Преимущества актеозида - лечение глиобластомы

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

ТЭ УН ХВАН, ДОН ХУН КИМ; ДА БИ КИМ1, ТЭ ВОН ЧАН, ГУН-ХВА КИМ, МИНХО МУН, КЬЮН А ЮН, ДЭ ЫН ЧО, ЧЖЭ ХО ПАК, ДЖВА-ДЖИН КИМ

1. Введение

глиобластомаявляется наиболее распространенным типом злокачественной первичной опухоли головного мозга и наиболее инвазивной и разрушительной первичной опухолью головного мозга (1,2) со средней выживаемостью около 18 месяцев при агрессивной мультимодальной терапии. Текущие решения по лечению ограничены и включают лучевую терапию, химиотерапию и хирургическое вмешательство в сочетании с алкилирующим агентом темозоломидом (ТМЗ) (3,4). Несмотря на доступность агрессивной терапии, у пациентов сглиобластомакак правило, имеют плохой прогноз (5). ТМЗ является основным химиотерапевтическим препаратом, используемым для клинического лечения злокачественных новообразований.глиобластома(6‑8); в качестве алкилирующего агента в ряду он способен проникать через гематоэнцефалический барьер (9-11). Во время прогрессирования злокачественной глиобластомы и обширной инвазии в головной мозг неуклонно возрастающая лекарственная устойчивость к ТМЗ снижает его терапевтическую эффективность (12,13). Соответственно, новые терапевтические препараты для противодействияглиобластомасрочно разыскиваются.

В предыдущих исследованиях сообщалось, что клетки глиомы подвергаются клеточной гибели посредством аутофагии или запрограммированной гибели клеток типа II в ответ на TMZ (14,15). Аутофагию можно ингибировать 3-метиладенином (3-МА) путем превращения ассоциированного с микротрубочками белка 1 легкой цепи 3 (LC3)-I в LC3-II, что снижаетглиобластомагибель клеток (16,17); однако роль аутофагии зависит от клеточного контекста. За исключением цитотоксической роли во время действия TMZ, индукция аутофагии клеточным стрессом является цитопротекторным процессом, который устраняет индуцированные стрессом цитоплазматические агрегаты, органеллы и макромолекулы в клетках млекопитающих через лизосомальную систему. В свою очередь, клетки, участвующие в поддержании гомеостаза, получают энергию посредством этих катаболических процессов (18,19). Сложная роль аутофагии предполагает, что активатор аутофагии может оказывать противораковое действие в сочетании с лечением ТМЗ, индуцируяглиобластомаклеточная аутофагия, не оказывающая вредного воздействия или оказывающая пользу нормальным тканям. Следует отметить, что ТМЗ продемонстрировал синергетический терапевтический эффект в сочетании с витамином D, включая подавление жизнеспособности клеток и усиление аутофагии вглиобластомаклетки. Кроме того, было показано, что комбинация TMZ и витамина D оказывает противораковое действие in vivo, включая уменьшение размера опухоли и увеличение выживаемости. Эти исследования показывают, что комбинированное лечение может оказывать синергетическое противораковое действие за счет механизмов аутофагии у пациентов с ТМЗ.глиобластоматерапия (15).

актеозидпредставляет собой фенилэтаноидный гликозид, широко распространенный в нескольких тонизирующих традиционных китайских лекарственных средствах на травах (20,21). Ряд фармакологических действий, включая антиоксидантное, противораковое, противовоспалительное, антинефритическое и антиметастатическое действие, был связан сактеозид(22‑24). Предыдущие исследования показали, чтоактеозидоказывает защитное действие против поражения печени, вызванного четыреххлористым углеродом и D-галактозамином. Механизмы, лежащие в основе защитных эффектов актеозида, вероятно, связаны с его способностью ингибировать опосредованную P450 биоактивацию и эффекты удаления свободных радикалов, вызванные воздействием четыреххлористого углерода (25, 26).

Таким образом, данные свидетельствуют о том, что обаактеозиди TMZ вызывают противораковые эффекты посредством гибели клеток. Однако их ассоциация и противораковые эффекты в контекстеглиобластомаосталось выяснить. Таким образом, целью настоящего исследования было проверить синергетические противораковые эффектыактеозидв сочетании с ТМЗ вглиобластоматерапия. Анализ жизнеспособности клеток был проведен для анализа противораковых эффектов комбинированного лечения в C6.глиобластомаклетки (крысаглиобластомаклеточная линия), и результаты сравнивали с результатами после лечения только ТМЗ. Для дальнейшего изучения механизма гибели клеток, вызванной совместным лечением сактеозиди TMZ, были исследованы гены, связанные с апоптозом и аутофагией, в клетках C6.

актеозид противоопухолевый

2. Материалы и методы

Культура клеток:

Крыса C6глиобластомаклеточную линию приобретали в Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд, США). Клетки культивировали в стерильных условиях при 37°C во влажной среде с 5% СО2 в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков и антимикотиков (все Welgene, Daegu). , Корея).

Растительный материал:

Abeliophyllum distichum Nakai [ваучер №. Park1001(ANH)] был собран в тематическом парке Misun-hyang, в горном рекреационном лесу Seongbul-Mountain, Корея.

Индукция каллуса:

Чтобы вызвать образование каллюса (27), из свежих растений выделили листовые эксплантаты площадью 1 см2. Эксплантат культивировали на среде Мурачиге и Скуга (4% сахарозы, 0,9% агара с добавлением 1 мг/л нафталин-уксусной кислоты и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, рН 5,7) при 25˚С. Каллюс был индуцирован через 20 дней. Достаточное количествоактеозидбыл получен путем пересева для разделения и очисткиактеозидиз мозоли (рис. 1). Различные партии очищенногоактеозидиспользовались в каждом эксперименте. Каждый эксперимент проводили трижды с использованием разных партий.

Выделение и очистка:

Этилацетатные фракции концентрировали в вакууме и использовали в качестве образца для очистки актеозида.актеозидвыделяли и очищали с помощью системы ускоренной хроматографической изоляции (Isolera™ Spektra, Biotage, Уппсала, Швеция) с использованием картриджей SNAP KPHOSPHO-SIL и SNAP Ultra (Biotage).актеозидочищенный от каллюса, количественно анализировали с использованием стандартного актеозида с помощью анализа ВЭЖХ-ФДА. Наконец, актеозид с чистотой выше или равной 95% был получен из мозоли и использован в качестве образца для химиотерапии препаратов на основе темозоломида.глиобластома.

Анализ 3-(4,5-диметилтиазол-2-1)-,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ):

Для определения полумаксимальной ингибирующей концентрации ТМЗ (значение IC50) в отношении клеток С6 1×104 клеток в суспензии одиночных клеток высевали в отдельные лунки 96-луночных планшетов и инкубировали в течение 24 ч при 37°C перед обработкой ТМЗ при указанной температуре. концентрации (1, 5, 10 и 20 мМ) при 37°С в течение 24 часов. После определения значения ТМЗ IC50 на уровне 5 мМ клетки обрабатывали в течение 24 ч 5 мМ ТМЗ, 50 мкМактеозидили их комбинация (5 мМ ТМЗ и 50 мкМактеозид). В каждую лунку (10 мкл) добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) и культивировали при 37°С в течение 2 часов. Затем среду удаляли и добавляли ДМСО в объеме 200 мкл каждого раствора и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Поглощение при 595 нм измеряли для определения жизнеспособности клеток.

Ранозаживляющий анализ:

Суспензию клеток С6 в 1 мл культивировали в 12-луночном планшете и выращивали до слияния. Клетки обрабатывали ТМЗ,актеозидили ТМЗ плюсактеозида затем поцарапать стерильным наконечником пипетки объемом 1 0 мкл, чтобы создать искусственную рану. Через 0 и через 24 ч после ранения с помощью инвертированного микроскопа были получены цифровые изображения процесса заживления раны. Миграцию клеток количественно определяли путем измерения размера рубца через 0 и 24 часа с использованием программного обеспечения для анализа изображений ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 (NIH, Bethesda, Мэриленд, США). Каждый эксперимент проводился трижды, и измерения проводились трижды.

Иммуноблоттинг:

Клетки C6 обрабатывали TMZ,актеозидили ТМЗ плюсактеозидв течение 24 часов. Клетки лизировали на льду буфером для лизиса RIPA (25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 15{8}} мМ NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS). с добавлением коктейля ингибиторов протеазы и фосфатазы (Roche, Базель, Швейцария) в течение 30 мин. После центрифугирования при 18 341 g в течение 15 мин при 4°C получали супернатант. Концентрацию белка определяли с помощью анализов белков Брэдфорда (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Равные количества общих белков (30 мкг) загружали в отдельные лунки и фракционировали с помощью электрофореза с помощью 10-15-процентного SDS-PAGE. Белки подвергали электропереносу на поливинилидендифторидные мембраны (EMD Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США). После инкубации в блокирующем растворе, содержащем 5% обезжиренного молока в физиологическом растворе Tween/Tris-буфера, в течение 30 минут при комнатной температуре. Блоты исследовали с помощью 000-разведенных первичных антител 1:1 (каталожный номер 9662, каспаза 3; Cell Signaling Technology, Inc., Дэнверс, Массачусетс, США), В0-клеточной лимфомы 2 (sc- 7382, Bcl-2), Bcl-2-ассоциированный белок X (кат. № 2772, Bax), фосфорилированный (p-)p53 (sc-101762), тотальный p53 (sc-6243), -актин (кат. № 4970; все; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Даллас, Техас, США), LC-3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Дармштадт, Германия), Rab7 (кат. № 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (кат. № 114), p-p38 (кат. № 9211), total-p38 (кат. № 9212), p-c-Jun N-концевая киназа (кат. № 9251, p ‑JNK), общая‑JNK (кат. № 9252), p‑киназа, регулируемая внеклеточным сигналом (кат. № 9101, p‑ERK), общая‑ERK (кат. № 9102; все Cell Signaling Technology, Inc.) .) на ночь при 4˚C. После этого проводили инкубацию со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:2,000; LF-SA8001A, Goat Anti-Mouse IgG-HRP) или LF-SA8002A (Goat Anti-Rabbit IgG-HRP), AB Frontier, Сеул, Корея) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем белки визуализировали с помощью Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США).

Иммунофлуоресцентное окрашивание:

Ассоциированный с лизосомами мембранный белок 1 (LAMP1) и LC3 являются маркерами лизосом и аутофагии. Клетки (1×105 клеток/лунку) готовили на стерилизованных покровных стеклах (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) в трех экземплярах. После лечения ТМЗ,актеозидили ТМЗ плюсактеозидв течение 24 ч клетки фиксировали в 4-процентном параформальдегиде в течение 30 мин, блокировали 5-процентным раствором нормальной куриной сыворотки (S-3000; Vector Laboratories, Inc., Берлингейм, Калифорния, США), 0,1-процентным раствором Triton X. -100, а затем инкубировали в течение 1 ч для пермеабилизации и блокирования неспецифических белок-белковых взаимодействий. Затем клетки инкубировали с анти-LAMP1 (1:200; sc-19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) и анти-LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, USA) в течение ночи при 4°С. С. Затем клетки дважды промывали PBS и инкубировали еще 2 ч в темноте со смесью вторичных антител Alexa Fluor 488 и 594 (1:200; Alexa Fluor 488 (A-11008) и 594 (A-11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США) и снова промывали PBS. Ядра окрашивали с использованием 4,6-диамидино-2-фенилиндола (Sigma; Merck KGaA), а затем дважды промывали PBS. Затем слайды были смонтированы, и изображения были получены под лазерным конфокальным микроскопом LSM-700.

Рисунок 1. Химическая структура актеозида.

Проточной цитометрии.

Клетки анализировали на наличие Mitotracker Green и MitoSOX методом проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACSCanto II, как указано производителем (BD Biosciences). После двух промывок PBS клетки фиксировали в 4-процентном параформальдегиде в течение 30 минут при комнатной температуре и пермеабилизировали 0,25-процентным раствором Triton X-100 в PBS в течение 20 минут. Клетки окрашивали первичными антителами в течение ночи при 4°С (1:200), а затем вторичными антителами в течение 1 ч на льду. После двух промывок PBS клетки фиксировали в 4-процентном параформальдегиде и немедленно анализировали. Данные проточной цитометрии были собраны с использованием 10 000 клеток и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo 7.6.1 (Tree Star, Inc., Ашленд, штат Орегон, США).

Статистический анализ:

Все данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism 5.0 и представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Данные были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом множественных сравнений Тьюки для сравнения средних значений между несколькими группами. п<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Цистанхе Эхинакозид: антиапоптоз

3. Результаты

3.1 Совместное лечение ТМЗ и актеозидом подавляетглиобластомапролиферация и миграция клеток.

Комбинированное лечение ТМЗ иактеозидингибирует жизнеспособность клеток С6. ТМЗ снижал жизнеспособность клеток дозозависимым образом (рис. 2А), тогда как сам по себе актеозид не оказывал значительного эффекта ни при каком уровне лечения (рис. 2В). После инкубации в культуральной среде, содержащей ТМЗ с актеозидом или без него, в течение 24 часов проводили анализ МТТ для сравнения цитотоксичности различных уровней обработки. ТМЗ значительно подавлял жизнеспособность клеток, тогда как актеозид существенно не подавлял рост клеток. Комбинированное лечение ТМЗ и актеозидом заметно снижало жизнеспособность клеток (рис. 2С). Лечение только ТМЗ или актеозидом снижало способность к заживлению ран (рис. 3А). Расстояние раны (в процентах) измеряли с использованием результатов, показанных на рис. 3А, с помощью программного обеспечения ImageJ. Расстояние между ранами значительно увеличилось после комбинированного лечения (рис. 3В) по сравнению с каждым отдельным лечением. Эти результаты показывают, что совместное лечение ТМЗ и актеозидом было эффективным ингибиторомглиобластомапролиферация и миграция клеток.

3.2 Актеозид и ТМЗ синергически влияют на апоптоз в клетках С6.

Результаты вестерн-блоттинга показали, что уровни расщепленной каспазы-3, Вах и фосфорилированного р53 были выше, а уровни Bcl-2 ниже после комбинированного лечения ТМЗ иактеозидчем после лечения только ТМЗ (рис. 4А).актеозидЗатем в обработанных ТМЗ клетках С6 наблюдали опосредованную митохондриальную функцию и образование активных форм кислорода (АФК), которые являются ключевыми медиаторами апоптотической передачи сигналов. Для проверки митохондриальной массы был проведен флуоресцентный анализ сортировки клеток с использованием MitoTracker Green. Совместное лечение с TMZ иактеозидпривело к более высокой митохондриальной массе, чем лечение только ТМЗ (рис. 4В). Генерация АФК была значительно выше после совместного лечения ТМЗ и актеозидом, чем после лечения только ТМЗ (рис. 4С). Эти результаты свидетельствуют о том, что образование АФК и функция митохондрий важны при апоптозе, вызванном обработкой ТМЗ плюс актеозид. Совместное лечение ТМЗ и актеозидом вызывает аутофагию в клетках С6. Сообщалось, что ТМЗ вызывает аутофагию (28, 29); поэтому в настоящем исследовании изучалась степень, в которой аутофагия индуцировалась обработкой ТМЗ плюс актеозид. Клетки C6 обрабатывали TMZ с актеозидом или без него; через 24 ч клетки окрашивали для иммунофлуоресценции для выявления LAMP1 и LC3 как маркеров аутофагии. Более высокие уровни экспрессии LAMP1 и LC3 наблюдались после комбинированного лечения (фиг. 5А). Также была исследована экспрессия белка, связанного с аутофагией, и было обнаружено, что TMZ индуцирует превращение LC3-I в LC3-II, что является признаком генерации аутофагосом. Более высокая скорость превращения LC3-I в LC3-II наблюдалась после совместного лечения ТМЗ и актеозидом, чем после лечения только ТМЗ. Уровни экспрессии Rab7 и p62 указывали на индукцию аутофагии в клетках, обработанных TMZ (фиг. 5B). Эти данные свидетельствуют о том, что совместное лечение ТМЗ и актеозидом усиливало аутофагический процесс углиобластомаклетки.

3.3 Актеозид индуцирует экспрессию гена пути MAPK при лечении на основе TMZ.

Предыдущие исследования показали, что TMZ регулирует путь MAPK, включая p38, JNK и ERK (30). Поэтому в настоящем исследовании изучалось,актеозидвлияет на экспрессию гена MAPK, связанную с TMZ. Клетки С6 обрабатывали ТМЗ с добавлением или безактеозид. Через 24 часа лечение ТМЗ привело к более высоким уровням экспрессии p-p38, p-JNK и p-ERK. Экспрессия генов, регулируемых ТМЗ, была значительно выше после лечения ТМЗ плюс актеозид, чем после лечения только ТМЗ (рис. 6). Эти наблюдения предполагают, чтоактеозидвлияет на терапевтические механизмы, основанные на TMZ, через путь MAPK.

Актеозид анти-глиобластома

Обсуждение

По результатам настоящего исследования установлено, что комбинированное лечение ТМЗ сактеозидпредлагает терапевтический потенциал дляглиобластомалечения и предоставить доказательства того, что химиосенсибилизация к комбинации TMZ иактеозидможет происходить за счет усиления аутофагии. В качестве мутацииглиобластомаклеток может привести к инактивации апоптотического пути, индукции аутофагии под действием ТМЗ плюсактеозидсовместное лечение может представлять собой альтернативный методглиобластоматерапия. Однако вопрос о том, является ли аутофагия единственным механизмомглиобластоматерапия ТМЗ плюсактеозидсовместное лечение еще предстоит выяснить.

Аутофагия является важным клеточным механизмом деградации белков и цитоплазматических органелл. Катаболическое преимущество индуцированной аутофагии может быть важным в стрессовых условиях; следовательно, индукция аутофагии может быть адаптивным механизмом предотвращения гибели клеток (31-33). Предыдущие исследования показали, что снижение аутофагии коррелирует с раком (34-36). Кроме того, некоторые белки и сигнальные пути, связанные с аутофагией, дерегулируются во время злокачественной трансформации, что приводит к снижению аутофагической активности. Высокий уровень экспрессии LC3 также был связан с повышенной выживаемостью пациентов сглиобластомас плохими показателями успеваемости (37,38). Точно так же результаты настоящего исследования показывают, что восстановление нормальной аутофагии может быть скрытой стратегией дляглиобластоматерапии и может служить механизмом ограничения аномального роста опухолевых клеток.

При нормальной аутофагии определенные цитоплазматические компоненты выделяются внутри аутофагосом, которые затем сливаются с лизосомой для деградации и повторного использования (39,40). Когда аутофагия усиливается, скорость образования аутофагосом превышает скорость лизосомной деградации; это состояние называется аутофагическим стрессом. Если стресс или аномальная аутофагия продолжаются, гибель клеток может произойти из-за истощения энергии или изменения баланса беклина-1/Bcl-2. Апоптоз также может быть вызван гиперактивностью аутофагосом, поглощающих цитоплазматические органеллы, включая митохондрии или эндоплазматический ретикулум (41). Было высказано предположение, что общая аутофагия может вызывать гибель клеток во время нормального обновления цитоплазмы и органелл в здоровых клетках. В этом процессе клетка «поедает» себя изнутри, что является ключевой характеристикой запрограммированной клеточной смерти II типа. Хотя механизмы, с помощью которыхактеозидусиливает терапевтический эффект препаратов на основе ТМЗглиобластоматерапии еще предстоит полностью выяснить, противораковые эффекты, проявляемые комбинированным лечением, изученным в настоящем исследовании, могут быть связаны с этими аутофагическими механизмами.

актеозидпредставляет собой фенилэтаноидный гликозид, полученный из растений (22,26). В предыдущих исследованиях сообщалось о различной биологической активности актеозида. Изменения уровней экспрессии расщепленной каспазы-3 и LC3 в настоящем исследовании демонстрируют, что лечение комбинацией TMZ иактеозидиндуцировали апоптоз и аутофагию в клетках С6 (рис. 4 и 5). Было показано, что комбинированное лечение оказывает синергетический эффект наглиобластомаклетки. Хотя другие возможные механизмы этих синергетических эффектов еще предстоит выяснить, в настоящем исследовании индукция аутофагии была определена как важнейший туморицидный механизмактеозидхимиосенсибилизация во время ТМЗ-на основеглиобластоматерапия.

Актеозид лечит глиобластому

использованная литература

1. Фридман Х.С., Керби Т. и Калверт Х. Темозоломид и лечение злокачественной глиомы. Clin Cancer Res 6: 2585-2597, 2000.

2. Мругала М.М. и Чемберлен М.С.: Механизмы заболевания: темозоломид иглиобластома- смотреть в будущее. Nat Clin Pract Oncol 5: 476–486, 2008.

3. Агарвала С.С. и Кирквуд Дж.М. Темозоломид, новый алкилирующий агент с активностью в центральной нервной системе, может улучшить лечение метастатической меланомы на поздних стадиях. Онколог 5: 144‑151, 2000.

4. Stevens MF, Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig GU, Lunt E и Newton cG: противоопухолевые имидазотетразины. 1. Синтез и химия 8-карбамоил-3-(2-хлорэтил)имидазо[5,1-d]-1,2,3,5-тетразин-4(3H)-она, нового противоопухолевого средства широкого спектра действия. агент. J Med Chem 27: 196-201, 1984.

5. Fulda S: Лечение на основе гибели клетокглиобластома. Cell Death dis 9: 121, 2018.

6. Chen PH, Shen WL, Shih CM, Ho KH, Cheng CH, Lin CW, Lee CC, Liu AJ и Chen KC: ингибируемый CHAC1 путь Notch3 участвует в цитотоксичности глиомы, вызванной темозоломидом. Нейрофармакология 116: 300-314, 2017.

7. Осиро С., Цугу Х., Комацу Ф., Омура Т., Охта М., Сакамото С., Фукусима Т. и Иноуэ Т.: Эффективность лечения темозоломидом у пациентов с глиомой высокой степени злокачественности. Anticancer Res 29: 911-917, 2009.

8. Ван ден Бент М.Дж.: Адъювантное лечение глиом высокой степени злокачественности. Энн Онкол 17 (Приложение 10): x186‑x190, 2006 г.

9. Shen W, Hu JA и Zheng JS: Механизм противоопухолевого действия темозоломида на клетки глиомы. J Int Med Res 42: 164-172, 2014.

10. Барцишевская А.М., Гурда Д., Глодович П., Новак С. и Наскрент-Барцишевская М.З.: Новый эпигенетический механизм действия темозоломида в клетках глиомы. PLoS One 10: e0136669, 2015 г.