Исследование нейроэндокринно-иммунной функции Cistanche Deserticola и продуктов его переработки рисового вина на глюкокортикоид-индуцированной крысиной модели - Ⅱ

3.2.4. Иммуногистохимия

Апоптоз нейронов контролируется многими апоптотическими и антиапоптотическими генами, в основном геном, способствующим апоптозу Bax, и антиапоптотическим генами семейства генов Bcl-2. Bcl-2 локализуется в органеллах, продуцирующих активный кислород, таких как митохондрии, эндоплазматический ретикулум и ядерные мембраны. Bcl-2 мало влияет на свободные радикалы кислорода, но можетпредотвратить окислительное повреждение клеток. Бакс транспортируется из цитоплазмы на мембрану митохондрий, изменяет структуру мембраны митохондрий, способствует высвобождению цитохрома с и индукции апоптоза.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В цитоплазме надпочечников наблюдалась экспрессия белков Bax и Bcl-2. Окрашивание показало все желтые частицы. По сравнению с группой БК средняя оптическая плотность белка Bax в группе МС достоверно увеличилась (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

На рис. 5(б) показано, что по сравнению с группой BC средняя оптическая плотность белка Bcl-2 в группе MC значительно снизилась (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Белок каспаза-3 в исходном виде в нормальных тканях локализуется преимущественно в цитоплазме и имеет низкую экспрессию. Положительные сигналы имеют бледно-желтый или коричневато-желтый цвет. По сравнению с группой BC экспрессия каспазы-3 в группе MC значительно увеличилась (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

В нормальных тканях экспрессия гена Fas была снижена, а положительный сигнал гибридизации in situ имел коричнево-желтый цвет. Как показано на рисунке 5(d), по сравнению с группой BC, средняя оптическая плотность белка Fas в группе MC увеличилась (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Белок FasL расположен преимущественно в клеточной мембране или цитоплазме, его положительные сигналы имеют коричневый цвет. По сравнению с группой BC средняя оптическая плотность гена FasL в группе MC достоверно увеличилась (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Результаты показали, что CD и WCD могутиндуцировать апоптоз воспалительных клетоки уменьшают повреждение надпочечников, способствуя экспрессии белка FasL и связыванию с белком Fas, активируя белок каспазы -3 и запуская каскад каспаз. Эффект группы WCD-HD был лучшим.

3.3. Определение иммунной функции

3.3.1. Индекс иммунных органов

По сравнению с группой БК коэффициент тимуса и индекс селезенки в группе МС достоверно снизились (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. Обнаружение субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови

Процент клеток CD4+ в верхнем левом квадранте и клеток CD8+ в правом нижнем квадранте в BC и каждой группе лекарств был выше, чем в группе MC. По сравнению с группой BC соотношение CD4+ThCD8+ значительно снизилось в группе MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Определение уровня IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α и IFN-C в сыворотке

На рисунке 8 показано, что по сравнению с группой БК уровень IL-6, TNF- и IFN-c значительно увеличился (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Результаты эксперимента по наблюдению за тканью Lymus под микроскопом

На рисунке 9 показано, что в группе БК присутствовало большое количество лимфоцитов. Лимфоциты и ретикулоциты располагались в центре рыхло с разбросанными круглыми или овальными тимоцитами. Некроза, воспалительной клеточной инфильтрации и аномальных изменений не было.

В группе МК отмечалось большое количество лимфоидно-некротической ткани с беспорядочным расположением лимфоцитов и ретикулоцитов в центре. Исчезали круглые или овальные тимоциты, наблюдалась массивная клеточная дегенерация или некроз, наблюдалась воспалительная клеточная инфильтрация с аномальными патологическими изменениями.

В группах БК морфологические характеристики лимфоцитов нормализовались, расположение центральных лимфоцитов и ретикулоцитов было практически нормальным. Округлые или овальные тимоциты восстановились, но осталось небольшое количество дегенеративных или некротических лимфоцитов и инфильтрирующих воспалительных клеток.

В группах WCD и группе PC морфологические характеристики лимфоцитов были лучше восстановлены. Лимфоциты и ретикулоциты в центре были хорошо выровнены, тимоциты округлой или овальной формы были практически нормальными, но оставалось небольшое количество инфильтрирующих и дегенеративных лимфоцитов.

3.4. Экспрессия генов белка CaM

Величину RQ (мРНК CaM - мРНК актина) рассматривали для проверки экспрессии мРНК CaM. RQ группы BC составил 1. Экспрессия мРНК CaM в гипоталамусе в группе MC значительно увеличилась (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Обсуждение

В Китайской фармакопее [2] зафиксировано, что ЦД и ВЦД могут использоваться в клинике как основные виды отварных насадок. После того, как его запарили рисовым вином,антивозрастной и тонизирующий эффект Ян почекбыли усилены. С помощью UPLC-QqQ-MS мы обнаружили количественные изменения в химической материальной базе в процессе пропаривания рисового вина. Иридоидные гликозиды были нестабильны, и содержание этих гликозидов снижалось и даже становилось неопределяемым. Изменилось также содержание фенилэтанолгликозидов, что могло вызвать изменение фармакодинамики и клинического эффекта.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Классическая модель дефицита Ян в почках была воспроизведена путем подкожной инъекции кортикостерона [19]. Передозировка кортикостерона может ингибировать секрецию КРГ в гипоталамусе. Между тем секрет АКТГ также был ингибирован. Уровень гормона коры надпочечников снизился, и, таким образом, функция оси HPA была снижена. Гипофункция оси HPA является распространенной характеристикой дефицита Ян в почках [20]. Затем у крыс наблюдаются явления «истощения», и симптомы соответствуют симптомам недостаточности Ян в почках в клинике.

В группе MC уровень КРГ, АКТГ, Т и КОРТ в сыворотке крыс достоверно снизился (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Модуляция доли членов семейства Bcl-2 является одним из основных механизмов, с помощью которых FasThFasL опосредует путь рецептора смерти, а семейство Bcl-2 регулирует митохондриальный путь [21]. Фактор, ингибирующий апоптоз Bcl-2, и факторы, индуцирующие апоптоз, такие как Bax, принадлежат к семейству Bcl-2 [22]. Апоптоз клеток можно определить по относительному соотношению факторов, ингибирующих апоптоз, и факторов, индуцирующих апоптоз [23]. Митохондрии выполняют функцию центральных контрольных точек для многих форм апоптоза [24]. Настоящее исследование показало, что CD-MD и WCD могут определять экспрессию Bax и увеличивать Bcl-2 доулучшить дефицит Ян в почках. Fas является основным рецептором смерти, который индуцирует апоптоз путем связывания с лигандом Fas (FasL) [25]. Экспрессия Fas и FasL в группе MC увеличилась, тогда как в группе WCD-MD эта экспрессия значительно увеличилась (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Дефицит иммунной функции является одним из важных проявлений Ян-дефицита почек [28]. В данном исследовании мы обнаружили, что показатели селезенки и тимуса в группе WCD-MD достоверно восстановились (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

Ось HPA является наиболее важной регуляторной системой, поскольку она регулирует секрецию глюкокортикоидов и эндокринную систему для поддержания секреторной функции коры надпочечников [32]. Сверхэкспрессия мРНК CaM в ткани гипоталамуса была связана с дефицитом ян почек. CD и WCD могут блокировать кальциевые каналы, ингибировать экспрессию мРНК CaM в гипоталамусе и уменьшать приток кальция, тем самым снижая активность комплекса Ca2+·CaM.

Формирование дефицита Ян в почках является процессом развития хронического заболевания. Почка уже не является чисто анатомическим понятием, а является общим термином для обозначения нейроэндокринно-иммунной и мочеполовой систем. Нейроэндокринно-иммунная (НЭИ) сеть представляет собой важную интегрированную регуляторную систему [33]. CD и WCD могут регулировать функцию оси HPAT и улучшать восстановление Ян-дефицита почек. Этот результат обеспечивает экспериментальную основу для клинической профилактики и лечения дефицита Ян в почках.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%