) протеасомной пептидазы расположена в протеасомных субъединицах β5, β2 и β1 соответственно [6]. Продемонстрированная клиническая эффективность ингибиторов протеасомы Бортезомиб (Velcade®; также называемый PS-341) и Карфифилзомиб против различных гематологических злокачественных новообразований [9] обеспечила «доказательство концепции» нацеливания на UPP в качестве перспективной стратегии лечения рака. Сложная сеть клеточных путей антиоксидантной защиты, которые часто регулируются во время канцерогенеза [3,10], включает антиоксидантные ферменты, а также несколько факторов транскрипции, мобилизующих цитопротекторные геномные реакции; к ним относятся вилочная коробка O (Foxo) и ядерный фактор, связанный с эритроидом 2 (Nrf-2). Nrf-2 занимает центральное место в защите клеток от окислительного и/или ксенобиотического повреждения, поскольку он стимулирует экспрессию антиоксидантных и фазовых II генов [11-13].

Мы и другие недавно предположили, что нацеливание на эти опухолевые зависимости (т.е. протеостатические модули и/или пути антиоксидантного ответа) или повышение клеточных уровней АФК в контексте трансформированного генотипа предлагают потенциальное терапевтическое окно для селективного уничтожения опухолевых клеток [3,14]; В поддержку сообщалось о селективном уничтожении раковых клеток небольшой молекулой, которая повышала уровень клеточного АФК [2]. Ожидается, что комбинаторные подходы, включая также активацию противоопухолевых иммунных реакций [15], вероятно, максимизируют терапевтическое окно, предлагаемое путем ингибирования ПН и антиоксидантных реакций и/или повышения уровня клеточного АФК.

Природные продукты (экстракты или чистые соединения) (NP) из различных источников (растения, морские организмы, микроорганизмы и т. д.) проверяются на их способность действовать как противоопухолевые агенты из-за их чрезвычайного структурного разнообразия и химической сложности, а также потому, что они действуют плейотропно модулируя несколько клеточных сигнальных путей [16]. Сообщается, что НП активируют противовоспалительные, противоопухолевые и/или антиметастатические реакции [16,17], а также уклоняются от множественной лекарственной устойчивости [18,19]. Среди них фенольные соединения (включая фенилетаноидные гликозиды) вызвали значительный интерес из-за их заявленной роли в профилактике и/или лечении различных заболеваний человека.

Актеозид, также называемый кусагином или вербаскозидом [20], представляет собой фенилетаноидный гликозид, выделенный из многих двудольных. Как сообщается, актеозид обладает некоторыми интересными биологическими активностями, включая антиоксидантные, противовоспалительные и регулирующие свойства клеточного апоптоза [21,22]. Тем не менее, его потенциальная противоопухолевая активность не была рассмотрена. Мы сообщаем здесь, что актеозид показал повышенную цитотоксичность против раковых клеток млекопитающих без видимых токсических эффектов в физиологических клеточных контекстах. Кроме того, актеозид подавлял рост опухоли меланомы в мышиной модели in vivo, активируя противоопухолевые иммунные реакции.

противоопухолевый экстракт цистанчи

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал и экстракция

Сушеные листья Lippia citriodora (Lamiaceae) (4,5 кг) были приобретены на местном рынке в Афинах, Греция. Листья измельчали и экстрагировали механическим перемешиванием в течение 12 ч метанолом (2 × 20 л). Метаноловый экстракт выпаривали до сухости и промывали смесью CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 л). Нерастворимый остаток отделяли и сушили, получая зелено-желтый порошок (450 г).

2.2. Очистка актеозида и анализ UPLC-HRMS

Часть (10 г) вышеупомянутого остатка подвергали противоточной хроматографии с использованием аппарата быстрой центробежной секционной хроматографии (FCPC) (Кроматон, Франция); смесь EtOAc/EtOH/H2O в соотношении 5/0,5/4,5 использовали в качестве двухфазной системы растворителей. Собранные фракции подвергали тонкослойной хроматографии; затем хроматограммы наблюдали под УФ-лампой (254 и 365 нм) и визуализировали путем распыления метанола сульфата ванилина с последующим нагревом в течение двух минут. В общей сложности 2,1 г актеозида (чистота ≥ 90%) были выделены вышеупомянутым процессом. Идентификацию актеозида проводили спектрами ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (МС), а его чистоту устанавливали методом АНАЛИЗА UPLC-MS и ЯМР; Дополнительные сведения см. в разделе Материалы и методы.

2.3. Клеточные линии

Эмбриональные фибробласты легких человека (клетки IMR90) вместе с B16. Ф1, В16. Клеточные линии мышей F10, YAC-1 и WEHI-164 были получены из Американской коллекции культур тканей (ATCC). Клеточные линии остеосаркомы человека U2 OS и Sa OS были любезно пожертвованы профессором В. Горгулисом (Школа медицины, Национальный и Каподистрийский университет Афин, Греция), в то время как клетки остеосаркомы KH OS и клеточные линии хеморезистантной остеосаркомы [23] были пожертвованы доктором Э. Гоносом (Национальный греческий исследовательский фонд, Греция). Клеточные линии рака мыши C5N и A5 принадлежат многоступенчатой модели канцерогенеза кожи мыши [24,25] и были пожертвованы профессором А. Балмейном (Комплексный онкологический центр, Калифорнийский университет, США). Условия культивирования используемых клеточных линий описаны в Suppl. Materials and Methods.

польза экстракта цистанчи: противораковая

2.4. Модель мыши меланомы

Самцы мышей C57BL/6 (25-30 г веса, возраст 6-8 недель) были получены из Института Греческого Пастера и содержались при контролируемой температуре (22 ° C) и фотопериоде (12 ч света: 12 ч темноты) со свободным доступом к воде и пище. Мышей подкожно прививали 105 B16. Клетки меланомы F1 (в 100 мкл PBS) и были случайным образом распределены по 3 группам (n = 5/группа). Когда опухоли стали пальпируемыми (день 11), мыши получали актеозид двумя путями; либо внутрибрюшинно (IP) (1 мг/мышь, разбавленная в 200 мкл PBS; в общей сложности 6 доз, вводимых через день), либо перорально питьевой водой (OR) (2,5 мг/мышь; в общей сложности 13 доз в течение 13 последовательных дней). Контрольным мышам вводили PBS. Рост опухоли регистрировали каждые 2 дня путем измерения большой и малой осей образовавшихся опухолей с помощью цифрового суппорта. Измерения трансформировали в объем опухоли по формуле: объем опухоли (см3) = большая ось × минорная ось2 × 0,5. На 28-й день животные были усыплены вывихом шейки матки, а селезенка была асептически удалена. Эксперимент был повторен три раза с аналогичными результатами.

Спленоциты были выделены из индивидуально гомогенизированных селезенок и немедленно проверены на их цитотоксичность по сравнению с B16. Клеточные мишени F1, YAC-1 и WEHI-164. Цитотоксичность оценивали на основе обнаружения воздействия CD107 на клеточную поверхность в результате дегрануляции эффекторных клеток. Спленоциты (105 клеток/лунка) культивировали совместно с мишенями в 96-луночных U нижних микропластинах при соотношении эффектор-мишень (E:T) 100:1, при 37 °C в 5% CO2. FITC-конъюгированные анти-CD107a и анти-CD107 b моноклональные антитела (25 мкл / мл) и моненсин (6 мкл / мл; все из BD Biosciences) были добавлены в каждую лунку. Клетки были собраны через 6 часов и проанализированы с использованием цитометра FACSCanto II flflow. Параллельно опухоли были иссечены и обработаны для последующих анализов, как описано в Suppl. Materials and Methods.

Эффекты экстракта цистанхи: противоопухолевые и раковые