Структурная характеристика полисахарида Cistanche Deserticola и его защитное действие на HK -2

Абстрактный:

 

Цель: изучить структуру полисахаридов Cistanche Deserticola (CDP) и защитный эффект и механизм проксимальных эпителиальных ячеек человека (hk {0}). Методы. Химический состав, молекулярная масса, моносахаридная состав и возможная структура CDP были обнаружены методом фенола серной кислоты, методом гидроксил бифенил, блестящим методом синего цвета, методом ионового хроматографа, хроматографии с высоким характеристиком геля и инфракрасной хроматографии. Защитный эффект CDP на травму hk -2 и его механизм оценивался путем установления модели повреждения -2, индуцированных высокой глюкозой. Респультируются: средняя молекулярная масса CDP была 8 0 31,4198,344444444444 гг. арабиноза, и может быть -гликозидная связь. Это может уменьшить окислительное повреждение клеток HK -2, индуцированных высокой глюкозой, и повреждение митохондриальной мембранной потенциала HK -2 клеток, вызванных высокой глюкозой. Относительная экспрессия белка -рецептора Toll -подобного рецептора 4 (TLR4) и соотношение P -киночного фактора (NF) -κB P65 / -актин и P -IκB / -актина в HK -2 клетках были значительно снижены после вмешательства с различными концентрациями CDP (P <0,05, P <0,01). Вывод: CDP могут уменьшить высокийИндуцированная глюкозой почечной эпителиальной клеткиПовреждение путем ингибирования TLR4 / NF-κB для стимулирования пролиферации клеток и ингибирования окислительного стресса и апоптоза.

 

Ключевые слова: CISTANCHE DESERTICOLA POLISACHARIDE; Эпителиальные клетки почечной трубки человека; Окислительный стресс; Путь TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanche для диабетической нефропатии (DN)

 

Нефропатия диабета (DN)является основной причиной заболевания почек конечной стадии и серьезно угрожает жизни и здоровью пациентов [1]. Почечная трубчатая травма играет ключевую роль в возникновении и развитии DN. Гемодинамические аномалии, окислительный стресс, воспалительный ответ и метаболические аномалии, вызванные средой с высоким содержанием сахара, могут вызывать апоптоз и некроз почечных канальских эпителиальных клеток, что приводит к повреждению почечных канальцев [2,3]. TLR4 в почке является членом семейства TLRS, и связанная с ним передача сигнала играет важную роль в возникновении и развитии DN [4]. В высоких условиях глюкозы высокая экспрессия TLR4 в почках может активировать путь NF-κB, усугубляя клеточное окислительное повреждение и вызывая HK -2 клеточный апоптоз [5, 6].
Cistanches Herba - это сушеный мясистый стебель с листьями фосфора из Cistanche Deserticola YCMA и (или) Cistanche Tubulosa (Schenk) Wight, традиционного лекарственного и съедобного растения. На вкус сладкий, соленый,

Это согревает и входит впочки и меридианы с большой кишкойПолем Он обладает последствиями тонизирующей почки ян, улучшения сущности и крови, а также увлажнения кишечника и облегчения запоров. [7] Полисахариды являются одним из основных активных ингредиентов Cistanche Deserticola. Содержание полисахаридов в водном экстракте Cistanche Deserticola относительно высокое, причем литература сообщает, что содержание составляет от 29,598 до 39,609 мг/г [8]. В основном он состоит из глюкозы, галактозы, рамнозы, арабинозы, фруктозы и т. Д. Он состоит из моносахаридов и обладает множеством фармакологических эффектов, включая регуляцию иммунной активности, антивозрастные возрасты, улучшение обучения и памяти, защиту нервов, сопротивление повреждению печени, антивирус и анти-мощным [9]. В последние годы большое количество исследований показало, что полисахариды в традиционной китайской медицине могут улучшить диабетическую нефропатию. Многоцелевые характеристики многоцелевого пути и значительные эффекты китайских травяных полисахаридов демонстрируют большой потенциал в вмешательстве в диабетической нефропатии [10]. В исследовании Wang et al. [11], баньяновые полисахариды показали значительное влияние на улучшение метаболизма глюкозы и липидов, уменьшении воспалительных реакций и регуляции кишечной микробиоты диабетических мышей 2 типа через ось кишечника. Предыдущие исследования, проведенные исследовательской группой, показали, что водный экстракт Cistanche Deserticola может увеличить скорость выживаемости клеток HK -2 в среде с высоким содержанием сахара и с высоким содержанием жира, регулирует апоптоз клеток, окислительный стресс и уровни воспаления и оказывает потенциальное терапевтическое воздействие на диабетическую нефропатию [12]. Результаты эксперимента на животных показали, что CDP могут эффективно улучшать диабетическую нефропатию у мышей, а патологические результаты показали, что почечный трубчатый фиброз был значительно улучшен [13]. Тем не менее, существует мало исследований о роли полисахаридов Cistanche Deserticola в защите модели HK -2. Ввиду потенциальной фармакологической активности и механизма полисахаридов, это исследование направлено на обнаружение химического состава, молекулярную структуру и молекулярную структуру CDP с использованием метода фенола серной кислоты, гидроксибифенилового метода, хроматографии Coomassie Blue Blue, ионной хроматографии, хроматографии с высокой производительности. Была проанализирована масса, моносахаридная композиция и возможная структура, и была установлена ​​модель повреждений клеток HK -2, индуцированных высоким уровнем глюкозы для оценки защитного эффекта CDP на повреждение HK {24} и механизм действия. Обеспечить теоретические и экспериментальные данные о потенциальном применении CDP в лечении DN.

1 материалы и методы
1.1 Материалы и инструменты

CDPS (содержимое полисахарида> 8 0%, номер партии: 2306019, Shaanxi Xintianyu Company); Дапаглифлозин (DAPA, номер партии: BMS -512148, Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); Человеческие почечные канальцы эпителиальные ячейки hk -2 (номер партии: 20231014, Actt Company, USA); Мемканьем, культуральная среда, бычья сыворотка плода (номер участка: 20231014, 20231014, Gibco Company, США); Buffer PBS (номер лота: 20230906, Hyclone Company, США); 0,25% раствор для пищеварения трипсина ЭДТА (номер участка: 20240411, компания Anhui BioSharp); CCK -8 Комплект для обнаружения жизнеспособности ячейки (номер партии: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); супероксиддисмутаза (СОД), Малондиалдегид (MDA), глутатионпероксидаза
Пероксидаза, GSH-PX) Комплект для обнаружения (партия №: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Youxuan Biotechnology Co., Ltd.); HOECHST33258 Набор из окрашивания апоптоза (партия №: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); JC -1 окрашивание
Комплект для обнаружения потенциалов митохондриальной мембраны (партия №: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Дихлорфлуоресцеин диацетат (DCF-DA) клетки-реактивные формы кислорода (АФК) Реагент обнаружения
Комплект (Лот №: 20231225, Пекин Solebow Technology Co., Ltd.); Моноклональное антитело TLR4, фосфорилированный ядерный фактор-κB P65 (фосфо-NF-κB P65, P-NF-κB P65) Моноклональное антитело (Лот №: 10032512, 00128965, Wuhan Sanying Biotechnology Co., Ltd.).

ICS5000-ионный хроматограф, считыватель микропланшета Mul-Tigo (Thermo Fisher, США); PowerPac HC+Mini Protein Electrophores Electrophores Intustry (Biorad, USA); Инвертированный микроскоп TS2 (Nikon, Япония); Lc -10 высокопроизводительный жидкий хроматограф, ri -20 дифференциальный детектор (Shimadzu Technology Co., Ltd., Japan); 105-103-101 (8 мм × 300 мм) Tandem Gel Column (BRT Company, UK); CPA225D Электронный баланс, Eppendorf5424 Centrifuge (Sartorius, Германия).

 

1.2 Экспериментальные методы
1.2.1 Определение общего содержания сахара, мороновой кислоты и белка в CDP

Метод следовал в соответствии со ссылкой [14]. Общее содержание сахара в CDP определяли методом фенол-сульфуриновой кислоты; Содержание уроновой кислоты в CDP определяли методом M-гидроксибифенил колориметрий; и содержание белка в CDP определяли с помощью блестящего синего метода Coomassie.

 

1.2.2 Определение молекулярной массы

Молекулярное распределение полисахаридов было обнаружено с помощью высокопроизводительных гелевых хроматографических колонн. Серия стандартного dextran (dextran p {{0}}, p -10, p -20, p -50, p -100, p -200, p -400} и p {7 {7 {7} {7} {7} {7} {7} {7}} {7}}}}}}}}}}}}}}) 0. 0 5 моль/л перед использованием. Окончательная концентрация составляла 5 мг/мл, вихрела для растворения и центрифугирована при 12 0 00 r/мин в течение 10 минут. Супернатант аспирировали и отфильтровали с микропористой мембраной 0,22 мкм. После высокоскоростного центрифугирования в качестве подвижной фазы использовали 0,05 моль/л NaCl. Хроматографический столбец был BRT 105-103-101 (8 мм × 300 мм); Скорость потока составляла 0,7 мл /мин; Температура столбца: 40 градусов; Объем впрыска: 25 мкл; Детектор: дифференциальный детектор Rid -20 a; Время анализа: 62 мин. Выберите вышеуказанный хроматографический метод для анализа, получите время удержания и постройте логарифм пиковой молекулярной массы (MP) на ординате (LGMP) и время удержания (RT) на Abscissa (LGMP-RT). Стандартная кривая: в соответствии с вышеуказанным методом, средняя молекулярная масса (МВт) Стандартная кривая удержания (МВт) Стандартная кривая LGMW-RT и средняя средняя молекулярная масса (MN) Стандартная кривая LGMN-RT была сделана для получения молекулярной массы. Формула расчета. Заменив время удержания образца в формулу, можно получить молекулярную массу (MP, MW, MN).

1.2.3 Моносахаридный состав

Моносахаридный состав определяли с использованием ионной хроматографии. Take appropriate amounts of 16 monosaccharide standards (fucose, rhamnose, arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose, fructose, ribose, galacturonic acid, glucuronic acid, aminogalactose hydrochloride) , glucosamine hydrochloride, N-acetyl-D-glucosamine, guluronic acid, mannuronic acid) were added with 2 mL из 3 моль/л трифторуксусной кислоты (TFA), гидролизованной при 120 градусов в течение 3 часов, высушенной с азотом и добавлено для удаления вихря деионизированной воды для хорошо смешивания и подготовки стандартного запаса раствора. Возьмите каждый стандартный раствор моносахарида и точно подготовьте стандарт концентрации в качестве смешанного стандарта. Согласно методу абсолютного количественного определения, были определены массы различных моносахаридов, и молярное соотношение рассчитывали на основе молярной массы моносахаридов.
Добавьте 2 мл 3 моль/л TFA в полисахарид и отреагируйте при 12 0 степень в течение 3 часов. Во время реакции N2 использовали для защиты. Растворить после испарения под уменьшенным давлением. Добавьте 5 мл воды и вихрь в смешивание. Возьмите 5 0 мкл и добавьте 950 мкл деионизированной воды. Центрифуга при обороне в течение 5 минут. Супернатант фильтровали через микрофильтрационную мембрану 0,22 мкм и анализировали с помощью ионной хроматографии. Колонкой была Dionex CarboPactm PA20 (3 мм × 150 мм); Мобильная фаза была: H2O; B: 15 моль/lnaoh; C: 15 моль/ л NaOH и 100 моль/ л NAAC; Скорость потока: 0,3 мл/мин; Объем впрыска: 25 мкл; Температура столбца: 30 градусов; Детектор: электрохимический детектор; Градиент элюирования См. Таблицу 1.

 

Таблица таблицы элюирования мобильного градиента мобильной фазы

 

 

1.2.4 Обнаружение инфракрасного спектра

Взвешивайте 1 мг сухого полисахарида и порошка KBR, измельчите и перемешайте их в растворе и нажмите на тонкие простыни, используя таблетку. Анализ проводили с использованием инфракрасного спектрометра преобразования Фурье в диапазоне волн 4500 ~ 400 см -1.

 

1.2.5 Защитное действие CDP на высокие глюкозу-индуцированные HK -2 клетки в диабетической нефропатии

1.2.5.1 HK -2 Cell Culture

После hk {{0} клетки были возрождены, они культивировали в полной среде, содержащей 10% бычьи плода, и 1% двойной антитела, а клетки помещали в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах, 5% CO2 и насыщенной влажности, чтобы придерживаться стены. Полем Когда клетки растут до 80% до 90%, они перевариваются с 0,25% трипсином и субкультуристом. HK -2 ячейки в фазе логарифмического роста использовали для последующих экспериментов.

 

1.2.5.2 Приготовление раствора в CDPS и концентрации дозирования.

Точно весите 3 0 мг CDP, добавьте 6 мл полной среды с высокой глюкозой MEM, чтобы подготовить раствор CDPS 5 мг/мл и сохранить его в холодильнике с 4 градусами. При использовании измерьте определенный объем материнского раствора CDP, добавьте культуральную среду, хорошо перемешайте, стерилизуйте с помощью стерильного фильтра 0,22 мкм и приготовьте раствор для образца с соответствующей концентрацией.

 

1.2.5.3. Влияние CDP на нормальные hk -2 ячейки

HK -2 ячейки в фазе логарифмического роста высевали в 96- скважины на плотности 3000 ячеек/скважины. Согласно предварительным результатам эксперимента, клетки были разделены на нормальную контрольную группу (контрольная группа, CON), различные массовые концентрации (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 мкг/мл)
Была установлена ​​пустая группа, содержащая только культуральная среда; После культивирования с культуральной средой или лекарств в течение 24 часов и 48 часов добавляли 100 мкл культуральной среды, содержащей 10% CCK -8, и клетки инкубировали при 37 градусах, чтобы избежать ухода на свету в течение 1,5 часа. Оптическая плотность (OD) каждой скважины измерялась на длине волны 450 нм с использованием считывателя микропланшетов, а жизнеспособность клеток (%) рассчитывали в соответствии с формулой «Жизнеспособность клеток (%)=[(OD препарата скважина - od off Well) (OD контрольной скважины / od - od offers obless of -lectivels of -alcome and x x 100%haly x 100%», и ячейка, и оценивается в ячейки, и оценивается в ячейки и оценивающуюся ячейки и оценивающуюся ячейки и оценивающуюся ячейки и оценивающуюся ячейки и оценивающуюся ячейки. нормальные клетки.

1.2.5.4 HK -2 Cell High Glucose Modeling Time и скрининг концентрации
Приготовьте раствор запаса глюкозы (глюкоза, GLC) (10 мг/мл) и разбавьте его полной культуральной средой до концентрации моделирования 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 ммоль/л соответственно для использования. HK -2 ячейки в фазе логарифмического роста высевали в 96- скважинах на 3000/лунке, а CON, модельная группа (модель, мод), и были созданы пустая корректировка и задавалась полная культуральная среда и среду культивирования глюкозы различных концентраций, соответственно. , равное количество полной культуральной среды, культура в течение 24 часов и 48 ч и обнаруживает жизнеспособность клеток в соответствии с методом в разделе «1.2.5.3».

 

1.2.5.5. Влияние CDP на выживаемость модельных ячеек

В соответствии с экспериментальными результатами «1.2.5.4», HK -2 в фазе логарифмического роста высевали в 96- скважинах на плотности 3000 ячеек на лунку. Клетки разделяли на CON, MOD и различные массовые концентрации 50, 100 и 200 клеток культивировали при 400 мкг/мл, 400 мкг/мл и 800 мкг/мл CDP. Была установлена ​​группа по регулированию без ячеек. Группы регулировки CON и пустых регулировки были добавлены с равным количеством полной среды. MOD и каждую группу, получавшую лекарство, добавляли с 60 ммоль/л GLC и культивировали в течение 24 часов. , отбросьте культуральную среду, добавьте культуральную среду или соответствующие лекарства и культуру в течение 24 часов и 48 часов, и обнаружите скорость выживаемости клеток в соответствии с методом «1.2.5.3».

 

1.2.5.6. Влияние CDP на показатели окислительного стресса в модельных клетках

According to the results of the experiment in "1.2.5.5", the cells were divided into Con, Mod, high dose CDPs group (CDPs-H, 400 mg/kg), middle dose CDPs group (CDPs- M, 200 mg/kg), low-dose CDPs group (CDPs-L, 100 mg/kg) and dapagliflozin group (Dapa, 10 μmol/L), and a blank group without cells was set up In Группа нулевой регулировки, после моделирования, культуральной среды или соответствующих лекарств, добавляли и культивировали в течение 24 часов. Белки собирали, и лизаты были нормализованы до одного уровня путем коррекции концентрации белка. Согласно инструкциям каждого набора индикаторов, были обнаружены MDA, содержание GSH-PX и активность SOD в каждой группе клеток.

 

1.2.5.7 Обнаружение АФК в hk -2 ячейки

Добавьте суспензию ячейки в 6- скважинную пластину и поместите ее в инкубатор клеточной культуры, пока клетки не вырастут в монослой и получите соответствующую стимуляцию. Промывайте клетки 3 раза предварительным охлаждением PBS и разбавляют бессывороточную среду MEM. Флуоресцентный краситель DCF-DA разбавляли до конечной концентрации 10 мкмоль/л. Краситель добавляли в скважину 6-, клетки промывали 3 раза с предварительным охлаждением PBS, а флуоресцентный краситель DCFH-DA разбавляли до конечной концентрации 10 мкмоль/л бескластной средой MEM. µmol/l, краситель добавляли в скважину 6-, краситель отбрасывали, клетки трижды промывали бессывороточной средой, а затем изображения собирали под флуоресцентным микроскопом.