Воздействие катехина на лактатдегидрогеназу А повышает чувствительность клеток рака желудка SNU620/5FU к 5-фторурацилу, часть 1

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный:Резистентность к противоопухолевым препаратам возникает практически при каждом типе рака и становится серьезной проблемой при лечении рака. Хотя 5-фторурацил (5FU) является средством выбора первой линии противоопухолевой терапии рака желудка, его эффективность ограничена из-за лекарственной устойчивости. Недавно измененный раковый метаболизм, включая эффект Варбурга, предпочтение гликолиза, а не окислительного фосфорилирования для производства энергии, был принят в качестве основного механизма, регулирующего резистентность к химиотерапии. Таким образом, мы исследовали подробный механизм и возможную полезность антигликолитических агентов для улучшения резистентности к 5FU, используя установленные клеточные линии рака желудка, SNU620 и SNU620/5FU. SNU620/5FU, клетки рака желудка, несущие резистентность к 5FU, показали гораздо более высокую продукцию и экспрессию лактата. изферменты, связанные с гликолизом, такие как лактатдегидрогеназа A (LDHA), чем у родительских клеток SNU620. Для ограничения гликолиза мы исследовали катехин и его производные, которые известныпротивовоспалительное средствои противораковые натуральные продукты, поскольку ранее сообщалось, что галлат эпигаллокатехина подавляет экспрессию LDHA. Катехин, самое простое соединение среди них, обладал самым высоким ингибирующим действием на продукцию лактата и активность ЛДГК. Кроме того, комбинация 5FU и катехина показала дополнительную цитотоксичность и индуцировала опосредованный активными формами кислорода (АФК) апоптоз в клетках SNU620/5FU. Таким образом, основываясь на этих результатах, мы предлагаем катехин в качестве кандидата для разработки нового адъювантного препарата, который снижает химиорезистентность к 5FU за счет ограничения LDHA.

Ключевые слова:5-фторурацил;химиорезистентный; гликолиз; лактатдегидрогеназа; катехин

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Введение

Заметный прогресс был достигнут в лечении рака желудка путем хирургической резекции первичной опухоли и комбинированной химиотерапии на основе 5-фторурацила (5FU), такой как эпирубицин, цисплатин, фторурацил и доцетаксел, оксалиплатин и 5FU[1]. ,21 На сегодняшний день 5FU, аналог урацила, который блокирует синтез ДНК путем ингибирования тимидилатсинтазы [3], остается широко используемым химиотерапевтическим препаратом для лечения рака желудка [1, A4]. Однако клиническая эффективность химиотерапии была неудовлетворительной из-за рецидива первичного или метастатического рака, связанного с лекарственной устойчивостью [1,5].

Цистанхе может улучшить иммунитет

Несколько клеточных процессов считаются ключевыми механизмами, лежащими в основе химиорезистентности, включая активацию или инактивацию лекарственных средств, механизмы репарации повреждений ДНК, модификации мишеней лекарственных средств, инактивацию путей апоптоза и усиление аутофагии [6,7]. Рак гетерогенен, и различные виды рака используют как гликолиз, так и окислительное фосфорилирование для энергетического метаболизма [8]. Однако сообщалось, что метаболическое перепрограммирование, особенно аномальный аэробный гликолиз, играет ключевую роль в развитии резистентности к химиотерапевтическим препаратам, включая 5FU, при раке желудка [9]. Лактатдегидрогеназа А (LDHA) и киназы пируватдегидрогеназы (PDK) известны как ключевые регуляторы аэробного гликолиза с образованием лактата из пирувата [10,11]. Комбинация дихлорацетата, признанного ингибитора PDK, восстанавливает чувствительность к 5FU [12]. Кроме того, сообщалось, что LDHA, ключевой фермент, катализирующий превращение пирувата в лактат, является потенциальной мишенью для лечения рака желудка [13,14]. Нокдаун экспрессии LDHA в раковых клетках ингибирует онкогенность за счет усиления митохондриального дыхания и снижения жизнеспособности клеток [15]. Некоторые ингибиторы LDHA, такие как FX11, PSTMB и GSK 2837808A, снижают уровень АТФ и вызывают окислительный стресс и, наконец, вызывают апоптозную гибель клеток [16-18]. Хотя исследование показало, что ингибирование LDHA с помощью микроРНК -34a восстанавливает устойчивость к 5FU при раке толстой кишки [19], ни в одном из предыдущих исследований не сообщалось о влиянии генетических или фармакологических ингибиторов LDHA на химиорезистентность.

Полифенолы зеленого чая, в том числе катехин (CA), эпикатехин (EC), галлокатехин (GC), эпигаллокатехин (EGC), эпикатехин-3-галлат (ЭКГ) и эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG), способствуют здоровье путем профилактики и лечения ряда заболеваний, включая воспаление, диабет, сердечно-сосудистые заболевания и злокачественный рак [20,21]. Среди полифенолов EGCG повышает хемочувствительность к 5FU в клетках колоректального рака и гепатоцеллюлярной карциномы путем активации путей AMPK и ограничения стволовости рака [22,23]. Кроме того, сообщалось, что EGCG ингибирует LDHA, подавляя ее экспрессию в раковых клетках молочной железы и поджелудочной железы [24,25].

В этом исследовании мы предположили, что СА может быть кандидатом в качестве адъювантного препарата для снижения устойчивости к 5FU в клетках рака желудка. Было исследовано, что ингибирующее действие СА и/или его комбинации с 5FU на активность LDHA, таким образом, индуцирует митохондриальные активные формы кислорода (АФК) и апоптотическую гибель клеток в устойчивых к 5FU клетках.

2. Результаты

2.1. Гликолитические характеристики 5FU-резистентных клеток

Повышенная пролиферация является характеристикой химиорезистентности, в том числе устойчивых к 5FU раковых клеток [26,27]. Во-первых, мы подтвердили устойчивость к 5FU и долгосрочные темпы роста клеток SNU620 и SNU620/5FU. Когда эти клетки культивировали с указанными концентрациями 5FU в течение 48 ч, предполагаемая доза, вызывающая 50-процентное ингибирование роста (G150) в клетках SNU620/5FU (100,63 мкМ), была намного выше, чем доза, вызывающая GIso в родительских клетках SNU620 (28,88 мкМ). ）（Рисунок 1A и дополнительный рисунок S1）. Кроме того, скорость роста клеток SNU620/5FU была выше, чем у клеток SNU620 (рисунок 1B и дополнительный рисунок S2). Поскольку химиорезистентность и характеристики быстрого роста могут быть связаны с повышенными гликолитическими свойствами в клетках рака желудка [28], в обеих клетках измеряли скорость внеклеточного подкисления (ECAR) и скорость потребления кислорода (OCR) в присутствии оксамата, хорошо известного ингибитор гликолиза или нет. Результаты показали, что клетки SNU620/5FU секретировали значительно больше лактата, чем клетки SNU620, и впоследствии подкисляли культуральную среду (рис. 1C и дополнительная рис. S3). Однако между этими клетками не наблюдалось значительных изменений в OCR (рис. 1D). Были измерены уровни экспрессии мРНК и белка LDHA. Экспрессия LDHA была выше в клетках SNU620/5FU, чем в клетках SNU620 (рис. 1E, F). Кроме того, мы исследовали уровни экспрессии мРНК и белка изотипов PDK и обнаружили, что уровни экспрессии PDK2 и PDK3 были выше в клетках SNU620/5FU, чем в клетках SNU620 (дополнительная фигура S4A, B). Также было оценено фосфорилирование субъединицы E1 пируватдегидрогеназы (PDHA1), которое было увеличено PDK, и было обнаружено, что оно выше в клетках SNU620 / 5FU, чем в клетках SNU620 (дополнительная фигура S4C). Кроме того, мы использовали оксамат в качестве ингибитора LDHA для преодоления устойчивости к 5FU в клетках SNU620/5FU. Это соединение ингибировало рост клеток как в клетках SNU620, так и в клетках SNU620/5FU (дополнительная фигура S5). Кроме того, совместная обработка оксаматом и 5FU подавляла рост клеток по сравнению с индивидуальной обработкой оксаматом или 5FU в клетках SNU620/5FU (рис. 1G). Эти данные позволяют предположить, что клетки SNU620/5FU в высокой степени экспрессируют LDHA, и ингибирование активности LDHA может преодолеть устойчивость клеток SNU/5FU к 5FU.

Рисунок 1. Согласно результатам, 5-фторурацил-резистентные (5FU) клетки имеют повышенную гликолитическую характеристику: (A)клетки SNU620 и SNU620/5FU обрабатывали указанными концентрациями 5FU в течение 48 часов. Жизнеспособность этих клеток оценивали с помощью МТТ-анализа; (B) уровни роста клеток SNU620 и SNU620/5FU измеряли каждый день в течение 4 дней с помощью МТТ-анализа; (C, D) клетки SNU620 и SNU620/5FU обрабатывали оксаматом ( 5 мМ) или нет в течение 24 ч, а значения ECAR и OCR оценивали с помощью анализатора Seahorse XF; (E, F) экспрессию LDHA в клетках SNU620 и SNU620/5FU определяли с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга; (G) Клетки SNU620 и SNU620/5FU обрабатывали оксаматом (25 мМ) и/или 5FU (10 мкМ) в течение 48 часов. Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA подавляет активность LDHA

Продукцию лактата анализировали с помощью CA и ее производных, включая EC, GC, EGC и EGCG, в клетках SNU620/5FU. По сравнению с этими производными СА более эффективно снижала выработку лактата (рис. 2А). Кроме того, in vitro был подтвержден анализ активности LDHA, и CA показал более сильный ингибирующий эффект на активность LDHA, чем его производные (рис. 2B). Ингибирующее действие СА на активность LDHA и LDHB in vitro измеряли дозозависимым образом. CA ингибировал активность LDHA, не влияя на активность LDHB (рис. 2C, D). Кроме того, активность LDHA и LDHB была измерена с помощью EGCG, который, как известно, ингибирует активность LDHA, и было обнаружено, что он снижается в зависимости от дозы (дополнительная фигура S6A, B). Кроме того, внутриклеточную активность LDHA и LDHB оценивали при указанных концентрациях CA в клетках SNU620/5FU. CA ингибирует активность LDHA дозозависимым образом in vitro, но не активность LDHB (рис. 2E, F). Уровни экспрессии белка p-PDHA1, PDK2, PDK3 и LDHA также были измерены в клетках SNU620 / 5FU после обработки CA (дополнительная фигура S7), и мы заметили, что это лечение не повлияло на них. Эти результаты предполагают, что CA регулирует активность LDHA, не влияя на ее экспрессию.

2.3. Способ действия ингибирования LDHA с помощью CA

Чтобы проанализировать механизм ингибирования активности LDHA в отношении CA и ее производных, мы провели молекулярное моделирование связывающего взаимодействия между рекомбинантной LDHA человека и CA (рис. 3A, B). Результаты показали, что CA может взаимодействовать с остатками T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 и T247 LDHA. Среди них R105, S136 и R168 имеют решающее значение для связывания субстрата (пирувата). Таким образом, мы предположили, что КА может мешать сайтам связывания субстрата. Напротив, EGCG связывается с LDHA через другой сайт. Чтобы дополнительно проверить способ действия ингибирования LDHA с помощью СА, графики Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка были подтверждены с различными концентрациями пирувата и СА. Активность LDHA увеличивалась в зависимости от дозы пирувата. Однако это было обращено вспять увеличением СА. Таким образом, результаты графиков Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка показали, что КА является неконкурентным ингибитором LDHA (рис. 3C, D). значение 197 мкМ (дополнительный рисунок S8). Эти результаты дают представление о том, что CA подавляет активность LDHA за счет связывания сайта связывания субстрата LDHA.

2.4. CA повышает чувствительность к 5FU за счет снижения активности LDHA

Мы оценили цитотоксическое действие СА на клетки SNU620 и SNU620/5FU и обнаружили, что СА подавляет рост в обеих группах клеток (рис. 4А). Чтобы убедиться, что ингибирование роста было связано с подавлением активности LDHA, экспрессия LDHA была отменена с помощью рибонуклеиновой кислоты с короткой шпилькой (shRNA) для LDHA (shLDHA), и ее экспрессия была восстановлена ​​путем трансфекции плазмидой, экспрессирующей LDHA (дополнительная фигура S9A, B). ). В клетках SNU620/5FU, трансфицированных shLDHA, выработка лактата и жизнеспособность клеток не претерпели заметных изменений при обработке СА по сравнению с таковыми у ложно-трансфицированных клеток (рис. 4B, C). Кроме того, ингибирующий рост эффект СА был увеличивается за счет восстановления экспрессии LDHA в клетках SNU620 / 5FU с нокдауном LDHA (рис. 4D). Кроме того, клетки SNU620 и SNU620/5FU исследовали после обработки CA и 5FU по отдельности или их комбинации. Совместное лечение CA и 5FU значительно ингибировало рост клеток SNU620/5FU (рис. 4E). Кроме того, комбинированные эффекты CA и 5FU были исследованы на нескольких других клеточных линиях, таких как рак желудка человека AGS, рак поджелудочной железы Panic-1, MIA PaCa-2 и клетки рака толстой кишки LS174T и RKO, по сравнению с клетками Ячейки SNU620 и SNU620/5FU. Производство лактата и экспрессия LDHA показали хорошую корреляцию друг с другом, и эти гликолитические свойства относительно высоки в SNU620 / 5FU, AGS и RKO (дополнительный рисунок S10A, B). Более того, комбинированное лечение CA и 5FU значительно снижало жизнеспособность клеток по сравнению с однократным лечением 5FU в гликолитических клетках, включая AGS и RKO (дополнительная фигура S10C). Однако совместная обработка CA и 5FU не оказывала значительного ингибирующего действия на рост клеток SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 и LS174T, которые демонстрировали низкую экспрессию LDHA. Эти результаты позволяют предположить, что сенсибилизирующий эффект КА на клетки, устойчивые к 5FU, может быть связан с его ингибирующим действием на активность LDHA.

Рисунок 2. Катехин (CA) ингибирует активность LDHA, но не ее экспрессию: (A) производство лактата SNU620/5FU измеряли после обработки производными CA (10 мкМ) в течение 24 часов; (B) активность LDHA in vitro оценивали после обработки. с производными СА (10 мкМ) и оксаматом (20 мМ); (C, D) in vitro оценивали активность LDHA и LDHB при указанных концентрациях СА; (E, F) клетки обрабатывали указанными концентрациями СА в течение 24 часов. Внутриклеточную активность LDHA и LDHB измеряли, используя лизаты клеток в качестве источника фермента. Результаты показаны как среднее ± SEM. **п<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Рисунок 4. Жизнеспособность клеток ингибировалась совместной обработкой катехином (CA) и 5-фторурацилом (5FU) в устойчивых к 5FU клетках: (A) жизнеспособность клеток SNU620 и SNU620/5FU оценивали после обработки указанными концентрациями CA в течение 48 часов; (B) клетки SNU620/5FU-pLKO.1 и SNU620/5FU-shLDHA обрабатывали CA (10 мкМ) в течение 24 часов. Продукцию лактата измеряли в культуральных средах клеток SNU620/5FU-pLKO.1 и SNU620/5FU-shLDHA; (C, D) SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plus EV. и клетки SNU620/5FU-shLDHA плюс LDHA#2 обрабатывали указанными концентрациями СА в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью МТТ-анализа (E) клетки SNU620 и SNU620/5FU обрабатывали CA (10 мкМ) и/или 5FU (10 мкМ) в течение 48 часов. Жизнеспособность этих клеток измеряли с помощью анализа МТТ. Результаты представлены как среднее ± SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Эта статья взята из Int. Дж. Мол. науч. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms