Создание рекомбинантной вакцины Lactobacillus Casei от PEDV и ее иммунные реакции у мышей

Абстрактный

Фон: Эпидемическая диарея свиней (ЭДС) — заразное кишечное заболевание, вызываемое вирусом эпидемической диареи свиней (ВЭДС), характеризующееся рвотой, диареей, анорексией и обезвоживанием, которое привело к огромным экономическим потерям во всем мире. В настоящее время вакцинный иммунитет по-прежнему остается наиболее эффективным методом борьбы с распространением ПЭД. В этом исследовании мы создали новый рекомбинантный штамм L.casei-OMP16-PEDVS, экспрессирующий белок PEDVS PEDV и белок OMP16 штамма Brucella abortus. Чтобы узнать иммуногенность рекомбинантной вакцины-кандидата L.casei-OMP16-PEDVS, ее сравнивали с BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS и рекомбинантный белок BL21-PEDVS.

Полученные результаты: Результаты показали, что мы можем обнаружить более высокие уровни IgG, нейтрализующих антител, IL-4, IL-10 и INF- в сыворотке и IgA в фекалиях L. casei-OMP16- Мыши, иммунизированные PEDVS, показали, что кандидатная вакцина L.casei-OMP16-PEDVS может индуцировать более высокие уровни гуморального иммунитета, клеточного иммунитета и иммунитета слизистой оболочки.

Заключение: Таким образом, L.casei-OMP16-PEDVS является многообещающей вакциной-кандидатом для профилактики инфекции PEDV.

Ключевые слова: PEDV, вакцина Lactobacillus casei, белок S PEDV, OMP16, иммунные реакции.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Введение

Эпидемическая диарея свиней (ЭДС) вызывается вирусом эпидемической диареи свиней (ВЭДС), симптомы которого включают диарею, рвоту, анорексию, обезвоживание и потерю веса у поросят [1, 2]. Свиньи всех возрастов могут заражаться с разными симптомами, а смертность поросят достигает 100% [3], что привело к огромным экономическим потерям во всем мире. Для контроля распространения PEDV создается большинство видов вакцин, таких как инактивированная вакцина с адъювантом гидроксида алюминия, двухвалентная неактивная вакцина против вируса трансмиссивного гастроэнтерита (TGEV), вакцина PEDV и аттенуированная вакцина PEDV [4]. Хотя эти вакцины играют важную роль в борьбе с ПЭД, все они имеют свои недостатки. Инактивированные вакцины не могут активировать клеточные иммунные реакции, аттенуированные вакцины не очень безопасны и не могут индуцировать достаточную выработку вирусспецифических антител IgA для иммунных ответов слизистых оболочек. Поэтому необходимо и срочно разработать новую вакцину для борьбы с ПЭД.

Lactobacillus casei часто рассматривают как своего рода безопасную векторную систему для адресной доставки антигенов при пероральной иммунизации, оказывающую благотворное влияние на здоровье человека и животных [5]. Между тем, его можно использовать в качестве системы доставки для регулирования ответа Т-хелперов и стимуляции секреции специфических IgA для иммунитета слизистой оболочки [6]. С другой стороны, рекомбинантную вакцину Lactobacillus casei легче вводить, она меньше подвержена реакциям гиперчувствительности и более экономична по сравнению с традиционными вакцинами. Согласно имеющимся данным, рекомбинантные вакцины Lactobacillus casei успешно используются для профилактики и борьбы с вирусом папилломы человека, Streptococcus pneumonia и Escherichia coli [7–9]. Есть также несколько подобных попыток создания вакцин против ЭДС. Исследователи обнаружили, что рекомбинантный штамм Lactococcus Lactis, экспрессирующий вариантный ген S1 вируса эпидемической диареи свиней, может индуцировать высокие уровни IL-4 и IFN- у иммунизированных мышей [10]. Вакцина против ВЭДВ на основе Lactobacillus casei, экспрессирующая пептид Co1, нацеленный на микроскладчатые клетки, слитый с антигеном COE ВЭДВ, также может индуцировать эффективный иммунный ответ [11]. Для повышения эффективности вакцины против PEDV. В этом исследовании мы создаем новую рекомбинантную вакцину Lactobacillus casei против ЭДС, которая может стимулировать более сильный слизистый, гуморальный и клеточный иммунный ответ против инфекции ЭДС при пероральном введении. PEDV, член семейства Coronaviridae, состоит из четырех структурных белков, которые содержат гликозилированный шиповый белок (S) массой 150–220 кДа, мембранный белок (М) массой 20–30 кДа, белок оболочки (Е) массой 7 кДа, массой 58 кДа. белок нуклеокапсида (N) [12]. При этом белок S можно разделить на домены S1 (1–735 аминокислот) и S2 (736-последняя аминокислота) [13], причем белок S1 включает рецептор-связывающую область и основные нейтрализующие эпитопы [13]. 14]. Вакцинный адъювант действует как иммуномодулятор и может индуцировать и усиливать иммунные ответы против совместно доставляемых антигенов. Было подтверждено, что белок OMP16 штамма Brucella abortus активирует дендритные клетки in vivo, индуцирует иммунный ответ th1 и является многообещающей самоадъювантной вакциной [15–17]. Поэтому в нашем исследовании белок OMP16 был встроен в рекомбинантную вакцину от Lactobacillus. На данный момент сообщалось о небольшом количестве исследований рекомбинантной вакцины Lactobacillus casei re против вируса ЭДВ. Таким образом, данное исследование направлено на создание новой кандидатной пероральной вакцины Lactobacillus casei, которая может обеспечить лучший гуморальный иммунитет, клеточный иммунитет и иммунитет слизистых оболочек для предотвращения распространения ЭДС.

Китайская трава цистанхе-противоопухолевое растение

Материалы и методы

Бактериальные штаммы, вирусы, условия культивирования, плазмиды и праймеры.

Цистанхе порошок

Бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Стандартный эталонный штамм Lactobacillus casei ATCC 393 культивировали в бульоне де Мана Рогосы и Шарпа (MRS) при 37 градусах [18]. BL21 (DE3) и DH5 культивировали в среде Лурия-Бертани (LB) при 37 градусах [19]. Рекомбинантные штаммы Lactobacillus casei, BL21 (DE3) и DH5 культивировали в соответствующей среде с соответствующими антибиотиками соответственно. Brucella abortus выращивали в среде с триптическим соевым бульоном (TSB) или триптическим соевым агаром (TSA) (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган, США) при температуре 37 градусов. Клетки Vero, инфицированные штаммами PEDV, культивировали в среде DMEM (Gibco, Лэнгли, Вирджиния, США) с добавлением 10 мкг/мл трипсина (Gibco, Лэнгли, Вирджиния, США) [20]. Плазмиды pVE5523 и pET28a (+) представляли собой векторы экспрессии Lactobacillus casei и Escherichia coli соответственно.

Таблица 1. Характеристики бактериальных штаммов, плазмид и праймеров, использованных в работе.

Создание рекомбинантных штаммов Lactobacillus casei и BL21.

Рекомбинантные экспрессирующие плазмиды были сконструированы на основе плазмид и праймеров, представленных в таблице 1. Сначала использовали частичную последовательность гена S PEDV (493–708 аминокислот), частичную последовательность гена S' PEDV (493–708 аминокислот), и частичную последовательность гена OMP16 Brucella abortus (26–168 аминокислот) амплифицировали с использованием пар праймеров PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 и OMP16-F/R соответственно. Впоследствии метод перекрывающегося удлинения был использован во фрагментах OMP16 и PEDVS для создания нового фрагмента OMP16-PEDVS с линкерным полипептидом (GGGGSGGGGGGGGGS), прикрепленным в середине. Затем фрагменты PEDVS были вставлены в плазмиду pET28a с помощью рестриктаз EcoRI/XbaI для создания рекомбинантной плазмиды pET28a-PEDVS, а новые фрагменты OMP16-PEDVS были вставлены в плазмиды pET28a и pVE5523 с EcoRI/XbaI и SalI/EcoRV. ферменты рестрикции для создания рекомбинантных плазмид pET28a-OMP16-PEDVS и pVE5523-OMP16-PEDVS соответственно. Рекомбинантные плазмиды (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS и pVE5523-OMP16-PEDVS) трансформировали в BL21 (DE3) или Lactobacillus casei ATCC393 путем трансформации или электропорации на основе опубликованная статья [21].

Анализ экспрессии белка методом вестерн-блоттинга

Экспрессия белка штаммов BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS и L.casei-pVE5523-OMP16- PEDVS была обнаружены на основе описанного метода с некоторой модификацией [21–23]. Рекомбинантные штаммы BL21-pET28a-PEDVS и BL21-pET28a OMP16-PEDVS культивировали в бульоне LB и использовали IPTG для сбора pET28a-PEDVS и pET28a-OMP{{22} } Белки PEDVS. Пустой вектор использовали в качестве отрицательного контроля. После лизиса клеток и центрифугирования собирали супернатант и осадок. Затем целевые белки очищали на колонке для аффинной хроматографии с никелем на основе предыдущего исследования [24]. Между тем, культуральный супернатант рекомбинантного штамма L.casei pVE5523-OMP16-PEDVS также собирали центрифугированием при 9000×g в течение 10 минут при 4 градусах. После этого образцы с буфером для загрузки додецилсульфата натрия (ДСН) кипятили в течение 10 минут. Белки разделяли электрофорезом в 12% додецилсульфате натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), а затем переносили на мембраны из ПВДФ (Millipore, Миссиссога, Онтарио, Канада). Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в течение 2 часов при 37 градусах, а затем инкубировали с мышиными моноклональными антителами к белку S в течение ночи при 4 градусах и конъюгированными с HRP козьими антимышиными IgG (ABclonal, Ухань, Китай) в течение 2 часов при 37 градусов. Белковые полосы визуализировали с использованием субстрата для блоттинга Clarity™ Western ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Иммунизация и сбор образцов

Иммуногенность рекомбинантной вакцины Lactobacillus casei оценивали с использованием мышей BALB/c самок шестинедельного возраста, свободных от специфических патогенов (SPF) [10, 18], которые были приобретены в центре животных Шаньдунского сельскохозяйственного университета. Всего 50 мышей были случайным образом разделены на 5 групп по 10 мышей в каждой группе. Мышей иммунизировали рекомбинантной вакциной Lactobacillus casei и очищенным белком (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+полный адъювант Фрейнда) соответственно. Протокол иммунизации выполняли на основе Таблицы 2, а повторную иммунизацию проводили через 13 дней. Для серологического исследования сыворотку собирали через 0, 14 и 28 дней после иммунизации (дпи) посредством перфорации хвостовой вены и хранили при температуре -20 градусов до использования. Фекалии собирали за 1 день до вакцинации и при каждой ревакцинации. Для обнаружения IgA фекалии разбавляли (мас./об.) 0,05 М ЭДТА натрия в соотношении 1:4 сразу после сбора и инкубировали в течение 14 часов при 4 градусах после надлежащего перемешивания. Супернатант собирали центрифугированием 12,000×g и сохраняли при температуре -20 градусов до использования. При разрешении 28 точек на дюйм; по три мыши из каждой группы умерщвляли и обрабатывали кишечник для обнаружения IgA согласно описанному ранее автором методу [10, 18, 23].

Определение анализа уровней антител

Уровни IgG в сыворотке крови и IgA в кале измеряли методами ИФА с некоторыми модификациями [18, 23]. Методы были следующими: полистироловые микротитровальные планшеты на ночь при 4 градусах покрывали 100 мкл белка PEDVS с концентрацией 10 мкг/мл, белка OMP16-PEDVS или 100 мкл рекомбинантного штамма L.casei-OMP16-PEDVS. . После блокировки 5% обезжиренным молоком собранные образцы серийно разводили в PBS, добавляли в трех экземплярах и инкубировали при 37 градусах в течение 1 часа. Затем в каждую лунку добавляли конъюгированное с HRP козье антимышиное IgG или IgA антитело (Invitrogen, США) (1:5000) и инкубировали в течение 1 ч при 37 градусах. Полистироловые микротитровальные планшеты промывали 5 раз на каждом этапе. Наконец, в каждую лунку добавляли по 100 мкл субстрата ТМБ (тетраметилбензидин и H2O2) и через 10 минут добавляли 50 мкл стоп-раствора. Значения ОП при 630 нм измеряли с помощью многомодового планшет-ридера (EnVision).

Анализы нейтрализации вируса

Титры нейтрализующих антител к ВЭДВ в сыворотках крови исследовали по методикам с некоторыми модификациями [25, 26]. Вкратце, мышиную сыворотку инактивировали нагреванием (56 градусов в течение 30 минут), а затем серийно двукратно разводили в 96-луночных планшетах (Corning, США) с трехкратным повторением каждого образца. Затем равный объем 200 штаммов TCID50/50 мкл PEDV добавляли в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 1 часа при 37 градусах. Смесь добавляли в новые 96-луночные планшеты, покрытые монослоями клеток Vero, и инкубировали в течение 1 часа при 37 градусах. Затем клетки промывали и инкубировали в поддерживающей среде при 37 градусах в 5% CO2. Через 2 дня цитопатический эффект (ЦПЭ) наблюдали с помощью инвертированного микроскопа, а нейтральную проклеивающую концентрацию определяли как самую низкую концентрацию антител в сыворотке.

Таблица 2. Иммунный протокол мышей BALB/c

Обнаружение цитокинов

Для выявления секреции цитокинов супернатанты получали от лабораторных мышей (0, 14 и 28 дней). Уровни секретируемых IL-4, IL-10 и IFN- определяли с использованием коммерческих наборов ELISA (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Ухань) согласно рекомендациям производителя соответственно. Цитокин определяли количественно по различным стандартным кривым, полученным из стандартных реагентов, входящих в наборы соответственно, и значение оптической плотности (ОП) определяли при 450 нм на каждом планшете с использованием многорежимного планшет-ридера (EnVision) [23, 27].

статистический анализ

Все данные были получены как минимум из трех независимых экспериментов, а результаты были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ проводился с использованием двустороннего t-теста и одностороннего анализа в программе Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., США). Значительное различие определялось как ∗ p < 0.05, а различные степени значимого различия обозначались как ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ и p < 0,001 соответственно.

Полученные результаты

Верификация рекомбинантных штаммов Lactobacillus casei и BL21.

Для проверки сконструированных рекомбинантных плазмид рекомбинантные экспрессирующие плазмиды pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS и pVE5523-OMP16-PEDVS расщепляли с использованием ферментов рестрикции NcoI/XhoI и Результаты ферментативного расщепления показаны на рис. 1. Размеры целевых полос на электрофореграммах были такими же, как и ожидаемые результаты, а результаты секвенирования показали, что рекомбинантные экспрессирующие плазмиды не обнаруживали мутаций. Эти результаты показали успешное конструирование рекомбинантных плазмид pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS и pVE5523-OMP16-PEDVS. Результаты вестерн-блоттинга показали, что рекомбинантные белки pET28a-OMP16-PEDVS и pET28a-PEDVS экспрессируются в супернатанте BL21-pET28a OMP16-PEDVS и BL21- штаммы pET28a-PEDVS соответственно. Белок pVE5523-OMP16-PEDVS также был подтвержден в культуральном супернатанте штамма L.casei-pVE5523- OMP16-PEDVS. Специфические полосы на рис. 2 показали, что рекомбинантные белки pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS и pET28a-PEDVS были успешно собраны (рис. 2).

Рис. 1. Результаты ферментативного расщепления рекомбинантных плазмид. A: Результаты ферментативного расщепления плазмиды pVE5523-OMP16-PEDVS. М: маркер ДНК-лестницы D8000; 1: плазмида pVE5523-OMP16-PEDVS. B: Результаты ферментативного расщепления плазмиды pet28a-OMP16-PEDVS и pET28a-PEDVS. М: маркер ДНК-лестницы D8000; 1: плазмида pet28a-OMP16-PEDVS; 2: плазмида pET28a-PEDVS

Уровни антител IgG в сыворотке мышей, иммунизированных кандидатными вакцинами

Для оценки специфической иммуногенности созданных вакцин-кандидатов мышей BALB/c отобрали и разделили на 5 групп. Затем уровни IgG в сыворотке и IgA в кале измеряли с помощью коммерческих наборов ELISA. Результаты показали, что не было существенных различий в уровнях IgG среди вакцинированных групп и почти не было обнаружено антител IgG у всех мышей до иммунизации. Однако впоследствии после первой вакцинации были обнаружены существенные различия, и уровни антител IgG в сыворотке через 28 дней были выше, чем через 14 дней. Среди мышей из 5 групп мыши, иммунизированные L.casei-OMP16- PEDVS и BL21-OMP16-PEDVS-F, показали сходную и самую высокую иммуногенность. Таким образом, L. casei-OMP16- PEDVS и BL21-OMP16-PEDVS-F могут обеспечивать наибольшую иммуногенность, за ними следует BL21-OMP16- PEDVS. и БЛ21-ПЭДВС (рис. 3).

Преимущества добавки цистанхе – повышение иммунитета

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Уровни антител IgA в фекалиях мышей, иммунизированных кандидатными вакцинами

Для оценки специфической иммуногенности созданных вакцин-кандидатов также оценивали уровни антител IgA в фекалиях мышей. Результаты показали, что до иммунизации не существовало специальных IgA-антител против PEDVS. Однако большое количество антител IgA в фекалиях мышей, иммунизированных L.casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} Группы мышей }PEDVS и BL21-PEDVS через 14 дней после иммунизации. Через 28 дней после иммунизации уровни антител IgA у мышей, иммунизированных L.casei-OMP16-PEDVS, достигли самого высокого максимума. Между тем, уровни антител IgA в трех других группах не показали очевидного увеличения. Следовательно, вакцина-кандидат L.casei OMP16-PEDVS может стимулировать более высокие уровни антител у иммунизированных мышей по сравнению с BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ Мыши, иммунизированные {18}}PEDVS и BL21- PEDVS (рис. 4).

Рис. 2. Проверка рекомбинантных экспрессирующих белков. М: белковый маркер; 1: секреторный белок из рекомбинантного штамма L.casei pVE5523-OMP16-PEDVS; 2: очищенный белок из штамма BL21- pET28a-OMP16-PEDVS; 3: очищенный белок из штамма BL21-pET28a-PEDVS.

Уровни нейтрализующих антител в сыворотке иммунизированных мышей

Оценить защитное действие вакцин-кандидатов L.casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS. и BL21-PEDVS у мышей измеряли уровни нейтрализующих антител. Результаты показали, что перед иммунизацией не было обнаружено нейтрализующих антител. Нейтрализующее антитело обнаруживалось через 14 дней после иммунизации и увеличивалось через 14 дней после повторной иммунизации. Реакция антител у мышей, получивших L.casei-OMP16-PEDVS, обладала более сильной нейтрализующей активностью против PEDV, чем у мышей, которым перорально вводили BL21-OMP16-PEDVS-F, BL. 21-OMP16-PEDVS и BL21-PEDVS. Таким образом, вакцина-кандидат L.casei OMP16-PEDVS может стимулировать самый высокий уровень нейтрализующих антител, за которым следуют BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}ПЭДВС и БЛ21-ПЭДВС (рис. 5).

Уровни цитокинов

Чтобы сравнить уровень клеточного иммунного ответа L.casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, и у мышей, иммунизированных BL21-PEDVS, определяли IL- 4, IL-10 и IFN- соответственно. Результаты показали, что уровни цитокинов IL-4, IL-10 и IFN- в сыворотке мышей были очень низкими и не имели существенных различий до иммунизации. Тогда как аналогичные изменения наблюдались в результатах IL-4, IL-10 и IFN-. Через 14 дней после иммунизации уровень IL-4, IL-10 и IFN- у мышей, иммунизированных L.casei-OMP16-PEDVS im, был выше, чем у BL21- Мышей, иммунизированных OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS и BL21-PEDVS. Через 14 дней после повторной иммунизации был обнаружен более высокий уровень IL-4, IL-10 и IFN- у мышей, иммунизированных L.casei-OMP16- PEDVS, по сравнению с таковыми у других три группы. Таким образом, вакцина-кандидат L.casei-OMP16-PEDVS может стимулировать самые высокие уровни IL-4, IL-10 и IFN-, за которыми следуют BL21-OMP{{ 40}} ПЭДВС-Ф, БЛ21-ОМП16-ПЭДВС и БЛ21-ПЭДВС (рис. 6).

Рис. 3. Уровни антител IgG вакцин-кандидатов в сыворотке иммунизированных мышей. Сыворотку собирали в дни 0, 14 и 28 дней до или после иммунизации, исследовали с помощью коммерческих наборов ELISA и измеряли при поглощении 450 нм. Столбцы представляют среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. * p < 0.05, ** p < 0,01 и **** p < 0,0001 представляют собой возрастающую степень значимых различий соответственно, а ns означает отсутствие значимой разницы.

Обсуждение

Масштабная вспышка ЭДС, вызванная вариантами ВЭДВ, произошла в октябре 2010 г., что привело к огромным экономическим потерям в Китае и во всем мире [1]. Однако все традиционные вакцины созданы на основе классического штамма CV777, который не может обеспечить достаточную защиту от варианта PEDV [4]. Для контроля над распространением вируса ЭДВ и снижения экономических потерь также разрабатываются новые вакцины из вариантов штаммов вируса ЭДВ. В настоящее время инактивированная вакцина против PEDV и аттенуированная вакцина из вариантов штаммов PEDV одобрены правительством Китая, и все они демонстрируют многообещающие перспективы в борьбе с PEDV. Но дефекты существуют и в двух видах новых вакцин. ВЭДВ инфицирует свиней через пищеварительный тракт и обладает тропизмом к тканям кишечника. Таким образом, иммунитет слизистой оболочки более эффективен, чем системный иммунитет, в предотвращении проникновения PEDV в эпителиальные клетки кишечника, а вакцины должны обеспечивать эффективную защиту слизистой оболочки кишечного тракта. Итак, в этом исследовании мы создаем новый вид вакцины, которая может стимулировать более сильные антитела IgG и IgA против ВЭДВ. Lactobacillus casei обладает потенциальными иммуномодулирующими свойствами в качестве средства доставки вакцин, а экспрессия биологически активных соединений на клеточной стенке этой бактерии может стимулировать соответствующие иммунные реакции [28, 29]. Он широко используется для экспрессии нескольких гетерологичных антигенов вируса папилломы человека, Streptococcus pneumonia и Escherichia coli в качестве вакцин на животных моделях, которые показали превосходную иммуногенность [7–9]. По сравнению с инактивированной вакциной и аттенуированной вакциной векторная вакцина Lactobacillus casei также может стимулировать более высокие уровни IgA и клеточный иммунный ответ. Исследования показали, что первая линия защиты IgA в кишечнике будет лучше, чем IgG, защищать поросят от инфекции PEDV [10, 30]. Поэтому перспективной является разработка своеобразной векторной вакцины против ЭДС Lactobacillus casei. Согласно имеющимся данным, белок S PEDV можно разделить на домены S1 (1–735 аминокислот) и S2 (736-последняя аминокислота) [13], причем белок S1 включает рецептор-связывающую область и основные нейтрализующие эпитопы [14]. Core-нейтрализующий эпитоп (COE) может индуцировать сильные нейтрализующие антитела против PEDV [31, 32]. В сочетании с анализом антигенности для конструирования рекомбинантной плазмиды была выбрана частичная последовательность гена S1 (1477–2124 п.н.). Было доказано, что выбранный небольшой фрагмент не только обладает хорошей иммуногенностью, но и способствует секретируемой экспрессии Lactobacillus casei. С другой стороны, Паскевич обнаружил, что белок 16 внешней мембраны Brucella abortus может активировать дендритные клетки in vivo, индуцирует иммунный ответ th1 и является многообещающей самоадъювантной вакциной против системного и перорального бруцеллеза [15]. Аналогичные исследования показали, что нелипидированный белок внешней мембраны omp16 из Brucella spp. Также было доказано, что назальный адъювант может индуцировать иммунный ответ Th1 и модулировать аллергический ответ Th2 на белки коровьего молока [16]. Поэтому в нашем исследовании для создания рекомбинантной плазмиды для усиления иммунной функции была выбрана частичная последовательность гена omp16. Чтобы узнать, может ли новая рекомендованная вакцина Lactobacillus casei вызывать гуморальный иммунный ответ, были измерены уровни IgG, IgA и нейтрализующих антител. Уровень антител IgG у мышей, иммунизированных рекомбинантной вакциной L.casei-OMP16- PEDVS, не имел существенных различий с мышами, иммунизированными рекомбинантной вакциной BL21-OMP16-PEDVS-F. Однако уровни IgA и нейтрализующих антител были выше, чем у BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S и BL{{47 }}Мыши, иммизированные рекомбинантной вакциной PEDVS. Результаты показали, что L.casei-OMP16-PEDVS может вызывать более сильные гуморальные иммунные реакции, особенно уровни антител IgA. Исследования показали, что IgA является первой линией защиты в кишечнике и будет лучше, чем IgG, защищать поросят от инфекции PEDV [30]. Исследование также подтвердило тот результат, что рекомбинантная вакцина L.casei-OMP16-PEDVS может обеспечить лучшую иммунологическую защиту от PEDV. Чтобы изучить тип иммунного ответа, индуцированного рекомбинантным L.casei-OMP16-PEDVS, определяли уровни IL-4, IL-10 и IFN- для оценки активности T лимфоциты. Согласно сообщению, IFN- играет важную роль в клеточном иммунном ответе, вызываемом проникновением патогенов в организм, IL-4 играет важную роль в гуморальном иммунном ответе и способствует повышению иммунной толерантности и иммунитета слизистой оболочки [33], IL -10 играет важную роль в борьбе с микробной инфекцией слизистой оболочки и поддержании целостности барьера слизистой оболочки кишечника [34]. Между тем, результаты обнаружения цитокинов показали, что мыши, иммунизированные рекомбинантной вакциной L.casei-OMP16-PEDVS, могут индуцировать более сильную экспрессию IL-4, IL-10 и IFN-, которые подтвердили результаты о том, что рекомбинантная вакцина L.casei-OMP16-PEDVS может индуцировать более сильный гуморальный иммунный ответ, уровень антител IgA и клеточный иммунный ответ соответственно.

Рис. 5. Уровни нейтрализующих антител вакцин-кандидатов в сыворотке иммунизированных мышей. Сыворотку собирали в дни 0, 14 и 28 дней до или после иммунизации и исследовали с помощью теста на нейтрализацию. Столбцы представляют среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. * p < 0.05, ** p < 0.01 и **** p < 0,0001 представляют возрастающую степень значимых различий соответственно, а ns означает отсутствие значимых различий. разница

Рис. 6. Определение уровней цитокинов в сыворотке иммунизированных мышей. Сыворотку собирали в дни 0, 14 и 28 дней до или после иммунизации и исследовали с помощью коммерческих наборов ELISA. Значение поглощения измеряли при поглощении 450 нм для IL-4 (а), IL-10 (b) и IFN- (c) соответственно. Столбцы представляют среднее значение ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. * p < {{10}},05, ** p < 0,01 и **** p < 0,0001 представляют собой возрастающую степень значимых различий соответственно.

Заключение

Таким образом, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS и BL{{7 }}В этом исследовании были созданы вакцины-кандидаты PEDVS. Тем временем оценивали уровни гуморального иммунного ответа и клеточного иммунного ответа на эти вакцины-кандидаты у мышей. Результаты показали, что мыши, иммунизированные L.casei-OMP16-PEDVS, могли продуцировать более высокие уровни IgG, IgA, нейтрализующих антител, IL-4, IL- 10 и INF- по сравнению с мыши, иммунизированные BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS и BL21-PEDVS. Таким образом, рекомбинантная вакцина-кандидат L.casei OMP16-PEDVS может создать основу для разработки безопасной, эффективной и удобной рекомбинантной мукозной вакцины для профилактики инфекции PEDV.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Рекомендации

1. Ван Д., Фанг Л., С. X. Эпидемическая диарея свиней в Китае. Вирус Рес. 2016 г.; 226:7–13.

2. Суеоши М., Цуда Т., Ямадзаки К., Ёсида К., Накадзава М., Сато К. и др. Иммуногистохимическое исследование эпидемической диареи свиней. J Comp Патол. 1995;113(1):59–67.

3. Сунь Р.К., Цай Р.Дж., Чэнь Ю.К., Лян П.С., Сун CXJEID. Вспышка эпидемической диареи свиней среди поросят-сосунов, Китай. Экстренное заражение Dis. 2012 г.; 18(1):161–3.

4. Тонг Ю., Фэн Л., Ли В. Разработка бикомбинированной аттенуированной вакцины против вируса трансмиссивного гастроэнтерита и вируса эпидемической диареи свиней. Чин Дж. Предыдущая ветеринарная медицина. 1999;21(6):35–9.

5. Пауэлс П.Х., Леер Р.Дж., Боерсма В.Дж. Потенциал лактобактерий как носителя для пероральной иммунизации: разработка и предварительная характеристика векторных систем для адресной доставки антигенов. Дж. Биотехнология. 1996;44(1–3):183.

6. Цай Ю.Т., Ченг П.С., Пан Т.М. Биотехнология: Иммуномодулирующее действие молочнокислых бактерий для улучшения иммунных функций и преимуществ. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Адачи К., Кавана К., Ёкояма Т., Фуджи Т., Томио А., Миура С. и др. Пероральная иммунизация вакциной Lactobacillus casei, экспрессирующей вирус папилломы человека (ВПЧ) типа 16 E7, является эффективной стратегией индукции цитотоксических лимфоцитов слизистой оболочки против HPV16 E7. Вакцина. 2010;28(16):2810–7.

8. Кампос И.Б., Дарье М., Феррейра Д.М., Мияджи Э.Н., Сильва Д.А., Ареас А.П.М. и др. Назальная иммунизация мышей Lactobacillus casei, экспрессирующими пневмококковый поверхностный белок А: индукция антител, отложение комплемента и частичная защита от заражения Streptococcus pneumoniae. Микробы заражают. 2008;10(5):481–8.

9. Вэнь Л.Дж., Хоу С.Л., Ван Г.Х., Юй Л.И., Вэй С.М., Лю Дж.К. и др. Иммунизация рекомбинантными штаммами Lactobacillus casei, продуцирующими фимбриальный белок К99 и К88, защищает мышей от энтеротоксигенной Escherichia coli. Вакцина. 2012;30(22): 3339–49.

10. Го М, Йи С, Го Й, Чжан С, Ню Дж, Ван К и др. Создание рекомбинантного штамма Lactococcus Lactis, экспрессирующего вариантный ген S1 вируса эпидемической диареи свиней, и анализ его иммуногенности на мышах. Вирусный иммунол. 2019;32(3):144–50.

11. Ван X, Ван Л, Чжэн Д. Пероральная иммунизация вакциной против вируса эпидемической диареи свиней (PEDV) на основе Lactobacillus casei, экспрессирующей микроскладчатый пептид Co1, нацеленный на клетки, слитый с COE-антигеном PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Дуарте М., Тоблер К., Бриджен А., Расшерт Д., Акерман М., Х.Л. Анализ последовательности генома вируса эпидемической диареи свиней между генами нуклеокапсида и белка-шипа выявляет полиморфную ORF. Вирусология. 1994;198(2):466.

13. Ли Д.К., Пак К.К., Ким Ш., Ли С. Гетерогенность в генах шиповидных белков вирусов эпидемической диареи свиней, выделенных в Корее. Вирус Рес. 2010;149(2): 175–82.

14. Сунь Д.Б., Фэн Л., Ши Х.И., Чен Дж.Ф., Лю С.В., Чэнь Х.И. и др. Область шипового белка (а.а. 636789) вируса эпидемической диареи свиней необходима для индукции нейтрализующих антител. Акта Вирол. 2007;51(3):149–56.

15. Паскевич К.А., Гарсия Самартино С., Кориа Л.М., Эстейн С.М., Цвердлинг А., Ибанез А.Е. и др. Белковая часть белка 16 внешней мембраны Brucella abortus представляет собой новую молекулярную структуру, связанную с бактериальными патогенами, которая активирует дендритные клетки in vivo, индуцирует иммунный ответ Th1 и является многообещающей самоадъювантной вакциной против системного и перорального бруцеллеза. Дж Иммунол. 2010;184(9):5200.

16. Ибанез А.Е., Смальдини П., Кориа Л.М., Дельпино М.В., Пасифико Л.Г., Оливейра С.К. и др. Неликвидированный белок внешней мембраны Omp16 (U-Omp16) из Brucella spp. в качестве назального адъюванта индуцирует иммунный ответ Th1 и модулирует аллергический ответ Th2 на белки коровьего молока. ПЛОС Один. 2013;8(7):e69438.

17. Паскевич К.А., Эстейн С.М., Самартино К.Г., Цвердлинг А., Кориа Л.М., Баррионуево П. и др. Иммунитет: Иммунизация рекомбинантным белком внешней мембраны видов Brucella Omp16 или Omp19 в адъюванте индуцирует специфические CD4+ и CD8+ Т-клетки, а также системную и пероральную защиту от инфекции Brucella abortus. Заразить иммунитет. 2009;77(1):436–45.

18. Ма С., Ван Л., Хуан Х., Ван Х., Чен С., Ши В. и др. Пероральная рекомбинантная вакцина Lactobacillus, нацеленная на микроскладки кишечника и дендритные клетки для доставки основного нейтрализующего эпитопа вируса эпидемической диареи свиней. Заводы по производству микробных клеток. 2018;17(1):20.

19. Чу С., Чжан Д., Ван Д., Чжи Й., Чжоу П. Гетерологичная экспрессия и биохимическая характеристика ассимиляционной нитратной и нитритредуктазы выявляют адаптацию и потенциал Bacillus megaterium NCT-2 во вторично засоленной почве. Int J Биол Макромол. 2017;101:1019.

20. Го Н, Чжан Б, Ху Х, Е С, Чен Ф, Ли З и др. Caerin1.1 подавляет рост вируса эпидемической диареи свиней in vitro посредством прямого связывания с вирусом. Вирусы. 2018;10:9.

21. Чен З., Лин Дж., Ма С., Чжао С., Ше К., Лян Ю. Биотехнология: характеристика pMC11, плазмиды с двойным началом репликации, выделенной из Lactobacillus casei MCJ, и конструирование челночных векторов с каждым репликоном. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Сяона В., Ли В., Сюевэй Х., Суньтинг М., Мэйлин Ю., Вэнь С. и др. Пероральная доставка пробиотиков, экспрессирующих пептид, нацеленный на дендритные клетки, слитый с антигеном COE вируса эпидемической диареи свиней: многообещающая стратегия вакцинации против PEDV. Вирусы. 2017;9(11):312.

23. Бхуян А.А., Мемон А.М., Бхуян А.А., Чжунхуа Л., Чжан Б., Йе С. и др. Создание рекомбинантной Lactobacillus casei, экспрессирующей белок E2 BVDV, и ее иммунный ответ у мышей. Дж. Биотехнология. 2018;270:51–60.

24. Ной Н.В., Чунг YCJB, Оборудование B. Оптимизация экспрессии и очистки рекомбинантного домена S1 белка спайка вируса эпидемической диареи свиней (PEDV-S1) в Escherichia coli. Биотехнологическое оборудование. 2017;31(2):1–11.

25. Ли С, Ли В, Эсесарте Э, Го Х, Эльзен П, Аартс Э и др. Домены прикрепления клеток шиповидного белка вируса эпидемической диареи свиней являются ключевыми мишенями нейтрализующих антител. Дж Вирол. 2017;91(12):1–16.

26. Вэнь З, Сюй З, Чжоу Ц, Ли В, Ву Ю, Ду Ю и др. Пероральное введение покрытых PEDV микросфер вызывало у поросят-отъемышей специфичный к PEDV иммунитет. Вакцина. 2019;09(014):161–6.

27. Гао К., Чжао С., Цинь Т., Инь Ю., Ян К. Влияние вируса эпидемической диареи свиней на дендритные клетки, полученные из моноцитов свиней, и дендритные клетки кишечника. Ветеринарный микробиол. 2016;106:149–58.

28. Боне М.Б., Чавес А.С., Месон О. Иммуномодулирующая и противовоспалительная активность, индуцированная пероральным введением пробиотического штамма Lactobacillus Casei. Воспаление. 2006;4(1):31–41.

29. Гранжетт С., Мюллер-Алуф Х., Джеффрой М.С., Гудеркур Д., Тернер М., Мерсеньер А. Защита от столбнячного токсина после внутрижелудочного введения двух рекомбинантных молочнокислых бактерий: влияние жизнеспособности штамма и персистенции in vivo. Вакцина. 2002;20(27–28):3304–9.

30. Сон Д.С., О Дж.С., Кан Б.К., Ян Дж.С., Мун Х.Дж., Ю Х.С. и др. Пероральная эффективность штамма DR13 вируса эпидемической диареи свиней, ослабленного клетками Vero. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Макадия Н., Браунли Р., Ян В., Берубе Н., Аллан Б., Гердтс В. и др. Домен S1 шиповидного белка вируса эпидемической диареи свиней в качестве вакцинного антигена. Вирол Дж. 2016; 13:1.

32. Чанг С.Х., Бэ Дж.Л., Кан Т.Дж., Джу К., Чунг Г.Х., Лим К.В. и др. Клетки: Идентификация эпитопной области, способной индуцировать нейтрализующие антитела против вируса эпидемической диареи свиней. Мол Клетка. 2002;14(2): 295–9.

33. Суми Т., Фукусима А., Фукуда К., Кумагай Н., Нисида Т., Ягита Х. и др. Дифференциальный вклад B7–1 и B7–2 в развитие экспериментального аллергического конъюнктивита у мышей. Иммунол Летт. 2007;108(1):62–7.

34. Сюэ М, Чжао Дж, Ин Л, Фу Ф, Ли Л, Ма Ю и др. IL-22 подавляет заражение кишечными коронавирусами и ротавирусом свиней путем активации сигнального пути STAT3. Антивирь Рес. 2017;142:68–75.