Маленький, но мощный: экзосомы, новые межклеточные мессенджеры в нейродегенерации. Часть 1

Простое резюме:

Экзосомы — это биологические наночастицы, недавно признанные межклеточными посланниками. Они содержат груз липидов, белков и РНК. Они могут передавать свое содержимое не только в ячейки, находящиеся поблизости, но и в ячейки, находящиеся на расстоянии.

Экзосомы — это недавно открытый инструмент межклеточной коммуникации, который может выделять небольшие и деликатные пузырьки в окружающие клетки, доставляя в окружающие клетки некоторые белки, сигнальные вещества и другие вещества. Эти вещества могут помочь клеткам изменить свое состояние и даже повлиять на рост, развитие, обмен веществ и другие аспекты других клеток. Исследования последних лет показали, что экзосомы играют важную роль в функционировании мозга человека, особенно в поддержании и улучшении памяти.

Во-первых, экзосомы могут способствовать передаче сигналов между нейронами. Передача информации между нейронами является одним из необходимых условий нормальной работы нервной системы, а экзосомы играют роль мессенджеров, которые могут сделать передачу информации между нейронами более плавной, тем самым улучшая когнитивные функции и память мозга.

Во-вторых, экзосомы также могут регулировать метаболизм нейронов. В процессе продукции и высвобождения экзосом нейронами участвует большое количество метаболических процессов, что способствует балансу и регуляции клеточного метаболизма. Эти процессы могут не только улучшить способность нейронов, но также помочь удалить метаболические отходы и вредные молекулы и сохранить клетки мозга здоровыми.

Наконец, экзосомы также могут помочь нейронам восстанавливать повреждения. Многие белки и нуклеиновые кислоты, переносимые экзосомами, полезны для роста, восстановления и регенерации клеток и могут способствовать восстановлению и регенерации нейронов, тем самым улучшая способность клеток мозга к выживанию и укрепляя центры памяти и когнитивные способности.

Таким образом, существует тесная связь между экзосомами и памятью. Мы можем изменить детскую память, начав с диеты. Активное изменение структуры питания детей и употребление большего количества продуктов, богатых полезными ингредиентами, такими как жирные кислоты, белки и витамины, может способствовать выработке и высвобождению экзосом, тем самым помогая детям улучшить свои способности к обучению и памяти. Детям также можно предложить некоторые игры и упражнения для тренировки мозга, чтобы тренировать их мышление, стимулировать потенциал экзосом и играть лучшую роль. Видно, что нам нужно улучшить память, а цистанхе может значительно улучшить память, потому что цистанхе — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность Cistanche обусловлена ​​различными содержащимися в нем активными ингредиентами, в том числе дубильной кислотой, полисахаридами, флавоноидными гликозидами и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга разными способами.

Нажмите «Знать», чтобы улучшить кратковременную память.

Эта уникальная способность позволяет им модулировать физиологию клеток-реципиентов. В мозге экзосомы играют роль в нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз.

Абстрактный:

Экзосомы эндосомального происхождения представляют собой один класс внеклеточных везикул, играющих важную роль в межклеточной коммуникации. Экзосомы выделяются всеми клетками нашего тела, и их груз, состоящий из липидов, белков и нуклеиновых кислот, имеет след, отражающий их родительское происхождение.

Экзосомальный груз обладает способностью модулировать физиологию клеток-реципиентов поблизости от высвобождающих клеток или клеток на расстоянии. Использование потенциала экзосом зависит от чистоты препарата экзосом.

Таким образом, было разработано множество методов выделения, и мы даем краткое описание некоторых методов. Несмотря на изоляцию, налагаемую гематоэнцефалическим барьером, клетки ЦНС не застрахованы от экзосомальных интрузивных влияний. Как нейроны, так и экзосомы глиарелизируют, часто в зависимости от активности.

Дано краткое описание экзосом, выделяемых различными клетками головного мозга, и их роли в поддержании гомеостаза ЦНС. Отличительной чертой некоторых нейродегенеративных заболеваний является накопление белковых агрегатов. Недавние исследования подтверждают роль межклеточных коммуникаторов экзосом в распространении неправильно свернутых белков, способствуя распространению патологии.

В этом обзоре мы обсуждаем потенциальный вклад экзосом в прогрессирование болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза.

Понимание вклада экзосом в патогенез нейродегенерации открывает поле для использования экзосом в качестве терапевтических агентов для доставки лекарств в мозг, поскольку экзосомы действительно проникают через гематоэнцефалический барьер.

Ключевые слова: экзосомы; нейроны; глиальные клетки; центральная нервная система (ЦНС); нейродегенеративные заболевания; болезнь Альцгеймера; болезнь Паркинсона; боковой амиотрофический склероз.

1. Введение и историческая перспектива.

Межклеточная коммуникация представляет большой интерес для эмбрионального развития, регенерации/замены эпителия, гаметогенеза и поддержания гомеостаза.

С помощью ультраструктурных и биохимических исследований были идентифицированы несколько механизмов межклеточной коммуникации, такие как эндоцитоз/экзоцитоз и поглощение выступающих цитоплазматических пузырей [1–3]. Был идентифицирован еще один игрок — внеклеточные везикулы, но их роль в межклеточной коммуникации оценена не сразу [4].

Внеклеточные везикулы были обнаружены случайно во время исследования высвобождения ферментов, связанных с плазматической мембраной, экто-АТФазы и экто-50-нуклеотидазы в среду культуры клеток. В 1981 году сотрудники Трамсанда культивировали нормальные и неопластические клеточные линии мышиного и человеческого происхождения в бессывороточной среде, поскольку было известно, что сыворотка обладает каталитической активностью АТФазы и 50-нуклеотидазы.

После удаления плавающих клеток и дебриса кондиционированную среду центрифугировали со скоростью 310,000×g в течение 90 мин в роторе Spinco Ti-70 и осадки исследовали под электронным микроскопом. Были обнаружены две популяции везикул, покрытых внеклеточной мембраной: одна со средним диаметром от 500 до 1000 нм и вторая, меньшая популяция с диаметром ~ 40 нм.

Эти везикулы, первоначально описанные авторами как «расслоенные везикулы», содержали как 50-50-нуклеотидазную, так и ферментативную активность АТФазы. Кроме того, отслоившиеся везикулы содержали РНК и фосфолипиды, отличающиеся от родительских клеток и родительской плазматической мембраны соответственно.

Инкубация отслоившихся везикул из клеток глиомы С6 с предварительно меченными 32P клетками нейробластомы стимулировала дефосфорилирование белков нейробластомы с одновременным высвобождением свободного радиоактивно меченного фосфора (32P).

Эти данные установили, что отслоившиеся везикулы были не просто переносчиками клеточных отходов (ферментов), но выполняли физиологическую функцию. Трам и его коллеги ввели термин «экзосомы» для описания «отслоившихся везикул» [5] (историю внеклеточных везикул см. в обзорной статье [6]). до 1981 года). Спустя несколько лет две исследовательские группы независимо изучили судьбу рецептора трансферрина в ретикулоцитах с помощью электронной микроскопии [7–9].

Созревающие ретикулоциты не нуждаются в трансферрине, поэтому они теряют рецепторы трансферрина. Обе группы наблюдали, что культивируемые ретикулоциты выделяют во внеклеточное пространство небольшие везикулы диаметром около 50 нм.

Эти маленькие везикулы содержали недеградированные рецепторы трансферрина. В 1987 году Джонстон и его коллеги использовали термин «экзосомы» для описания небольших везикул, содержащих рецепторы трансферрина [10]. После этих первых лет потенциал экзосом был реализован как новые межклеточные мессенджеры, которые могут модулировать физиологию клеток-мишеней.

Интересно, что генезис экзосом начинается с эндоцитоза (процесс, выявленный в 1883 году; обзор [3]) в клетках, а высвобождение экзосом во внутриклеточное пространство использует процесс экзоцитоза. С момента их первоначального открытия мы теперь знаем, что экзосомы представляют собой подтип внеклеточных везикул. эндоцитарного происхождения с размером в диапазоне 40–160 нм в диаметре [11].

Исследования с использованием индикаторов показали, что макромолекулы эндоцитозируются в покрытых щетинками (т.е. покрытых клатрином) впячиваниях или ямках на поверхности клетки. Эти впячивания в конечном итоге отделяются от плазматической мембраны и обнаруживаются в цитоплазме.

После потери щетинок (т.е. клатрина) везикулы, покрытые эндоцитозом, становятся гладкими и сливаются с ранними эндосомами, что приводит либо к быстрому возвращению на клеточную поверхность (рециклинг эндосом на рисунке 1) [12], либо к созреванию с образованием поздних эндосом.

Ранние и поздние эндосомы действуют как «сортировочные центры», чтобы соответствующим образом направлять свое содержимое: (i) для ретроградного транспорта в сеть транс-Гольджи (т.е. извлечение эндосомы в TGN) [13,14]; (ii) в лизосомы для деградации макромолекул до простых продуктов для повторного использования внутри клетки [15,16]; и/или (iii) для рециркуляции на клеточную поверхность через мультивезикулярные тельца [17].

Во время созревания ранних эндосом в эндосомы внутренняя мембрана эндосом подвергается инвагинации, что приводит к образованию внутрипросветных везикул (теперь обозначаемых как экзосомы). Специфические макромолекулы, такие как цитозольные белки, нуклеиновые кислоты и липиды, сортируются в развивающиеся экзосомы.

Поздние эндосомы, упакованные экзосомами, идентифицируются как мультивезикулярные тельца, мигрирующие к плазматической мембране. При слиянии с плазматической мембраной мультивезикулярные тельца высвобождают экзосомы во внеклеточное пространство в процессе экзоцитоза (рис. 1) [18,19]. Большое подмножество белков, которые рекрутируются последовательно, играют решающую роль в процессе эндоцитоза ранних эндосом, созревания эндосом до позднеэндосом и их последующей внутриклеточной судьбы (rev. [17,18,20]).

Важность этих белков подчеркивается их утратой и/или мутацией, вызывающей различные заболевания. Например, белки Струмпеллин и SWIP входят в состав комплекса WASH, который участвует в полимеризации актина, а также делении и сортировке эндосом. Мутации гена Strumpellin вызывают наследственную спастическую параплегию, характеризующуюся дегенерацией двигательных нейронов [21].

Единственная точечная мутация (Pro1019Arg) в белке SWIP дестабилизирует комплекс WASH. Дестабилизированный комплекс WASH ингибирует эндолизосомный транспорт, вызывая слипание эндосом. Нарушение эндосомального трафика влияет на когнитивные функции и функцию мотонейронов, при этом симптомы описываются как несиндромальная умственная отсталость [22,23].

В цитоплазме экзосомы происходят из эндосом с помощью эндосомальных сортирующих комплексов, необходимых для транспорта (ESCRT), также известных как ESCRT-зависимый механизм биогенеза экзосом (обзоры [18,20]).

Две группы независимо сообщили о липид-опосредованном биогенезе экзосом, механизме, независимом от ESCRT. Двумя липидами, идентифицированными в этих исследованиях, были бис(моноацилглицеро)фосфат/лизобисфосфатидная кислота (BMP/LBPA) и церамид [29,30].

Rab31 представляет собой еще один ESCRT-независимый механизм биогенеза экзосом в цитоплазме. Активация Rab31 стимулирует образование внутрипросветных везикул [31]. Есть еще один механизм, который в настоящее время недостаточно обсуждается и недостаточно изучен.

Этот механизм основан на ультраструктурных наблюдениях, проведенных в конце 1950-х - 1970-х годах, которые показали, что ядра клеток могут быть местом происхождения мультивезикулярных телец, упакованных небольшими пузырьками. Маленькие везикулы, описанные в этих исследованиях, возможно, были экзосомами, но термин экзосома в то время еще не был придуман. Киларски и Ясински наблюдали процесс, называемый ядерным пузырением или ядерной экструзией, в клетках плавательного пузыря окуневой рыбы Perca fluviatilis L. (рис. 2а) [24] с содержимым, сходным с нуклеоляркариоплазмой [32].

Эти авторы отметили, что ядерное пузырение может стимулироваться удалением газа из плавательного пузыря окуневых рыб [24]. Процесс ядерного блеббинга, по-видимому, заслуживает внимания как место происхождения экзосом, обогащенных нуклеиновыми кислотами и/или рибонуклеопротеинами.

Ядерные пузыри были заполнены маленькими везикулами, которые возникали из одиночных складок внутренней мембраны ядерных пузырей (Рисунок 2b), процесс, сходный с образованием внутрипросветных пузырьков в эндосомах. Ядерные пузырьки, наполненные «маленькими пузырьками», в конечном итоге отделились от ядер и стали частью цитоплазмы (рис. 2в).

Киларски и Ясински в своей рукописи называли ядерные пузырьки мультивезикулярными телами из-за отсутствия лучшей терминологии. Непреднамеренно эти авторы, возможно, были правы, поскольку последующие исследования сообщили о наличии мультивезикулярных телец в ядрах клеток [33]. Ядерные пузырьки, заполненные небольшими пузырьками, имеют морфологию, аналогичную мультивезикулярным тельцам, происходящим из эндосом в цитоплазме (рис. 1 и 2).

Из-за сходства ядерных мультивезикулярных телец с вирусным нуклеокапсидом исследователи сосредоточили свое внимание на вирусологии, а феномен ядерного блеббинга и его клеточная функция остались малоизученными [34].

Независимо от способа биогенеза экзосомы состоят из алипидного бислоя и содержат макромолекулярное содержимое, состоящее из липидов, белков и нуклеиновых кислот.

Некоторые из макромолекул являются общими для экзосом, происходящих из всех клеток, и, следовательно, классифицируются как маркеры экзосом и используются в качестве подтверждающего инструмента для отличия экзосом от других внеклеточных везикул. Уникальные макромолекулы, присутствующие в экзосомах, часто отражают их родительское происхождение и, следовательно, могут быть обозначены как биомаркеры.

Все клетки выделяют экзосомы во внеклеточное пространство. Из внеклеточного пространства экзосомы попадают в различные биологические жидкости и достигают клеток локально и на расстоянии. Клетки, культивированные in vitro, выделяют свои экзосомы в культуральную среду. Постоянное высвобождение экзосом во внеклеточное пространство делает культуральную среду и биологические жидкости богатым источником выделения экзосом.

Экзосомы содержат значительное количество кодирующих и некодирующих РНК, фрагменты двухцепочечной геномной ДНК и митохондриальной ДНК. Трамс и его коллеги первыми описали наличие РНК в «расслоенных везикулах», смеси экзосом и микровезикул.

Они определили, что «расслоившиеся везикулы или экзосомы» содержат 5% РНК [5]. Валади и его коллеги были первыми, кто систематически анализировал РНК, упакованные в экзосомы. Экзосомальные РНК включали транслируемые мРНК и микроРНК (миР) [35].

МикроРНК представляют собой класс некодирующих РНК (нкРНК). Их длина составляет ~22 нуклеотида, и они регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне путем связывания с 30-нетранслируемыми участками своих целевых информационных РНК [36]. Интересно, что некоторые микроРНК, обогащенные экзосомами, не обнаруживаются в родительских клетках, что указывает на селективную систему сортировки/упаковки РНК во время биогенеза экзосом [35,37].

В отличие от клеток, экзосомы содержат мало или вообще не содержат рибосомальной РНК, но содержат фрагменты тРНК [38]. Сортировка РНК на экзосомы зависит от (1) белка, связанного с комплексом молчания РНК (RISC), (2) мотивов последовательности РНК и направляющих белков, (3) добавлений нуклеотидов на 30-конце микроРНК, (4) клеточной доступности микроРНК и (5) церамид [39,40].

Мы полагаем, что ядерный блеббинг — это еще один клеточный процесс, который позволяет дифференциально сортировать РНК, РНК-белковые комплексы и геномную ДНК в экзосомы. Причин такой точки зрения несколько: (1) содержимое «внутрипросветных везикул» было сходно с ядрышковым кариоплазмой [32]. «Везикулы» в ядерно-мультивезикулярных тельцах (MVB II) были обогащены РНК, кислыми и основными белками, поэтому авторы считали: внутрипросветные везикулы» как место синтеза РНК помимо ядрышка [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >экзосомы длиной 10 т.п.н. [43–47].

Кстати, геномная ДНК была обнаружена только в экзосомах, полученных из линий раковых клеток, а не в нормальных клетках [47]. Раковые клетки имеют аномальный хроматин из-за перестройки/транслокации хроматина и, возможно, плоидности [48], что может вызывать фрагментацию геномной ДНК в ядрах раковых клеток. Эти фрагменты ДНК могут легко инкорпорироваться в МВБ типа II (и экзосомы), развивающиеся в ядрах. (3) Способ биогенеза «малых везикул» в ядерных пузырях, описанный Киларским и Ясинским [24], подобен образованию внутрипросветных везикул в поздних эндосомах в цитоплазме.

Мы твердо убеждены, что наличие геномной ДНК в экзосомах является патологией и, следовательно, ее присутствие в экзосомах можно использовать в качестве диагностического инструмента для развития аномальных (или раковых) клеток в организме. (4) Зависимое от активности увеличение количества экзосом, высвобождаемых клетками [49], сравнимо с газовыми клетками, которые демонстрировали увеличение ядерного пузырения при удалении газа из плавательного пузыря окуневых рыб [24].

Совсем недавно митохондриальные белки и ДНК были обнаружены в экзосомах плазмы некоторых больных раком, и их присутствие связано с агрессивностью рака [50,51].

Распад митохондрий часто наблюдается в дегенерирующих клетках [52,53]. Митохондриальные кристы, высвобождающиеся из дегенерирующих митохондрий, могут быть интернализованы мультивезикулярными тельцами и в конечном итоге упакованы в экзосомы.

Это мнение подтверждается ультраструктурными изображениями лимфобластоидных клеток человека и просвета ацинусов простаты павиана, которые имели «микровезикулы» (или экзосомы), образовавшиеся в результате распада крист митохондрий [54].

Основываясь на вышеизложенном обсуждении и подтверждающих экспериментальных данных, мы предполагаем, что гетерогенная природа экзосом возникает в результате биогенеза мультивезикулярных телец и связанных с ними экзосом в разных субклеточных местах, а не полностью в цитоплазме, как мы в настоящее время убеждены. Наше предложение может объяснить гетерогенность экзосом. а также несоответствие теоретических расчетов экспериментальным данным о количестве малых РНК или белковых молекул, содержащихся в одной выделенной из сыворотки экзосоме [55].

Основываясь на теоретических расчетах с использованием среднего размера экзосомы, Ли и его коллеги предсказали, что каждая экзосома будет вмещать примерно 70–25000 небольших молекул РНК или белка.

Однако их экспериментальные данные показали наличие одной молекулы РНК на экзосому, очищенную из сыворотки [55]. Наша гипотеза требует дальнейшего изучения ядерных пузырей, ядерных мультивезикулярных телец и биогенеза экзосом, содержащих РНК/рибонуклеопротеин, в ядерных мультивезикулярных тельцах. Липиды являются важной частью мембран экзосом и асимметрично распределены между двумя мембранными листками экзосом. Липидный состав мембраны родительской клетки и мембраны экзосом различается.

В целом, липиды, обогащенные экзосомальными мембранами, представляют собой сфингомиелин, церамиды, микродомены холестерина и богатых холестерином липидных рафтов, ганглиозид GM3, денасыщенные липиды и фосфатидилсерин [56–58]. Экзосомальные белки состоят из белков, общих для большинства экзосом, а также уникальных белков, специфичных для экзосом. к определенной родительской ячейке.

Белковый состав всех экзосом обычно обогащен нацеливающими и слитыми белками, такими как тетраспанины, интегрины, белки-шапероны, например, белки теплового шока (Hsp60, Hsp70 и Hsp90), малые белки, транспортирующие мембрану HSP, белки Rab, ARF GTPases, аннексины и белки, участвующие в формировании мультивезикулярных телец, такие как ALIX и TSG101 [59].

Более поздние исследования предполагают наличие РНК-связывающих белков, образующих РНК-белковые комплексы в экзосомах [38]. Несколько клеточных процессов, обеспечивающих загрузку белков в экзосомы, представляют собой (1) механизмы ESCRT для белков с определенными посттрансляционными модификациями, такими как убиквитинирование, Wnt-стимулированное метилирование аргинина, окисление, фосфорилирование, гликозилирование и цитруллинирование; (2) шаперон-опосредованная аутофагия (CMA), которая основана на взаимодействии между родственным белком теплового шока массой 71 кДа (HSC70) и белками с мотивом KFERQ.

После связывания HSC70 с белками с мотивом KFERQ белки направляются на мультивезикулярные тельца. Шаперон-опосредованная аутофагия обычно направлена ​​на деградацию белков в лизосомах. Более поздние данные свидетельствуют о том, что CMA играет роль в высвобождении экзосом и опосредованном экзосомами диссеминации белковых агрегатов при некоторых нейродегенеративных заболеваниях [60–63].

С 1990-х годов наблюдается экспоненциальный рост исследований экзосом, и было получено много данных об экзосомальных грузах. Базы данных были созданы для того, чтобы обеспечить сбор экзосомальных грузов до того, как станет слишком сложно управлять большими наборами данных.

Повторяемость опубликованных данных об экзосомах является еще одной причиной, поскольку большинство лабораторий используют вариации различных методов, разработанных для выделения экзосом. Например, Vesiclepedia представляет собой вручную составленный сборник молекулярных грузов (липидов, РНК и белков), идентифицированных в различных классах внеклеточных везикул [64]. Vesiclepedia предоставляет ценный ресурс для исследователей.

База данных Vesiclepedia является общедоступной и позволяет пользователям запрашивать и загружать данные о грузах экзосом на основе введенных пользователем критериев поиска. EV pedia, Exocarta, ExoRbase и EV miRNA являются дополнительными базами данных, которые каталогизируют экзосомальные белки и РНК [64].

Базы данных управляются аннотациями сообщества. Данные, хранящиеся в этих базах данных, получены путем выделения экзосом с использованием множества различных методов разделения, которые не включены в базу данных.

Таким образом, содержание экзосомального груза может различаться в зависимости от используемого метода выделения, что приводит к некоторой неоднозначности сообщаемых результатов. Для улучшения воспроизводимости и прозрачности эксперимента был разработан набор инструментов EV-TRACK для базы знаний с открытым исходным кодом. EV-TRACK включает данные по приготовлению экзосом и характеристике экзосом [65].

Ключевой особенностью EV-TRACK является EV-METRIC, который представляет отчеты об экспериментальных параметрах в процентах от выполненных компонентов из списка из девяти [66]. Эти компоненты были выбраны консорциумом EVTRACK и признаны необходимыми для однозначной интерпретации и воспроизведения экспериментальных данных. Таким образом, EV-METRIC был разработан, чтобы помочь исследователям и рецензентам предоставить всесторонний обзор данных.

2. Современные методы выделения экзосом.

Экзосомы представляют собой богатый ресурс для открытия биомаркеров и новых терапевтических стратегий, включая регенеративную медицину. Первостепенное значение для успеха этих целей имеет выделение чистых экзосом воспроизводимым методом.

Выделение функционально компетентных экзосом особенно важно для потенциальных терапевтических применений. Экзосомы были очищены от различных биологических жидкостей, таких как кровь, плазма, спинномозговая жидкость, слюна, моча и молоко. Каждая биологическая жидкость имеет разные физические и химические характеристики, которые необходимо учитывать перед выделением экзосом.

В некоторых случаях для выделения экзосом могут потребоваться особые меры предосторожности. Конечное применение очищенных экзосом является еще одним фактором, влияющим на метод выделения экзосом.

На сегодняшний день разработано несколько методов выделения экзосом, некоторые из них основаны на таких характеристиках экзосом, как их размер, плотность, поверхностный заряд и белки, связанные с поверхностью экзосом (рис. 3) [67].

Некоторые из используемых в настоящее время методов выделения экзосом перечислены в Таблице 1. Большинство из них не являются самостоятельными методами и требуют предварительных этапов обработки после отбора проб. Основные методы кратко обсуждаются ниже.

Рисунок 3. Обычно используемые методы выделения экзосом и их дальнейшее применение. Несколько методов, разработанных на сегодняшний день для выделения экзосом, основаны на их плавучей плотности, схема 1, 13 и 1,19 г/мл, метод ультрацентрифугирования (UC) был дополнительно усовершенствован для изолировать чистые препараты экзосом на основе их плавучей плотности с помощью изопикнического ультрацентрифугирования над сахарозой или градиентом плотности йодиксанола (ГД).

Для устранения повышенного содержания белка при протеинуриях метод ультрацентрифугирования сочетали с эксклюзионной хроматографией (SEC). Ограничения во времени, связанные с методом ультрацентрифугирования, привели к разработке метода фильтрации (УФ).

Прохождение разбавленных образцов, таких как культуральная среда и моча, через нано- или микромембранный концентратор позволило очистить экзосомы. Засорение мембраны и плохое восстановление экзосомальных белков сделали этот метод непопулярным для последующих приложений, таких как выделение РНК и высокопроизводительные приложения.

Другой метод, разработанный для выделения экзосом из очень разбавленных биологических флюидов – гидростатический фильтрационный диализ (HFD*) в сочетании с центрифугированием. В методе HFD образец диализуется через диализную мембрану с пороговой молекулярной массой 1000 кДа под гидростатическим давлением, что позволяет удалить нежелательные макромолекулы из образца, а экзосомы выделяют центрифугированием.

Метод осаждения экзосом, основанный на растворимости или диспергируемости и агрегации, был разработан для одновременной обработки нескольких образцов. Коммерческие наборы для очистки экзосом основаны на этой стратегии.

В этом методе орасциты мочи смешивают с полиэтиленгликолем (ПЭГ) 6000 или в сочетании с протамином (плюс ПЭГ35 000) и инкубируют либо в течение ночи, либо в течение 1 часа на льду.

Полученную мутную смесь центрифугируют для извлечения экзосом, которые используются для последующих анализов РНК и белков. Другими реагентами, используемыми для осаждения экзосом, являются (1) 0.1M ацетат натрия, pH 4,75 (метод высаливания) (NaAc), (2) 4-кратный объем холодного ацетона (-20 ◦C) ( PROtein Organic Solvent Precipitation (сокращенно PROSPR), (3) и смесь ПЭГ и раствора декстрана (до 1,5%) (двухфазный метод, позволяющий отделить белки от экзосом).

Идентификация поверхностных белков экзосом привела к разработке методов, основанных на иммуноаффинном захвате, с использованием антител к поверхностным белкам экзосом, таким как Tim4, аннексин, EpCAM, общий поверхностный белок экзосом, CD63 и белки теплового шока (аффинное взаимодействие). Сродство к лектину (который связывается с гликопротеинами на поверхности экзосом) и гепарину (который связывается с протеогликанами гепарансульфата на поверхности экзосом) было использовано для разработки методов выделения экзосом.

Несколько платформ, таких как магнитные шарики, микронаконечники из высокопористого монолитного диоксида кремния, поверхность пластиковых пластин, целлюлозные фильтры, мембранные аффинные фильтры, агарозный сорбент и микрофлюидные устройства, использовались для методов очистки экзосом на основе аффинности, и они имеют различные преимущества для их использования в диагностические, прогностические, в качестве систем доставки лекарств, а также обнаружения и анализа форэкзосомальных грузов.

Адаптировано с разрешения Коношенко М.Ю., Лекчнова Е.А., Власова А.В., Лактионова П.П. Выделение внеклеточных везикул: общие методологии и новейшие тенденции. Biomed Res Int. 2018 30 января; 2018:8545347. doi: 10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Copyright © 2022 Мария Ю. Коношенко и др.

Это статья с открытым доступом, распространяемая по лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно цитируется [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com