Нацеливание на катепсин B с помощью циклоастрагенола повышает противоопухолевый иммунитет CD8 T-клеток за счет ингибирования деградации MHC-I Часть 1

АБСТРАКТНЫЙ

ФонПотеря опухолевых антигенов и истощение Т-клеток CD8, вызванное путем PD-1/PD-L1, являются важными факторами ускользания опухоли от иммунитета. В последние годы увеличивается количество исследований традиционной китайской медицины в лечении опухолей. Было обнаружено, что циклоастрагенол (CAG), эффективная активная молекула в Astragalus membranaceus, обладает противовирусными, антивозрастными, противовоспалительными и другими функциями. Однако его противоопухолевый эффект и механизм не ясны.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные кислородные радикалы (ОН-, Н₂О₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе способны усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и обладает способностью улавливать активные формы кислорода и предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение свободных радикалов тимина.

Нажмите на cistanche плюсы и минусы

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

МетодыПротивоопухолевый эффект CAG исследовали на моделях трансплантированных опухолей мышей MC38 и CT26. Противоопухолевый эффект CAG был дополнительно проанализирован с помощью одноклеточного мультиомного секвенирования. Для поиска целевого белка CAG использовали технологию профилирования целевой доступности. В дальнейшем противоопухолевый механизм ХАГ исследовали с помощью конфокальной микроскопии, иммунопреципитации и трансфекции мутантными плазмидами. Наконец, было исследовано комбинированное противоопухолевое действие антител CAG и PD-1 на мышах или органоидах.

Полученные результатыМы обнаружили, что CAG эффективно ингибирует рост опухоли in vivo. Наш атлас мультиомики одиночных клеток продемонстрировал, что CAG способствует презентации антигенов поверхности опухолевых клеток и характеризуется усиленной функцией уничтожения CD8 плюс Т-клеток. Механически CAG связывается со своим белком-мишенью катепсином B, который затем ингибирует лизосомную деградацию главного комплекса гистосовместимости I (MHC-I) и способствует присоединению MHC-I к клеточной мембране, усиливая предварительную станцию ​​опухолевого антигена. . Между тем, комбинация CAG с антителом к ​​PD-1 эффективно усиливала уничтожение опухоли CD8 плюс Т-клетки, убивающие опухоль, у мышей с ксенотрансплантатом и органоидами колоректального рака. Заключение. Наши данные впервые показали, что подавление катепсина В обеспечивает противоопухолевый иммунитет и расширяет противоопухолевый механизм природного продукта CAG.

ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак является одним из самых распространенных видов рака во всем мире. Его заболеваемость и смертность входят в тройку самых серьезных угроз для жизни и здоровья человека.1 Обычные методы лечения включают хирургическую химиотерапию и лучевую терапию, таргетные препараты и иммунотерапию.2–4 Однако раковые клетки обычно теряют поверхностные антигены и экспрессируют высокие уровни ингибируют молекулы, чтобы избежать наблюдения иммунных клеток. Поэтому, чтобы решить проблему ускользания опухоли от иммунного ответа, исследователи разработали ингибиторы иммунных контрольных точек и неоантигенную терапию, чтобы блокировать маскировку раковых клеток иммунными клетками. клеток существенно не улучшилось. Поэтому особенно важно найти лекарства, которые могут способствовать презентации антигенов поверхности опухоли. Распознавание раковых клеток цитотоксическими CD8 плюс Т-клетками зависит от пути TCR/CD3/главного комплекса гистосовместимости (MHC-I). TCR получает антиген, представленный белком CI мембраны дендритной клетки/раковой клетки, и передает сигнал для плотного соединения CD3, который затем распространяется глубже в цитоплазму.9 10 В то же время, с активацией сигнала CD28/B7 , CD8 плюс Т-клетки могут быть коактивированы для распознавания и уничтожения раковых клеток.11 Недавние исследования показали, что в процессе опухолевой прогрессии лизосомы приводят к снижению агрегации MHC-I на поверхности раковых клеток, что неэффективно. представляют антигены. 12 13 Liu et al. сообщили, что ингибирование PCSK9 может предотвратить деградацию MHC-I в лизосомах и позволить MHC-I вернуться к клеточной мембране для представления антигенов.12 Таким образом, восстановление антиген-представляющей функции MHC-I особенно важен для блокирования ускользания опухоли от иммунного ответа.

Все большее число исследований показало, что применение активных молекул традиционной китайской медицины в противоопухолевых вмешательствах имеет большие перспективы.14 15 Циклоастрагенол (ЦАГ) — эффективная активная молекула астрагала перепончатого, обладающая противовирусным, антибактериальным, анти- воспалительные и другие фармакологические эффекты, но о его противоопухолевом действии сообщают редко.16–19 В этом исследовании мы обнаружили, что CAG ингибирует рост трансплантированных опухолей рака толстой кишки. катепсин B (CTSB), способствуя представлению антигена раковыми клетками, а затем усиливая способность к уничтожению CD8 плюс Т-клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антитела и реагенты

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 процентов). Антитела к CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), актину (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959), тубулин (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695) ​​и набор для иммуногистохимического обнаружения антимышиного/кроличьего иммуногистохимического обнаружения (Cat#PK10006) были куплены в Proteintech. Антитела к H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), и CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology. Антитело Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142) было приобретено у Cell Signaling Technology. Антитело к Na/K-АТФазе (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) было приобретено у Abcam. Антитела для проточной цитометрии CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003) и CD{ {31}}PerCP (Cat# 345774, RRID: AB_2868802) были приобретены у BD Bioscience. Антитело для проточной цитометрии Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) было приобретено у BioLegend. Антитела для проточной цитометрии NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) и IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) были приобретены у Thermo Fisher Scientific. Среда DMEM (Cat#01-052-1ACS), пенициллинстрептомицин (Cat#15140122) и фетальная телячья сыворотка (Cat#C04001-500) были приобретены у Biological Industries. Козья сыворотка (Cat#88RNG001) и набор для анализа белка Pierce BCA (Cat#23225) были приобретены у Thermo Fisher Scientific. Антитела против PD человека-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) и против мышиного PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) были приобретены у Bio X Cell. Набор для диссоциации опухолевой ткани MACS (кат. № 130-095-929) был приобретен у Miltenyi Biotec.

Культура клеток

Линии клеток рака толстой кишки мыши MC38 и CT26 поддерживали в нашей лаборатории.20 Линии рака толстой кишки человека I HCT-116 были получены из Коллекции типовых культур Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Клетки MC38, CT26 и HCT-116 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина, при 37°С в инкубаторе с 5% CO2.

Эксперимент по пересадке опухоли

Самки мышей C57BL/6JGpt в возрасте 68 недель, мыши BALB/c и голые мыши BALB/,c были приобретены у GemPharmatech (Нанкин, Китай). Каждой мыши подкожно инокулировали раковые клетки МС38 или СТ26 (1×106). Когда опухоль вырастает до 100 мм3, мик случайным образом делят на группу с фосфатно-солевым буфером (PBS) (например, один раз в день) и группу CAG (например, 50 мг/кг один раз в день). Объемы опухолей определяли штангенциркулем по формуле V=длина×ширина2/2. Когда объем опухоли мышей группы PBS достигал 1000 мм3, опухоль мышей извлекали, фотографировали и взвешивали.

Диссоциация одиночных клеток от мыши для одноклеточной РНК/ATACseq

Солидные опухоли мышей расщепляли с использованием набора для диссоциации опухолей с получением одноклеточных одноклеточных. Одиночные клеткиОдиночные клетки с концентрацией 1000 клеток/1000 клеток, загруженные в одноклеточный контроллер хрома 10×genomics в соответствии с протоколом производителя 10×genomics. Реагенты для обратной транскрипции, гелевые шарики со штрих-кодом и разделяющее масло смешивали с клетками для гена для получения гелевых шариков в эмульсиях (GEM) для обратной транскрипции. Предварительная обработка данных scRNA-seq и контроль качества.

Основанный на эталонном геноме мыши GRCm38 (mm10), конвейер CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) для обработки одноклеточной РНК данные последовательности для каждого эксперимента (GSE197229). Цифровые матрицы экспрессии генов были zed в R (V.4.0.4) с использованием пакета Seurat (V.4.0.0).<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Предварительная обработка данных SeaTac-seq и контроль качества

Данные ATAC-seq для одной ячейки (GSE197229) были предварительно обработаны с помощью Cell ranger-at (V.2.0.0) с командной строкой подсчета. Для последующей обработки и анализа данных scATAC-seq мы использовали пакет ArchR (V.1.0.1).24 Затем мы использовали функцию addArchRGethe nome («mm10») для аннотации генома и создания файл стрелки с помощью функции cre ArrowFiles с параметрами по умолчанию. Затем мы использовали функцию filterDoublets для удаления потенциальных дублетов и создали проект ArchR, используя функцию ArchRProject с параметрами по умолчанию. Затем мы использовали пакет Harmony для удаления пакетного эффекта с помощью функции addHarmony.25 Для уменьшения размерности мы используем функцию addIterativeLSI в ArchR для запуска с параметрами def t. Для встраивания одной ячейки мы выбрали объект ReducedDims с гармонией и использовали функцию addTSNE с параметром 'perplexity=30' для визуализации.

Интегрированный анализ данных siRNA-seq и scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Чтобы повысить точность прогнозов для лучшей интеграции двух наборов данных, мы еще раз объединили данные scATAC-seq и scRNA-seq, используя режим «ограниченной интеграции». Вкратце, мы аннотировали данные scATAC-seq с типами клеток на основе оценок генов scATAC-seq. Затем мы создали ограниченный список, чтобы сходство экспрессии генов рассчитывалось только в одном и том же типе клеток как для scATAC-seq, так и для scRNA-seq. Неконтролируемая кластеризация с помощью t-SNE выявила 13 кластеров субклеток, которые были аннотированы известными или предполагаемыми маркерами в дополнительной онлайн-таблице 1.

Псевдовременная траектория происхождения

Траектория клеточного происхождения раковых клеток была выведена с помощью пакета Monocle2 (V.2.18.0) R.26 Моноциты изучают явный мастер-граф из данных геномики отдельных клеток с помощью реверсивного встраивания графа для сортировки клеток, тем самым решая сложные задачи. биологические процессы надежно и точно. 27 Мы использовали функцию «дифференциальный генетический тест» для получения DEG из каждого кластера, и после построения клеточной траектории мы обнаружили дифференциально экспрессируемые гены в псевдовремени. Все гены, зависящие от псевдовремени, были визуализированы с помощью функции тепловой карты plot_псевдовремени_, использующей объект CellDataSet. Графики траекторий клонов и гладкие кривые экспрессии на основе CellDataSet были созданы с помощью графиков_клеточных_траекторий и графиков_генов_в_псевдовремени соответственно.28

Вызов варианта номера копии одной ячейки

Чтобы идентифицировать злокачественные клетки с клональными крупномасштабными хромосомными вариациями числа копий (CNV), мы использовали пакет inferCNV R для вывода генетических профилей каждой клетки на основе средней экспрессии больших наборов генов в каждой хромосомной области генома опухоли по сравнению с нормальные клетки.29 На индивидуальной основе иммунные клетки использовались в качестве эталона для оценки CNV в клетках, связанных с раком.

Анализ обогащения

Анализ пути KEGG и аннотации GO выполнялся с использованием пакета R clusterProfiler (V.3.11.1) с параметрами PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6}. }.05, MingsSize=10 и MaxGSSize=500.20 Анализ обогащения набора генов (GSEA) был применен с использованием 50 наборов отличительных генов (h.all.V.7.4.symbols.gmt) для выявления значительно обогащенного функциональные пути с помощью программного обеспечения GSEA (V.4.1.0) с критериями скрининга номинального значения P<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Количественный ПЦР-анализ в реальном времени

Клетки MC38 и HCT-116 высевали в шестилуночные планшеты на 6 часов, а затем обрабатывали CAG еще на 24 часа. Клетки трижды промывали холодным PBS и центрифугировали при 18{18}} g в течение 5 мин при 4°С. При этом после измельчения опухолевой ткани. Суммарную РНК выделяли из клеток MC38, HCT-116 и опухолевой ткани с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя. Реакционный объем составлял 20 мкл и содержал: 1 мкг РНК, 5 мкл 5×Hiscript III qRT SuperMix и dH2O, не содержащую РНКаз. (прямой и обратный) и 3,25 мкл dH2O без РНКазы. Праймеры были синтезированы GenScript Biotech Corporation (Нанкин, Китай) в соответствии со следующими последовательностями (онлайн-дополнительная таблица 2).

Целевое обнаружение с помощью целевого подхода к профилированию доступности

Скрининг CAG-связывающих белков проводили, как описано ранее.31 32 Вкратце, для обнаружения белков, связывающих CAG в клеточной среде, применялся подход профилирования доступности, реагирующего на мишень (TRAP), путем мониторинга лизина, индуцированного вовлечением лиганда. доступность меняется на уровне протеома. Вкратце, две чашки с клетками обрабатывали 10 мкМ CAG и диметилсульфоксидом (ДМСО) соответственно. После 1-часовой инкубации клетки пермеабилизировали буфером M-PER (Thermo Scientific), а полученные лизаты ковалентно метили добавлением комплекса формальдегида и борана с пиридином, которые вместе специфически метят белковые остатки лизина при комнатной температуре для определения профиля доступности. . Затем лизаты осаждали органическим растворителем, а собранные осадки повторно растворяли в 8 моль/л мочевины, восстанавливали дитиотреитом (ДТТ) при 56° в течение 30 мин с последующим алкилированием с использованием йодацетамида (ИАА) в темноте в течение 30 мин. Снова добавляли соответствующее количество раствора ДТТ для реакции с избытком ИУК. Затем протеом разбавляли раствором бикарбоната аммония до достижения конечной концентрации мочевины 1 моль/л. Собранные белковые гидролизаты обессоливали на колонках C18 HLB (Waters, Milford, Massachusetts, USA), а обогащенные пептиды сушили и восстанавливали в 0,1% водном растворе муравьиной кислоты (FA). Систему AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) использовали для анализа образцов для количественного профилирования изменений доступности лизина в ответ на связывание CAG для обнаружения мишени. Для сбора данных использовалось получение зависимостей данных в положительном режиме. Анализ данных выполняли с помощью программы PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Ватерлоо, Канада). В частности, цис-алкилирование было выбрано в качестве фиксированной модификации, а окисление метионина и диметилирование лизина, достигаемые мечением TRAP, были установлены в качестве переменных модификаций. Вкратце, пептиды, содержащие TRAP-индуцированное диметилирование и демонстрирующие значительные изменения численности с инкубацией CAG и без нее, были отнесены к пептидам, реагирующим на мишень. Соотношение количества каждого меченого TRAP пептида указывает на степень изменения доступности и тесно связано с аффинностью связывания лиганда. Для оценки того, являются ли обнаруженные изменения доступности меченых пептидов статистически значимыми, был проведен t-критерий Стьюдента. Межгрупповое p-значение (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Органоидная культура

Органоиды колоректального рака человека были сконструированы и культивированы компанией Chongqing Kingbiotech.33 Образцы тканей пациентов, полученные в результате хирургической операции, были измельчены на кусочки как можно меньшего размера с помощью стерильных ножниц. Кусочки ткани тщательно перемешивали с матригелем (Corning, номер по каталогу 356231) в приблизительном соотношении 1:4 на льду. Последующая обработка относилась к опубликованным протоколам. Вкратце, суспензии кусочков матригеля быстро высевали в многолуночный планшет с образованием полусферических капель и переносили на 37 градусов на 15–20 минут, позволяя каплям затвердевать. Добавляли соответствующее количество культуральной среды (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​в каждую лунку и меняли среду каждые 2–4 дня.

Выделение и культивирование Т-клеток CD8 человека

Добавьте такой же объем физиологического раствора в периферическую кровь здоровых людей, содержащую антикоагулянты, чтобы разбавить цельную кровь. Добавьте определенный объем разделительного раствора в центрифужную пробирку объемом 15 мл, медленно добавьте разведенную цельную кровь вдоль стенки пробирки до верхней части разделительного раствора и центрифугируйте при 750 g в течение 20 мин. После центрифугирования используйте пипетку, чтобы осторожно отсосать моноциты в среднем белом слое в центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавить определенный объем PBS для ресуспендирования, центрифугировать 250 г в течение 5 минут и удалить супернатант. После добавления магнитных шариков человеческого CD8 к клеточным преципитатам Т-клетки CD8 сортировали с помощью сортировочной колонки LS. Т-клетки CD8 добавляли в перфорированный планшет, предварительно покрытый 5 мкг/мл CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578), а затем 10 нг/мл IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) и 5 ​​мкг/мл CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) добавляли функциональные антитела и культивировали в течение 24 часов.

Кокультура

После инкубации органоидов с CAG в течение 24 часов свежую культуральную среду заменяли, а затем органоиды и активированные CD8 Т-клетки суспендировали в матричном геле, затем суспензию добавляли в шестилуночный планшет и помещали в 37-луночный планшет. инкубаторе в течение 15 минут, а затем добавляли 2 мл полной культуральной среды без сыворотки на 24 часа.

Вестерн-блот

Клетки MC38 и HCT-116 высевали в шестилуночные планшеты на 6 часов, а затем обрабатывали CAG еще на 24 часа. Клетки трижды промывали холодным PBS и центрифугировали при 180g в течение 5 мин при 4°С. Общий белок лизировали с помощью лизиса WB-IP, содержащего 1% ингибитора протеазы, в течение 30 мин на льду. Общий белок оценивали с использованием набора для количественного определения белка BCA. Образцы белка разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с 10-12% SDS и переносили на мембраны PVDF (поливинилиденфторид) при 350 мА в течение 90 минут. Мембраны PVDF блокировали 5-процентным BSA в течение 1 часа, полоски указанным первичным антителом в течение ночи и инкубировали со вторичным антителом в течение 90 минут при комнатной температуре. Наконец, полосы были обнаружены с использованием системы хемилюминесцентных субстратов LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Проточной цитометрии

После переваривания опухолевой ткани готовили суспензию одиночных клеток. Окрашивание поверхности проводили поверхностными антигенными антителами в буфере FCM (проточная цитометрия) (PBS, содержащий 1 процент FBS) и окрашивали на льду соответствующими антителами в течение 30 минут. Для удаления мертвых клеток использовали реактивные красители (eBioscience). Окрашивание внутриклеточных цитокинов выполняли раствором фиксации клеток BD/раствором внеклеточных мембран, клетки фиксировали и проникали, а затем окрашивали антителами против цитокинов в буфере Perm/Wash (BD Biosciences).

Трансфицированные мутантные плазмиды CTSB

Клетки HCT-116 высевали в 6-луночные планшеты на 12 часов, а затем трансфицировали CTSB-WT-EGFP или мутантными плазмидами CTSB (Y75A, A77V и G198A) в течение 36 часов.

Интерференция трансфекции или сверхэкспрессия плазмиды CTSB в клетки MC38 или клетки HCT-116

Клетки MC38 (1×106 на лунку) инокулировали в 6-луночные планшеты в течение 6 часов, затем трансфицировали интерферирующей РНК CTSB (последовательность: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT и Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) в течение 48 часов и определяли уровни экспрессии мРНК или белка. Ctsb и H2-k1 были обнаружены. Клетки HCT-116 (1×106 на лунку) инокулировали в 6-луночные планшеты на 6 часов, затем трансфицировали CTSB-интерференцией (последовательность: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) или сверхэкспрессионной плазмидой на 48 часов, и мРНК или были обнаружены уровни экспрессии белка CTSB и HLA-A.

Технология стыковки

Трехмерная структура CTSB была загружена из базы данных белков (идентификатор PDB: 2iPP), а структуры CAG были загружены из PubChem. Процесс докинга проводился в программе Autodock 2 с грубым докингом с использованием алгоритма имитации отжига и последующим уточнением с помощью генетического алгоритма.

Анализ клеточного теплового сдвига

Клетки MC38 высевали в чашки диаметром 10 см в течение ночи, а затем обрабатывали CAG или 0,1% ДМСО еще в течение 2 часов. Клетки собирали, промывали холодным PBS и центрифугировали при 180g в течение 5 минут. Затем клетки равномерно распределяли по центрифужным пробиркам (по 70 мкл в каждой) и нагревали в течение 3 мин при следующих температурах: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 и 67°, образцы охлаждали в течение 3 мин при температурах и затем держали на льду. Затем образцы помещали в холодильник при температуре -80 градусов на ночь. Образцы оттаивали при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем охлаждали при температуре -80 градусов в течение 4 часов. Наконец, образцы центрифугировали при 12 000g в течение 25 минут, супернатант добавляли к загрузочному буферу и анализировали с помощью вестерн-блоттинга.

Иммуногистохимическое окрашивание

Парафиновые срезы опухолевой ткани погружали в ксилол на 20 мин для депарафинизации, а затем в 100-, 75- и 50-процентный этанол на 10 мин. После того, как срезы подвергли репарации антигена раствором репарации антигена цитрата натрия, эндогенную перекись водорода инактивировали 3-процентной перекисью водорода. После блокирования 5-процентной козьей сывороткой в ​​течение 1 часа добавляли анти-Ki67-антитело (1:200) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Добавляли полимер, меченый HRP против мышей/кроликов (100 мкл), и образцы инкубировали при 37 градусах в течение 30 минут, после чего добавляли 100 мкл рабочего раствора DAB и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. После 1 мин окрашивания гематоксилином образцы промывали 50-, 75- и 100-процентным этанолом и ксилолом в течение 5 минут, а для герметизации пленки использовали нейтральную смолу. Пленка наблюдалась и фотографировалась под микроскопом.

Статистическийанализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (V.8.0). Все результаты выражены как среднее ± SEM трех независимых экспериментов. Односторонний дисперсионный анализ с последующим апостериорным тестом Даннета использовался для оценки различий, когда групп было больше двух. Критерий Стьюдента использовали для оценки достоверной разницы между двумя группами. Статистическую значимость устанавливали на уровне p<0.05.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Одноклеточный мультиомный анализ CAG, ингибирующего рост трансплантированного рака толстой кишки у мышей

Чтобы выяснить, обладает ли CAG противоопухолевым действием, мы сначала трансплантировали раковые клетки MC38 мышам C57BL/6. Мы отметили, что CAG значительно ингибировал рост опухолей (онлайн-дополнительный рисунок S1A, B). Впоследствии мы трансплантировали клетки CT26 мышам BALB/c и обнаружили, что CAG также ингибирует рост опухолей (онлайн-дополнительный рисунок S1C, D).

Чтобы дополнительно выявить специфический механизм, с помощью которого CAG ингибирует рост опухоли, мы проанализировали его с использованием методов scRNA-seq и scATAC-seq (рис. 1А). Мы разделили клеточную популяцию на четыре группы: раковые клетки, фибробласты, миелоидные клетки и лимфоциты (рисунок 1B, дополнительные онлайн-рисунки S2A, B). Мы обнаружили, что раковые клетки (52 процента) и фибробласты (41 процент) были в основном инфильтрированы в опухолевых тканях, в то время как иммунные клетки составляли лишь 7 процентов. Затем мы разделили раковые клетки на восемь подгрупп, а фибробласты — на три подгруппы (рис. 1C–E). Впоследствии анализ обогащения генов с высокой экспрессией в каждой клеточной популяции показал, что молекулярные пути MHC-I в раковых клетках были обогащены, как и противоопухолевые сигналы Т-клеток и NK-клеток (дополнительная онлайн-рисунок S2C). Затем с помощью анализа интеграции scATAC-seq и scRNA-seq также были обнаружены четыре группы клеток (рис. 2D–G). После сравнения мы обнаружили, что раковые клетки (клетки C01, C03), CD8 плюс Т-клетки, Spp1 плюс клетки ТАМ и фибробласты (клетки F01 и F02) появились в секвенировании ATAC (рис. 1F, G), и, кроме того, высоко экспрессированные Факторы транскрипции были обогащены в этих клетках (фигура 1H). Благодаря этим анализам мы предполагаем, что ингибирование роста опухоли с помощью CAG тесно связано с изменениями в этих клетках.

Cag способствует презентации антигена опухолевых клеток

Чтобы проанализировать противоопухолевый механизм CAG, мы сначала проанализировали популяцию опухолевых клеток и разделили раковые клетки на восемь подгрупп (рис. 2A, B, онлайн-дополнительный рисунок S3A). Результаты показали, что по сравнению с группой PBS количество клеток в группе C05 значительно уменьшилось, а количество клеток в группе C07 увеличилось (рис. 2C). Между тем, чтобы проверить точность нашей кластеризации опухолевых клеток, мы сравнили CNV лимфоцитов и миелоидных клеток в качестве эталонных клеток. Результаты показали, что CNV раковых клеток была значительно выше, чем у иммунных клеток (дополнительная онлайн-рисунок S3B). При анализе подмножеств раковых клеток мы обнаружили, что гены ответа на интерферон Isg15, Irf7, Ifit3 и Ifi47 были высоко экспрессированы в клеточных популяциях C07 и C08 группы CAG по сравнению с группой PBS (дополнительная онлайн-рисунок S3C). Анализ популяции опухолевых клеток показал, что пути, связанные с презентацией антигена, были значительно обогащены во многих клеточных популяциях. Поэтому мы предполагаем, что CAG может способствовать представлению антигена раковыми клетками, чтобы играть противоопухолевую роль (рис. 2D). Затем мы выбрали гены, связанные с презентацией антигена, и обнаружили, что уровень экспрессии в группе CAG был значительно выше, чем в группе PBS (рисунок 2E, онлайн-дополнительный рисунок S3D). Мы также обнаружили, что CAG способствует презентации антигена в опухолевых тканях (рис. 2F, G).

Затем мы использовали scATAC-seq для анализа конкретных причин CAG-стимулирующей презентации антигена опухолевых клеток. Мы обнаружили, что популяция опухолевых клеток сильно экспрессирует факторы транскрипции Fos, Junb, Jund, Fosb и Fosl1 (рис. 2H, I). Впоследствии мы построили карту взаимодействия между факторами транскрипции и соответствующими генами, чтобы объяснить, что CAG способствует экспрессии генов, связанных с антиген-презентацией опухолевых клеток (рис. 2J). В опухолевых тканях мы также обнаружили, что факторы транскрипции Junb, Fos, Jund и Fosb были значительно сверхэкспрессированы в группе PBS при лечении CAG (рисунок 2K-N, онлайн-дополнительный рисунок S3E-I). К настоящему времени мы обнаружили, что CAG может способствовать экспрессии факторов транскрипции генов, связанных с антиген-презентацией, тем самым усиливая антиген-презентирующую функцию раковых клеток. Однако остается неясным, как эти раковые клетки реагируют на реакции иммунных клеток.

Чтобы раскрыть явление, с помощью которого CAG способствует представлению антигена раковыми клетками, мы провели анализ траектории, чтобы выяснить, как раковые клетки изменяют друг друга в ответ на ответы иммунных клеток. Мы обнаружили, что со временем раковые клетки C07 трансформировались в клетки C05, C06 и C08, а обогащение генами также показало, что раковые клетки трансформируются в презентацию антигена (рис. 3A–E).

CAG усиливает функцию уничтожения иммунных клеток

Эти результаты показывают, что CAG может представлять антигены опухолевых клеток, поэтому приведет ли усиление презентации антигенов опухолевых клеток к усилению функции иммунных клеток? Чтобы выяснить это, мы проанализировали лимфоциты и миелоидные клетки соответственно. Результаты показали, что CAG способствовал инфильтрации CD8 плюс Т-клеток в опухолевых тканях, а инфильтрация CD8 плюс Т-клеток и NK-клеток также была увеличена, что было обнаружено с помощью проточной цитометрии (онлайн-дополнительная фигура S4A-F). Мы также наблюдали, что CAG усиливал экспрессию генов Ifitm2, Cxcr6 и S100a6 в CD8 плюс Т-клетках.

Гены Fcer1g, Gzmb, AW112010 и Zfp36i2 в NK-клетках, а также гены Nfkbia и Junb в CD4 плюс Т-клетках (онлайн-дополнительный рисунок S4G). Экспрессия Ifng и Gzmb в CD8 плюс Т-клетках также была значительно повышена, что было обнаружено с помощью проточной цитометрии (онлайн-дополнительная фигура S4H, I). Кроме того, мы обнаружили, что после обработки CAG экспрессия ингибиторных рецепторов Lag3, Tigit и Havcr2 на поверхности CD8 плюс Т-клеток снижалась, а экспрессия генов Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 и Pdcd1, характеризующих активация CD8 плюс Т-клеток значительно увеличилась (онлайн-дополнительная фигура S4J). Для дальнейшей проверки того, что CAG усиливает функцию уничтожения CD8 плюс Т-клетки, способствуя усиленной презентации опухолевого антигена, мы трансплантировали клетки CT26 в трансплантированные опухоли голым мышам и обнаружили, что CAG не может эффективно ингибировать рост опухолей (онлайн-дополнительный рисунок S4K-M). ).

После этого мы проанализировали миелоидные клетки и обнаружили, что после обработки CAG количество клеток Spp1 плюс TAM увеличилось, в то время как количество клеток C1qc плюс TAM уменьшилось, а количество IL1b плюс моноцитов увеличилось (дополнительная онлайн-рисунок S5A-D). После обработки CAG клетки Spp1 плюс ТАМ и C1qc плюс ТАМ были более восприимчивы к провоспалительной трансформации ТАМ. Анализ обогащения показал, что он в основном сосредоточен на Tnf-, Ifn-g и сигнальном пути воспалительной реакции (дополнительный онлайн-рисунок S5E-H). Основываясь на вышеупомянутых результатах, мы делаем вывод, что CAG усиливает функцию распознавания и уничтожения иммунных клеток, способствуя презентации антигена в раковых клетках. Однако неясно, как регулируется CAG.

Открытие целевого белка CAG CTSB с помощью ловушки

Далее мы исследуем специфический белок-мишень CAG, играющий противоопухолевую роль. Мы выбрали раковые клетки в качестве объекта исследования, потому что обнаружили, что CAG может усиливать антигенную презентацию раковых клеток, тем самым усиливая функцию уничтожения иммунных клеток. Сначала мы синтезировали биотиновое производное CAG и обнаружили, что только 3-OH может реагировать (онлайн-дополнительный рисунок S6A). Затем мы исследовали, способствует ли CAG-биотин также экспрессии генов, связанных с презентацией антигена, в линии опухолевых клеток мыши MC38. Результаты показывают, что CAG-биотин не влиял на экспрессию генов H2-K1, Cd74 и Anxa1 (онлайн-дополнительный рисунок S6B-D).

Поэтому мы использовали предыдущий метод поиска мишеней TRAP в лаборатории.32 CAG и DMSO инкубировали с клеточной линией MC38 (рис. 4A). Мы выбрали белок с FC больше или равным 2 и ap меньше или равным 0.05 в качестве белка-кандидата-мишени CAG. Следуя принципу, что связывание небольших молекул с белками приведет к низкой эффективности мечения лизина, мы выбрали CTSB для исследования (рис. 4B). Затем мы использовали анализ клеточного теплового сдвига (рис. 4C) и микромасштабный термофорез (MST) (рис. 4D), чтобы проверить связывание между CAG и CTSB, и обнаружили, что сродство между CAG и CTSB составляет 26,6 нМ (рис. 4D). Впоследствии мы предсказали сайты связывания между CAG и CTSB в соответствии с кристаллической структурой белка CTSB в библиотеке PDB. Мы обнаружили, что гидроксильные группы на обоих концах CAG и сайтов ALA77 и GLY198 CTSB были связаны водородной связью, в то время как сайты TYR75, PRO76 и ALA173 CAG и CTSB были связаны силой Ван-дер-Ваальса (рис. 4E). . Чтобы проверить сайт связывания между CAG и CTSB, мы трансфицировали мутантную плазмиду CTSB в клетки HCT-116. Результаты показывают, что аффинность между мутантной плазмидой A77V и G198A и CAG была в сотни раз выше, чем у плазмиды WT (фиг. 4F, G). В следующем разделе мы исследуем специфический механизм, с помощью которого CAG играет противоопухолевую роль через CTSB.

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】