Исследование нейроэндокринно-иммунной функции Cistanche Deserticola и продуктов его переработки рисового вина на крысиной модели, индуцированной глюкокортикоидами - Ⅰ

1. Введение

Цистанхе пустынная, который называют «женьшенем пустыни», — это традиционная китайская медицина, которая веками использовалась в качестве ян-тонизирующей травы дляактивизация почек и усиление Ян[1]. Восемь видов и одна вариация.Цистанхе Херба были зарегистрированы в Китае и толькоЦистанхе пустыннаяYC Ма иЦистанхе трубчатая(Schenk) Wight зарегистрированы в Китайской фармакопее [2]. Фармакологические исследования показали, чтоЦистанчес Хербаобладает нейропротекторным [3], иммуномодулирующим [4], кардиопротекторным [5], противоусталостным [6], противовоспалительным [7], гепатопротекторным [8], антиоксидантным [9], антибактериальным [10], слабительным [11] и противоопухолевым действием. эффекты [12]. Широкий спектр зарегистрированной биологической активности этого рода объясняется его сложным и разнообразным фитохимическим составом.Цистанхе пустыннаясодержит фенилэтанолгликозиды, иридоиды, полисахариды [13] и др. Содержание фенилэтанолоидных гликозидов наиболее высокое в оригинальном лекарственном сырье [14].

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ПОЧЕК PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обработка китайской Материи медики (СММ) — это традиционный фармацевтический метод, позволяющий удовлетворить различные требования к лечению, дозированию и изготовлению препаратов в соответствии с теорией традиционной китайской медицины. Эти обработанные продукты называются кусочками отвара, которые используются в клиниках. Обработка направлена ​​на повышение эффективности и снижение токсичности необработанных лекарств. В Китайской фармакопее 2015 года зафиксировано, что толстые ломтики цистанха (CD) и цистанхе, приготовленный на пару из рисового вина (WCD), можно использовать в качестве отваров в клинике. Наша исследовательская группа показала, что слабительный эффект ослабевает, а омолаживающий и бодрящий эффект для почек усиливается после того, как цистанхе запаривают рисовым вином [15].

При синдроме почечно-ян-дефицита нарушается функция оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники-вилочковая железа (ГПАТ) [16]. Пациенты с дефицитом Ян в почках также имеют обширную иммунную дисфункцию. Дисфункция оси HPA тесно связана с иммунодефицитом. Теория нейроэндокринно-иммунной сети (NEI) показывает, что иммунная и нейроэндокринная системы имеют много общих лигандов и рецепторов [17], а гипоталамус считается стержнем, связывающим нейроэндокринную систему с иммунной системой.

В этом исследовании мы воспроизвели дефицит Ян в почках у модельных крыс с инъекцией экзогенных кортикостероидов и исследовали механизм дефицита Ян в почках в ответ на различные обработанные продукты Cistanche Deserticola с точки зрения эндокринно-иммунной функции.

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы и реагенты

Cistanche Deserticola была собрана в Алашане Нэймэнгу в 2019.5 году и идентифицирована как высушенные мясистые стебли Cistanche Deserticola YC Ma профессором Яньцзюнь Чжаем (Фармацевтический факультет, Ляонинский университет традиционной китайской медицины, Китай). Образцы ваучеров хранились в Технологическом центре обрабатывающей промышленности Ляонин.

Стандартные соединения аюгола были приобретены у Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Чэнду, Китай); цистанозид F,эхинакозид, цистанозид А и изоактеозидбыли приобретены у компании Must Company (Сычуань, Китай); актеозид был приобретен у компании Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Далянь, Китай). Ацетонитрил и метанол марки MS были приобретены у Merck KGaA (Дармштадт, Германия). Муравьиную кислоту класса ВЭЖХ приобретали у компании Merck KGaA (Дармштадт, Германия). Рисовое вино было приобретено у компании Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Чжэцзян, Китай).

Кортикостерон (CAS: 50-22-6, чистота > 98 %, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), таблетки chinkuei shin Chevan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), крысиный АКТГ, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 и IL-10 наборы ELISA для обнаружения были приобретены у Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Набор ELISA для крысиного кортизола был предоставлен BOSK Co., крысиное антитело CD4, антитело CD8a (номера 561833 и 559976), лизат эритроцитов (Solarbio, R1010), буферный раствор PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM и -актиновые предшествующие и последующие праймеры были предоставлены компанией Guangzhou Invitrogen Co. Набор для обратной транскрипции (№ RR037A) и набор для синтеза кДНК (№ 10000068167) были предоставлены компанией Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Хлороформ, изопропанол, 75% этанол и уретан Все растворы были аналитически чистыми и производились компанией Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Сверхчистую воду получали с помощью системы Milli-Q (18,2 МОм, Millipore, Массачусетс, США).

2.2. Экспериментальные инструменты

Ферментный маркер (Термо, модель 3530911931), автоматическая моечная машина для планшетов (модель HBS- 4009), двухтактный измеритель силы с цифровым дисплеем (модель VICTOR- 50N), высокоскоростная морозильная центрифуга (модель Sigma 3k15). ), ультрамикроспектрофотометр (модель B-50Q), усилитель гена (модель L96G), флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времени (модель StepOne), проточный цитометр (модель AC66051710132), парафиновый микротом (модель Laika), микроскоп (Olympus) , модель BS-53) и прибор для чистой воды (модель F7JA36507).

2.3. Подготовка образцов для UPLC-Q-TOF-MS и фармакологических экспериментов

WCD был обработан из той же партииЦистанхе пустыннаяв нашей лаборатории. Для приготовления WCD сухие кусочки CD (толщиной 5 мм) (100 г) заливали рисовым вином (30 мл), пропаривали при высоком давлении (1,25 кПа) в течение 4 часов, а затем сушили при 55 градусах.

Грубые порошки ЦД и ВЦД замачивали 10 95%-ный этанол в течение 0,5 ч, кипятили с обратным холодильником 3 раза по 1 ч, фильтровали и фильтраты 3 раза объединяли. Этанол восстанавливали при пониженном давлении и экстракт получали для введения. Экстракт (1 мл) добавляли к 50% метанолу, доводя общий объем до 20 мл, и хранили при 4 градусах для анализа содержимого.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Условия UPLC-QqQ-MS для анализа экстрактов CD и WCD

2.4.1. Аналитические условия LCThMS

Для сбора и обработки данных использовалась система UPLC-MSThMS с программным обеспечением MassLynx 4.1 Analyst. Аналитическая колонка представляла собой Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}0 мм × 2,1 мм, 1,7 мкм) при температуре 40 градусов C. Подвижная фаза представляли собой 0,1% водный раствор муравьиной кислоты (А) и ацетонитрил, содержащий 0,1% муравьиной кислоты (Б). Градиент элюирования составлял 0,00–1,00 мин с 3% B, 1,01–2,00 мин с 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} мин с 12 % B, 3,01–4.00 мин с 15 % B, 4,01–5.00 мин с 20 % B, 5,01–6.00 мин с 22 % B, 6,01–8,00 мин с 25 % B и 8,01–9,00 мин с 10 % B. Скорость потока составляла 0,3 млTh мин, а объем инъекции — 1,0 мкл.

Тройной квадрупольный масс-спектрометр Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Милфорд, Массачусетс, США), оснащенный источником ионизации электрораспылением (ESI), использовали в режиме отрицательных ионов. Газом для десольватации был азот с расходом 500 л/ч при температуре 250 градусов. Все обнаруженные соединения измеряли в режиме мониторинга множественных реакций (MRM); В таблице 1 приведены энергетические параметры, а в таблице 2 — калибровочные кривые анализируемых компонентов.

2.4.2. Приготовление эталонных веществ

Тубулозид А (3,02 мг), эхинакозид (3,00 мг), 2'-ацетилактеозид (2,34 мг), актеозид (2,45 мг), изоактеозид (0,61 мг), цистанозид F ( 2,14 мг), салидрозид (3,39 мг), генипозидовую кислоту (2,84 мг), адьюгол (1,58 мг) и каталпол (2,39 мг) растворяли в метаноле для приготовления исходного раствора. Исходный раствор разбавляли метанолом для получения соответствующих концентраций рабочих стандартных растворов. Все приготовленные растворы перед использованием хранили при температуре 4 градуса.

2.5. Подготовка и группировка моделей животных

Крысы-самцы SD (180–220 г) были приобретены у Liaoning Changsheng Biotechnological Co., номер разрешения на животное: SCXK (Liao) 2015–0001. Всех крыс содержали при свободном доступе к пище и воде при температуре 25 градусов и относительной влажности 30–50%. Перед экспериментами животных содержали в течение 7 дней.

Сто крыс случайным образом разделили на 1 0 группу: группу пустого контроля (BC), группу модельного контроля (MC), группу положительного контроля (PC), группу контроля рисового вина (WC), группу высокой дозы CD (CD). -HD), группа средней дозы CD (CD-MD), группа низкой дозы CD (CD-LD), группа высокой дозы WCD (WCD-HD), группа средней дозы WCD (WCD-MD) и Группа низких доз WCD (WCD-LD). Дозы CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD и CD-LDThWCD-LD составляли 5,48 гТ (кг ∙ сут), 2,74 гТ (кг ∙ сут) и 1,37 гТ (кг ∙ сут) соответственно. Доза для группы ПК составляла 1,646 гТл(кг∙сут), а для группы WC - 1 млТх100 г в течение 40 дней. На 6-й день после введения крысам подкожно вводили водную суспензию кортикостерона (кортикостерон + 0,1% диметилсульфоксид + 0,1% Твин-80 + 0,9% натрия хлорид), за исключением для группы BC [18]. Концентрация кортикостерона составляла 5 гТл, доза – 0,1 млТх100 г. Крысам в группе BC вводили физиологический раствор + 0,1% диметилсульфоксида + 0,1% Твина- 80 + 0,9% хлорида натрия путем инъекции в той же дозе.

2.6. Определение функций оси HPA

2.6.1. Испытание на вес, температуру и удерживающую способность

Весовой тест проводили каждые 3 дня, а температуру измеряли каждые 6 дней. во время эксперимента. На 39-й день с помощью измерителя хвата измеряли максимальную силу задней конечности. Крыс помещали на гладкие платформы, заставляя задние конечности хвататься за шест. Крысы будут инстинктивно хватать любой предмет, чтобы не двигаться назад, когда их тянут за хвост, пока сила тяги не превысит силу захвата. Когда крыса теряла хватку, предусилитель мог автоматически регистрировать максимальную силу хватки.

2.6.2. Определение уровня Т, КРГ, АКТГ, КОРТ и кортизола в сыворотке

Через час после последнего введения крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией раствора уретана (20 гTh100 мл). Затем собирали образцы крови, центрифугировали при 3500 об в течение 15 мин для получения сыворотки и хранили при -20 градусах. Концентрации Т, КРГ, АКТГ, КОРТ и кортизола измеряли с помощью наборов ИФА для крыс в соответствии с инструкциями производителя.

2.6.3. Наблюдения под микроскопом

Морфологическую структуру ткани надпочечников изучали методом окрашивания HE. Ткань надпочечников фиксировали в 10% параформальдегиде, обезвоживали в этаноле, делали прозрачным раствором ксилола, заливали традиционными методами, разрезали на срезы толщиной 4 мкм, депарафинизировали раствором ксилола, гидратировали градиентом этанола, а затем окрашивали гематоксилином и эозином. раствор для окрашивания. После того, как пластинку сделали прозрачной с помощью ксилола, ее запечатали нейтральной смолой и наблюдали под микроскопом.

2.6.4. Иммуногистохимическое окрашивание экспрессии белков Bax, Bcl-2, каспазы-3, Fas и FasL в надпочечниках

Фиксированные формалином и залитые парафином срезы надпочечников крысы депарафинизировали и регидратировали после разреза толщиной 4 мкм. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы срезы предварительно инкубировали в блоке перекиси водорода в течение 10 мин. Срезы погружали в 0,01 М цитрат (рН 6,0) и нагревали до кипения. Процедуру повторяли через 5–10 мин. После охлаждения срезы промывали PBS (рН 7,2–7,6) 1–2 раза, оставляли при комнатной температуре примерно на 5 мин и промывали PBS (рН 7,2–7,6) 2–3 раза. Добавляли 5%-ный блокирующий раствор БСА при комнатной температуре и через 20 мин стряхивали лишнюю жидкость со среза. Добавляли разбавленные первичные антитела, специфичные к FasTh FasL, Bcl-2ThBax и каспазе-3 (разбавленные PBS 1:100), и инкубировали при 37 градусах в течение 1 часа или при 4 градусах в течение ночи. Срезы промывали 2–3 раза PBS (рН 7,2–7,6). Затем добавляли биотинилированный козий антимышиный IgG, срезы сушили при 20–37° в течение 20 мин и промывали PBS (рН 7,2–7,6) 4 раза по 5 мин. После тщательной промывки в PBS срезы инкубировали со смесью реагентов A и B в течение 30 минут, инкубировали в PBS в течение 45 минут и, наконец, проявляли субстратом DAB (DAKO) в течение 30 минут, а затем слегка докрашивали гематоксилином, обезвоживали и и смонтирован.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УСИЛЕНИЯ СЕКСУАЛЬНЫХ ЧУВСТВЕНИЙ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Определение иммунных функций

2.7.1. Расчет индекса иммунных органов

Через час после последнего введения крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией раствора уретана (20 гTh100 мл), затем удаляли селезенку и вилочковую железу и немедленно взвешивали в стерильном колпаке. Весовые коэффициенты селезенки или тимуса (%) � Масса селезенки или тимуса (мг) Масса тела (г).

2.7.2. Обнаружение субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови

Спленоциты и гемоциты инкубировали с моноклональными антителами анти-CD4 (PE) и анти-CD8 (FITC) в течение 30 мин в темноте. Добавляли 2 мл лизата эритроцитов и раствор перемешивали встряхиванием. Раствор оставляли в темноте на 10 мин и центрифугировали 5 мин. Супернатант отбрасывали, а затем раствор промывали 3 раза ледяным PBS и ресуспендировали в пермеабилизирующем растворе PBS. По меньшей мере 10,000 клеток анализировали с помощью проточной цитометрии в течение 1 часа после каждого окрашивания Mab.

2.7.3. Определение уровня IL-10, IL-6, IL-2, TNF- и IFN-c в сыворотке

Через час после последнего введения крыс анестезировали внутрибрюшинным введением раствора уретана (20 гТ100 мл) и брали кровь из брюшной аорты. Кровь центрифугировали при 3500 об в течение 15 мин для получения сыворотки и хранили при -20 градусах. Концентрации IL-10, IL-6, IL-2, TNF- и IFN-c определяли с помощью наборов ИФА для крыс в соответствии с инструкциями производителя.

2.8. Экспрессия CaM в тканях гипоталамуса и гипофиза

Тотальную РНК экстрагировали из тканей гипоталамуса и гипофиза с помощью TRIzol. Обратная транскрипция проводилась на 10 мкл тотальной РНК согласно инструкции производителя. Равные количества кДНК анализировали методом кПЦР в присутствии красителя, связывающего дцДНК (Promega, США) и системы ПЦР в реальном времени CFX 96 (Bio-Rad, США) для изучения различных генов в условиях начальной активации при 95 градусов в течение 10 минут, 40 циклов денатурации при 95 градусах в течение 15 секунд и удлинение отжига при 60 градусах в течение 1 минуты.

Праймеры для CaM и -актина приведены в таблице 1, а -актин использовался в качестве внутреннего контроля. Каждый образец нормализовали, используя разницу критических порогов (Ct) между целевым геном и -актином. Для описания результата использовали следующее уравнение: ΔΔCt (ген-мишень Ct - ген Ct-актин) экспериментальная группа - (ген-мишень Ct - ген Ct-актин) контрольная группа. Затем уровни мРНК в каждом образце сравнивали с использованием экспрессирующего гена-мишени 2- ΔΔCt. Результаты каждой группы были усреднены (табл. 3).

2.9. Статистический анализ

Все данные были проанализированы с использованием программного обеспечения SPSS (версия 19.0, SPSS Institute Inc., Чикаго, Иллинойс). Различия между группами анализировали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с повторными измерениями (ANOVA). Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение (SD) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 6.0, Сан-Диего, Калифорния, США). Различия со значением P менее 0,05 считались статистически значимыми.

3. Результаты экспериментов

3.1. UPLC-QqQ-MSАнализ

Чтобы добиться наилучшего разделения, формы пика и короткого времени анализа, в нашем предварительном эксперименте были изучены хроматографические условия, включая колонку, подвижную фазу и градиентную программу. Типичные хроматограммы в режиме MRM представлены на рисунке 1.

Из табл. 4 видно, что содержание фенилэтаноидных гликозидов в WCD увеличивается по сравнению с таковым в CD, особенно эхинакозида и актеозида, тогда как содержание иридоидов в WCD снижается.

3.2. Регламент функции оси HPA

3.2.1. Испытание на вес, температуру и удерживающую способность

У крыс группы MC и экспериментальных групп симптомы дефицита Ян в почках проявлялись постепенно после введения кортикостерона. Такие симптомы, как потеря веса, переохлаждение, потеря блеска волос, упадок духа, задержка реакции и значительное снижение потребления воды и активности, значительно улучшились в группах CD и WCD. На рисунке 2(а) показаны изменения веса. Вес каждой из групп препаратов увеличивался, особенно в группах CDHD и WCD-HD. Прибавка веса в группе MC была самой низкой. На рис. 2(б) показаны изменения температуры, которые были самыми низкими в группе MC, а температура повышалась в группах WCD-HD, WCD-MD и WCD-LD.

На рисунке 2(c) показано, что удерживающая способность увеличилась в группе BC и в каждой из экспериментальных групп, а группа WCD-MD была самой высокой, что продемонстрировало, что признаки слабости, вызванные дефицитом почек-ян, улучшились после введения.

3.2.2. Уровни Т, КРГ, АКТГ, КОРТ и кортизола

На рис. 3 показано, что по сравнению с группой БК в сыворотке крыс снизился уровень Т, КРГ, АКТГ и КОРТ (P < 0.01) и снизился уровень кортизола (P < 0.05) в группе MC. По сравнению с группой MC уровень Т в группах WCD-HD и WCD-MD увеличился (P < 0.01), уровень CRH в группах WCD-LD, Группы WCD-MD и WC улучшились (P < 0.01), содержание АКТГ увеличилось в группах CD-HD, WCD-MD и WCD-HD (P < 0,01), уровень CORT повысился в В группах CD-MD, WCD-MD и WCD-HD (P < 0,01) и повышался в группах CDHD и WCD-LD (P < 0,05), а уровень кортизола повышался в каждой из групп препарата.

3.2.3. Результаты микроскопических наблюдений

Ткань надпочечников можно разделить на корковый слой и мозговой слой. Кортикальные слои включают глобулярный, пучковый и ретикулярный слои. Клетки содержат больше липидов, а мозговой слой состоит преимущественно из клеток феохромоцитомы и небольшого количества фиброзной ткани. Как показано на рисунке 4, мы обнаружили, что в группе BC все было нормально, тогда как в группе MC кора надпочечников имела очевидную гиперплазию, клеточную атрофию и увеличение плотности. Луковицеобразная полоска утолщалась, а полупрозрачная фасцикулярная зона, узкая сетчатая зона и более мелкие клетки имели неравномерную окраску и застой капилляров. В группе ПК были видны кортикальные и медуллярные границы. Клетки глобулярных и пучковых тяжей располагались равномерно, морфологическая структура восстанавливалась. Такое же лучшее восстановление наблюдалось в группах WCD, а эффекты в группе WCD-MD были лучше, чем в группах WCD-HD и WCD-LD. Морфология надпочечников в группах CD была не такой хорошей, как в группах WCD.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%