Секвенирование одноклеточной РНК клеток мочи выявило выраженное клеточное разнообразие при ОПП, связанном с COVID-19 Ⅱ

Результаты

Мы выполнили scRNAseq на осадке мочи восьми госпитализированных пациентов сКОВИД-19, пять сАКИи трое без ОПП. Четыре дополнительных образца мочи изгоспитализированные пациенты без COVID-19и с ОПП также были собраны для сравнения потенциальных различий в ОПП в контексте COVID{{0}}. Средний уровень sCr у пациентов с ОПП, связанным с COVID-19, составлял 2,4 мг/дл по сравнению с 0,83 мг/дл у пациентов контрольной группы на момент сбора данных. Примечательно, что двое пациентов сCOVID-19-связанныйАКИимел ранеедиагноз ХБП, что было показаноухудшить последствия COVID-19(39,40). Сопутствующие заболевания и другие переменные незначительно различались между контрольной популяцией с ОПП и без ОПП (Таблица 1).

В соответствии с предыдущими отчетами (29), количество клеток было очень неоднородным у разных пациентов (дополнительный рисунок 1, A и B). Всего было секвенировано 65 234 клетки, и 30 076 клеток были сохранены для контроля качества. Комплексная аппроксимация единого многообразия и проекции всех 12 образцов пациентов выявили разнообразный набор почечных, уротелиальных и иммунных клеток (рис. 1, A, E и F). Нам удалось обнаружить большинство клеток почек, включая подоциты и клетки почек VCAM11, что продемонстрировало возможность неинвазивного исследования почек посредством анализа мочи. Существует явная гетерогенность в популяции уротелиальных клеток, которая выходит за рамки данного исследования, но требует дальнейшего изучения. Захваченные типы клеток варьировались в зависимости отГруппы ОПП и не-ОПП(Рисунок 1, B – D), а также между каждым пациентом (дополнительный рисунок 1C). Как и ожидалось, большее количество иммунных клеток было обнаружено в образцах ОПП, связанных с COVID-19.

ТРАДИЦИОННЫЕ КИТАЙСКИЕ ТРАВЫ КАК ПОЧЕЧНАЯ ДИЕТА

GSEA выявило усиление регулированияапоптотические гены, элементы ответа IFN и различные другие сигнальные пути как в контрольных образцах с ОПП, связанным с COVID-19, так и без ОПП, а также без ОПП (рис. 2C, дополнительный рисунок 2). Из-за высоких энергетических потребностей и содержания митохондрий проксимальные канальцы являются одной из структур, наиболее чувствительных к инсульту во время ОПП (41), а тяжесть повреждения связана с общими исходами (42). Анализ путей клеток проксимальных канальцев у пациентов с ОПП выявил обогащение путей, связанных с апоптозом, репарацией ДНК и клеточными ответами на активные формы кислорода и стресс, в отличие от пациентов без ОПП (рис. 2, А и Б). Аналогичная активация пути была обнаружена и в других клетках почечных канальцев. Пути, связанные с повреждением, активировались при ОПП, но обогащение активными формами кислорода, повреждение ДНК и пути апоптоза в проксимальных канальцах, петле Генле и собирательных трубочках были более очевидными при COVID-19-ассоциированном ОПП по сравнению с образцами ОПП, не связанными с COVID-19. Мы подозреваем, что существует множество перекрывающихся путей развития ОПП из-за сочетания механизмов повреждения, включая ишемию, воспаление или токсичность лекарств. Дополнительное обогащение путей, связанных с повреждением, при ОПП, связанном с COVID-19, может быть связано с другими воспалительными процессами, возникающими в процессе заболевания COVID-19. Это может объяснить метаболические различия, наблюдаемые в моче пациентов с ОПП, связанным с COVID-19 (43).

Рецептор входа вируса ACE2 в изобилии присутствует в различных тканях, включая почки. Транскрипты ACE2 и TMPRSS2 были обнаружены на различных эпителиальных клетках почек и особенно распространены в уротелиальных клетках (рис. 3А). Поскольку SARS-CoV-2 представляет собой РНК-вирус с поли-А-хвостом (44), мы создали индивидуальный геном для выравнивания, в котором геном SARS-CoV-2 был добавлен в качестве экзона к человеческому hg38. геном. Интересно, что, хотя мы не обнаружили никаких вирусных транскриптов SARS-CoV-2 в клетках почек у пациентов с ОПП, мы обнаружили следовые транскрипты в уротелиальных клетках пациента 7 (у которого был COVID-19 без ОПП). ), что позволяет предположить прямую инфекцию этих клеток мочевого пузыря (рис. 3А). Индивидуальный анализ пациента 7 выявил небольшое количество клеток почечного происхождения. Большинство выделенных клеток представляли собой иммунные и уротелиальные клетки. Вирусная РНК была обнаружена исключительно в уротелиальных клетках с высокой экспрессией ACE2 (рис. 3B, дополнительный рисунок 3). Анализ мочи этого пациента показал лейкоцитурию без признаков бактериальной инфекции (отрицательные результаты по лейкоцитарной эстеразе и нитриту) (рис. 3C). Анализ путей уротелиальных клеток выявил обогащение путей, участвующих в передаче сигналов IFN 1 типа, острой воспалительной реакции и реакциях лейкоцитов (рис. 3D, дополнительный рисунок 2B), что согласуется с вирусной инфекцией этих клеток.

Рисунок 2.|Обогащение путей, связанных с повреждением, в клетках пациентов с ОПП. Анализ обогащения набора генов каждого кластера клеток из интегрированного UMAP на наличие путей, включая (A) характерные пути активных форм кислорода, (B) характерные пути апоптоза и (C) характерные пути восстановления ДНК у пациентов с COVID-19 ОПП (слева), COVID-19 без контроля ОПП (центральные панели) и пациенты с ОПП, не связанным с COVID-19 (правые панели). Кластеры идентифицируются следующим образом: 1 — уротелиальный; 2 — уротелиальный; 3 — уротелиальный; 4 — макрофаг; 5 — MHC класс 2 – положительные нейтрофилы; 6 — петля Генле; 7 — нейтрофил; 8 — собирательная трубочка; 9 — уротелий; 10 — зонтик; 11 — нейтрофил; 12 — собирательная трубочка; 13 — резидентный макрофаг почки; 14 — нейтрофил; 15 — уротелий; 16, езда на велосипеде; 17 — проксимальный каналец; 18 — проксимальный каналец; 19 — гладкомышечная клетка; 20 — вставочная клетка; 21 — уротелий; 22 — Т-клетка; 23 — подоцит; 24 — эритроцит; 25 — макрофаг; 26 — В-клетка; 27 — макрофаг; 28, эритроцит.Доказательства прямого заражения отсутствуют. МеханикаВход будет осуществляться с базальной стороны уротелия.клетки, если из крови, или люминальную сторону, если из мочи.

Предыдущее исследование показало, что ACE2 экспрессируется как на базальной, так и на просветной поверхности мочевого пузыря (23). Обнаружение вирусного цистита с помощью scRNAseq соответствует клиническим характеристикам пациента 7 (рис. 3C). Хотя вирус был обнаружен лишь в небольшом количестве клеток, мы подозреваем, что большая часть инфицированных вирусом клеток могла быть отфильтрована во время этапов контроля качества обработки мочи и анализа данных, на которых мы удаляли мертвые и умирающие клетки.