Абстрактный
Фоновое ОПП является частым осложнением инфекции SARS-CoV-2 и способствует тяжести и смертности от COVID-19. Здесь мы проверили гипотезу о том, чтоизменения почекОПП, вызванное COVID-19, можно обнаружить в клетках, собранных из мочи. Методы Мы провели секвенирование одноклеточной РНК (scRNAseq) на клетках, выделенных из мочи восьми госпитализированных пациентов с COVID-19 с (n55) или без ОПП (n53), а также четырех пациентов с ОПП, не связанным с COVID-19. (n54) для оценки различий в клеточном составе и экспрессии генов во время ОПП. Результаты. Анализ 30 076 клеток выявил разнообразный набор типов клеток, большинство из которых былипочка, уротелиальные и иммунные клетки. Анализ путей канальцевых клеток пациентов с ОПП показал обогащение транскриптов, связанных с путями, связанными с повреждением, по сравнению с клетками без ОПП. Экспрессия ACE2 и TMPRSS2 была самой высокой в уротелиальных клетках среди восстановленных типов клеток. Примечательно, что у одного пациента мы обнаружили РНК вируса SARS-CoV-2 в уротелиальных клетках. Эти же клетки были обогащены транскриптами, связанными с противовирусными и противовоспалительными путями. Выводы. Мы успешно выполнили scRNAseq на осадке мочи госпитализированных пациентов с COVID-19 для неинвазивного изучения клеточных изменений, связанных с ОПП, и создали набор данных, который включает как поврежденные, так и неповрежденные клетки почек. Кроме того, мы предоставляем предварительные доказательства прямого заражения клеток мочевого пузыря SARS-CoV-2. Мочевой осадок содержит огромное количество информации и является полезным ресурсом для изучения патофизиологии и клеточных изменений, происходящих в организме.заболевания почек.
ОРГАНИЧЕСКИЕ ПОЛЕЗНЫЕ ПРОДУКТЫ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ ПОЧЕК
Введение
Тяжелый острый респираторный синдром, вызванный коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), вызывает патологию во многих системах, включая почки, а ОПП связано со значительной заболеваемостью и смертностью от коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) (1 –5). Многочисленные исследования продемонстрировали высокие показатели ОПП среди госпитализированных пациентов с COVID-19 (6), при этом в некоторых исследованиях сообщалось, что ОПП развивается у 50% инфицированных лиц (7–9). Первичный рецептор SARS-CoV-2 ACE2 экспрессируется на эпителиальных клетках всей мочевой системы, включая клетки проксимальных канальцев и уротелиальные клетки (10–13), хотя неясно, возникает ли ОПП у пациентов с COVID.-19 возникает из-за прямой вирусной инфекции проксимальных канальцев или является результатом системного ответа на SARS-CoV-2 (14–22). Точно так же неясно, может ли SARS-CoV-2 вызывать вирусный цистит путем прямого заражения уротелиальных клеток, хотя такая возможность предполагалась (23–26). Несмотря на высокую распространенность ОПП, связанного с COVID-19, основные клеточные изменения, возникающие при ОПП, остаются плохо изученными.
ОПП, связанное с COVID-19, остается в значительной степени недостаточно изученным, поскольку доступ к ткани почки требует биопсии или посмертного анализа (27). Недавние исследования выявили в моче разнообразный набор клеток почек, мочевого пузыря и иммунных клеток (28–30). Таким образом, моча может дать ценную информацию для неинвазивного изучения изменений почек во время ОПП, связанного с COVID-19. Здесь мы провели секвенирование одноклеточной РНК (RNA-Seq), чтобы охарактеризовать клеточное разнообразие в моче госпитализированных пациентов с COVID-19 с ОПП и без него. Мы проверили гипотезу о том, что изменения в почках при ОПП, связанном с COVID-19, можно обнаружить в клетках, собранных из мочи. Мы также собрали образцы у пациентов без COVID-19 и с ОПП (не-COVID-19 ОПП). Мы обнаружили несколько популяций воспалительных иммунных клеток и дифференциально активируемые пути при ОПП, связанном с COVID-19, а также предварительные доказательства.для прямого заражения уротелиальных клеток SARS-CoV-2.
Материалы и методы
Участники и переменные Взрослые в возрасте 18 лет и старше проходили обследование при поступлении или переводе в больницу Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB) в период с марта по май 2021 года. Случаи ОПП были выявлены с использованиемБолезнь почекУлучшение определения глобальных результатов как повышение уровня креатинина в сыворотке крови (sCr) 0,3 мг/дл в течение 48 часов или 0,1,53 исходного уровня креатинина. Контрольные группы без изменений уровня креатинина были выбраны на основе соответствия возраста и пола, где это возможно, и обработаны с каждым соответствующим образцом ОПП. Исходный уровень sCr определялся с использованием самого последнего значения sCr за 7–365 дней до госпитализации. Дополнительные клинические данные, касающиеся демографических данных, истории болезни, клинических характеристик и лабораторных показателей, были извлечены из карт пациентов командой UAB Центра клинических и трансляционных наук i2b2. В исследование были включены восемь госпитализированных пациентов с COVID-19, пять с ОПП и трое без ОПП. Это исследование и коллекция образцов были одобрены Институциональным наблюдательным советом UAB. Консультативная группа UAB по острой нефрологии также собрала образцы у пациентов с ОПП, не связанным с COVID-19 (n54), для сравнения клеточных изменений с ОПП, связанным с COVID-19. Они были собраны в соответствии с другим протоколом наблюдательного совета учреждения, который позволяет собирать остатки образцов мочи и, следовательно, является анонимным.
Сбор и обработка образцов
Все этапы выполнялись на льду. Мочу собирали либо в виде образца, либо из мочевого катетера. Образцы были немедленно переданы в лабораторию 21 уровня биобезопасности для обработки. Образцы мочи переносили в коническую пробирку 50- мл и центрифугировали при 10003 g в течение 10 минут при 4°C. Осадки клеток промывали ледяным PBS, фильтровали через фильтр 40- мм и снова центрифугировали. Живые клетки очищали с использованием набора для удаления мусора MACS (MilteNY Biotec), а затем с помощью набора для удаления мертвых клеток EasySep Аннексин V (StemCell). Вкратце, клетки ресуспендировали в ледяном PBS и смешивали с раствором для удаления мусора. На смесь наносили холодный PBS и центрифугировали при 3003 g в течение 10 минут при 4°C. Две верхние фазы отсасывали, а затем оставшиеся клетки промывали PBS. Клетки ресуспендировали и смешивали с коктейлем для удаления мертвых клеток, коктейлем для отбора биотина, а затем с RapidSpheres перед разделением в магните EasySep. Клетки промывали и ресуспендировали в 52 мл PBS (без кальция и магния), 10,04% BSA (Fisher Scientific) для обработки scRNAseq.
scRNAseq
Очищенные клетки переносили в проточную цитометрию UAB и в одноклеточное ядро и немедленно обрабатывали с использованием набора для секвенирования одноклеточной РНК Chromium 39 (103).Геномика) по данным производителя'инструкции.Клеточную суспензию подсчитывали, объединяя с 103 Смесь реагентов хрома и загружена в микроанализатор.этуидическийустройство для разделения одиночных клеток, в котором происходит лизис и обратныйтранскрипция происходит в микрокапельках. Полученная кДНКбыло усиленофиобработаны с помощью ПЦР и впоследствии обработаны для получения
библиотеки секвенирования со штрих-кодом. Секвенирование парных концов проводили на платформе секвенирования Illumina NovaSeq6000 или NextSeq500 (Illumina). Чтения обработаныиспользуя 103 Программное обеспечение Genomics Cell Ranger для одноклеточных системВерсия пакета 6.0 на UAB Cheaha High-PerformanceВычислительный кластер. БКЛфифайлы конвертированы в FASTQфифайлы с помощью быстрой функции CellRanger. CellRangerfast использовался для выравнивания FASTQфифайлы в собственный геномсостоящий из генома человека hg38 (GRCh38.p13) с
геном SARS-CoV-2 (NC_045512.2), встроенный в виде экзона (31). Для анализа были созданы таблица генов, таблица штрих-кодов и матрицы транскрипционной экспрессии.указано ниже.
Анализ данных
Анализы проводились с использованием пакетов, созданных для среды статистического анализа R (версия 4.06). Данные в основном анализировались в версии Seurat 3.2.3 (32,33) и еесвязанные зависимости. Данные каждого пациентабыли импортированы с помощью Read103 функция, а затем структурапреобразован в объект Seurat с помощью CreateSeuratObject. Дляконтроль качества, количество ячеек с уникальными характеристиками более 2500или менее 200 и клетки с митохондриальными пропорциями.15% былифиотфильтровано. Данные были нормализованы с использованием журналаНормализуйте и масштабируйте для подготовки к линейным измерениям.снижение. Предметы отдельных пациентов были помеченыс уникальным идентификатором группыфикатионы, а затем слились водин объект с помощью функции слияния Сёра. Пациент Сэмфайлы были интегрированы с функцией RunHarmony с помощьюпакет Harmony R (34). Анализ главных компонентовбыло выполнено, а затем клетки были кластеризованы на основедифференциальная экспрессия генов, определенная СёраДля функции FindAllMarkers установлено разрешение, равное единице. Дименсиональная редукция проводилась с использованием единого коллекторааппроксимация и проекция. Типы клеток были идентифицированыфиЭдпутем сравнения дифференциально экспрессируемых транскриптов длякаждый кластер с известными транскриптами, связанными с конкретнымифиc типы клеток (29,35,36). Пакет Escape R использовался для запускаАнализ обогащения набора генов (GSEA) (37). ВебгештальтRиспользовался для анализа онтологии генов для выявления путейиспользование биологического процесса и Киотской энциклопедииБазы данных «Гены и геномы» (38).
