Глобальная распространенность хронической болезни почек (ХБП) увеличивается по мере старения населения

Пожалуйста, свяжитесь с oscar.xiao@wecistanche.com для получения дополнительной информации.

Фон:Фиброз является одним из наиболее распространенных патологических признаков процесса старения почек, а фиброз в стареющих почках также усугубляет процесс хронической болезни почек (ХБП). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) — широко используемое растительное лекарство в китайском фольклоре. Однако в нескольких исследованиях сообщалось о его фармакологических эффектах. Это исследование было направлено на изучение влияния этанольного экстракта CF на почечный фиброз у мышей SAMP8 и выявление потенциально активных соединений.

Методы:Мыши, склонные к ускоренному старению, 8 (SAMP8) использовали в качестве животных моделей, и различные дозы CF вводили через желудочный зонд в течение одного месяца. Для наблюдения за степенью почечного старения у мышей использовали окрашивание -галактозидазой. Окрашивание по Массону и уровни экспрессии Col-II, a-SMA и FN использовали для оценки почечного фиброза у мышей. Измеряли уровни экспрессии белка пути Nrf2 и пути Wnt/-катенин/RAS в почках. И -галактозидаза (-gal) индуцировала клетки NRK-52E в качестве модели in vitro для скрининга активных компонентов муковисцидоза.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Полученные результаты:Этаноловый экстракт CF значительно ингибировал активность почечной β-галактозидазы и уровни экспрессии Coll, a-SMA и FN у мышей SAMP8, а также улучшал окрашивание по Массону у мышей SAMP8. CF заметно снижал уровень белка в моче, креатинина, азота мочевины и сывороточные уровни TNF-α и IL-1 у мышей SAMP8 и значительно увеличивал уровни SOD и GSH-Px. Более того, CF активировал путь Nrf2 и блокировал путь Wnt/-catenin/RAS в почках мышей. Кроме того, 3,4-дигидроксифенилэтанол (SDC-0-14,16) и (3,4-дигидроксифенилэтанол-8-O-[4-O-транс -кофеоил- -D-апиофуранози-(1→3)- -D-глюкопиранозил (1→6)]- -D-глюкопиранозид (SDC-1-8) были выделены из CF , что уменьшило старение NRK-52E-клеток, и, возможно, активные ингредиенты CF играют антивозрастную роль.

Выводы:Наши эксперименты показали, что этанольный экстракт CF может уменьшать почечный фиброз у мышей SAMP8 через путь Wnt/-катенин/RAS. И SDC-0-14,16 и SDC-1-8 могут быть материальной основой для CF, чтобы оказывать эффекты, связанные с антипочечным старением.

Ключевые слова:Старение, Corallodiscus flabellata, Почки, Почечный фиброз, SAMP8, Старение, Wnt/-катенин/RAS

Введение

Глобальная распространенность хронической болезни почек (ХБП) увеличивается по мере старения населения и ложится тяжелым бременем на общество [1-3]. Наиболее частым патологическим проявлением ХБП является некоторая форма почечного фиброза [4]. Точно так же почечный фиброз также является одним из признаков старения почек [2]. Исследования показали, что окислительный стресс, воспаление, Wnt/-катенин, ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС) и передача сигналов рапамицином (mTOR) связаны с ХБП, вызванной старением [5]. Почечный фиброз в стареющих почках тесно связан с активацией сигнального пути Wnt/-catenin и RAS [6]. После активации Wnts -катенин в цитоплазме перемещается в ядро, где он связывается с фактором связывания лимфоидного энхансера (LEF)/фактором транскрипции Т-клеточного фактора (TCF) и инициирует транскрипцию нижестоящих генов-мишеней. Интересно, что промоторная область гена RAS также содержит сайты связывания LEF/TCF, что позволяет -катенину способствовать связыванию LEF-1 с этими сайтами [7].цистанхе холестерин,Следовательно, воздействие на сигнальный путь Wnt/-катенин/RAS может быть потенциальной терапевтической стратегией при почечном фиброзе [8,9]. В последние годы заместительная терапия почечного фиброза натуральными продуктами привлекла внимание многих ученых [10]. . Xiaoyan Shen et al. обнаружили, что гинзенозид Rgl улучшает гломерулярный фиброз при старении почек путем ингибирования активации воспалительной реакции NLRP3 у мышей SAMP8 [11]. В этом исследовании изучалось влияние экстракта C. flabellate (CF) на почечный фиброз у мышей SAMP8 с помощью пути Wnt/-катенин/RAS.

Цистанхе может омолаживать

CF как лекарственное растение в Китае впервые было зарегистрировано в «Dian Nan Ben Cao». Все растение обычно используется для лечения дизентерии, преждевременной эякуляции, болезни семенных пузырьков и заболеваний почек в районах проживания этнических меньшинств Китая [12]. В настоящее время , в современных исследованиях мало сообщений о CF. Фармакологические исследования в нашей лаборатории показали, что экстракт CF обладает мочегонным действием и улучшает липополисахарид/D-галактозамин-индуцированную печеночную недостаточность и повреждение головного мозга у крыс [13, 14].И фитохимические исследования на он показал, что фенилэтаноидные гликозиды и флавоноиды были основными химическими компонентами CF [15,16].Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать влияние экстракта CF на почечный фиброз у мышей SAMP8 и выяснить его возможный механизм, чтобы обеспечить экспериментальные данные по лечению заболеваний почек при муковисцидозе описаны в древних книгах.

материалы и методы

Сбор и экстракция растительного материала

«Юньнаньская китайская травяная медицина» отмечает, что муковисцидоз можно собирать в течение всего года. Растения CF, использованные в этом эксперименте, были собраны в сентябре в уезде Сися, провинция Хэнань, Китай. Он был идентифицирован профессором Суйцином Ченом из Хэнаньского университета китайской медицины, и образцы хранились в библиотеке лабораторных образцов.Побочные действия цистанхе пустынногоРастения (1 кг) кипятили с обратным холодильником в 50%-ном этаноле (3×12 л, каждые 1 ч) и смесь фильтровали через 16 слоев марли. Объединенные фильтраты сушили на роторном испарителе с использованием лиофилизатора. Наконец, процентный выход 50-процентного этанольного сырого экстракта CF составил 15,5 процента. Высушенный экстракт хранили в холодильнике до дальнейшего использования. В дополнительных материалах перечислены соответствующие данные о назначении ингредиентов экстракта CF.

Другой процесс разделения, о котором сообщалось ранее, использовался в этом исследовании для получения фракции элюирования водой, фракции элюирования 20% этанола, фракции элюирования 30% этанола и фракции элюирования 40% этанола из CF [13]. 40-процентную этанольную фракцию разделяли с использованием Sephadex LH-20 и колонки с силикагелем и очищали с помощью полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с получением таких соединений, как SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(п-гидроксибензиловый спирт).

Животные и администрация

В этом исследовании использовались шестимесячные самцы SAMP8 и устойчивые к ускоренному старению мыши 1 (SAMR1) из Первой дочерней больницы Тяньцзиньского университета традиционной китайской медицины (Тяньцзинь, Китай). Животных содержали в условиях контролируемого освещения (12-ч цикл свет/темнота), температуры (23-25 градусов C) и влажности (45-55 процентов) и получали стандартную диету и воду с добавлением воды. либитум. В общей сложности 48 мышей SAMP8 были разделены на четыре экспериментальные группы (n=12/группа): мыши модели SAMP8 (M), мыши SAMP8, получавшие низкие дозы этанольного экстракта CF (CF-L, 387,5 мг/кг, внутрижелудочно), мыши SAMP8, получавшие средние дозы этанольного экстракта CF (CF-M, 775 мг/кг, внутрижелудочно), и мыши SAMP8, получавшие высокие дозы этанольного экстракта CF (CF-H, 155 0 мг/кг). кг, внутрижелудочно). Мышей в контрольной группе SAMRI (Con, n=10) и модельной группе SAMP8 (M) лечили физиологическим раствором (0,9%). Всех мышей лечили перорально в течение 1 месяца. Все эксперименты на животных были одобрены комитетом по этике Хэнаньского университета китайской медицины и проводились в соответствии с институциональными рекомендациями (Хэнань, Китай, номер утверждения: HACTCM-2018009060-19). Во время эксперимента в каждой из групп Con и M погибло по одной мыши, а в группе CF-H погибло две мыши.

Сбор образцов

В конце эксперимента мышей по отдельности поместили в метаболические клетки на 12- часов сбора мочи. Затем мышей анестезировали изофлураном и собирали образцы крови путем ретроорбитального кровотечения. Затем почки каждой мыши удаляли хирургическим путем и хранили при 80°C до проведения анализов.

Культура клеток и исследование in vitro

Клетки NRK-52E, приобретенные в Банке клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай), культивировали для изучения влияния экстракта CF на старение клеток, вызванное D-галактозой (D-gal, S11050, Yuanye, Шанхай, Китай). Клетки NRK-52E выращивали в модификации Дульбекко среды Игла Дульбекко (DMEM, 12 100 046, Thermo Fisher, Массачусетс, США), снабженной 10-процентной фетальной бычьей сывороткой, в инкубаторе при 37°C и в присутствии 5 процентов , CO. Клетки выращивали в 96-луночных планшетах или 6-луночных планшетах до 80-85 процента слияния, а затем обрабатывали питательной средой, содержащей различные комбинации лекарственных средств: среда плюс D-gal ( 20 мг/мл), среда плюс D-гал плюс CF (10, 25, 50, 100 мкг/мл) или среда плюс D-гал плюс мономерное соединение (10 мкМ) соответственно в течение 48 ч. Затем метилтиазолилтетразолий( Анализ MTT использовали для определения жизнеспособности клеток, а окрашивание -галактозидазой использовали для наблюдения за старением клеток.

Окрашивание -галактозидазой, связанное со старением

Замороженные почки мышей, нарезанные на срезы толщиной 10-мкм, и клетки NRK-52E окрашивали ассоциированной со старением -галактозидазой (SA{5}}gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) следуя протоколам производителя.

Гистологический анализ

Срезы почек фиксировали 4-процентным забуференным параформальдегидом, а срезы толщиной 10- мкм, залитые парафином, окрашивали трихромом Массона (G1{9}}06, Service, Ухань, Китай) и исследовали под микроскопом. Области синего цвета в срезах, окрашенных трихромом по Массону, были количественно измерены в шести случайно выбранных полях и проанализированы с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0.

Биохимические измерения

Образцы сыворотки и гомогената почек оттаивали до комнатной температуры и определяли уровни супероксиддисмутазы (SOD, CSB-E08556m, Ухань Хуамей, Ухань, Китай), глутатионпероксидазы (GSH-Px, A 005-1-2, Nanjing Jiancheng, Нанкин, Китай), интерлейкин-1 (IL-1, RK00006, ABclonal, Ухань, Китай), фактор некроза опухоли- (TNF-, RK00027, ABclonal, Ухань, Китай), азот мочевины (C{ {10}}, Нанкин Цзяньчэн, Нанкин, Китай), креатинин (Cr, C011-2-1, Нанкин Цзяньчэн, Нанкин, Китай) в сыворотке мыши, общий белок мочи (C035-2-1, Нанкин Цзяньчэн, Нанкин , Китай) в моче мыши и уровни экспрессии коллагена I типа (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Ухань, Китай), -актина гладких мышц (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Ухань, Китай), фибронектина (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, China) в тканях почек мышей измеряли последовательно в соответствии с протоколом производителя набора для анализа.

Иммуногистохимический анализ

Иммуногистохимический анализ проводили общепринятым методом [17]. Используемые антитела включали следующие: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Чикаго, США), -катенин (17565-1-AP, Proteintech, Чикаго, США), рецепторы ангиотензина II типа 1 (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Чикаго, США), р-ядерный фактор, 2-родственный эритроидному фактору 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Кембридж, Великобритания), pc-Fos (ab27793, Abcam, Кембридж, Великобритания) ), фактор роста соединительной ткани (CTGF, GB11078, Service, Ухань, Китай). Срезы наблюдали под микроскопом (Olympus, Токио, Япония).доза цистанхеИзмерьте площадь и интегральную оптическую плотность (IOD) области с выражением загара с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus 6.0 и рассчитайте среднюю оптическую плотность (MOD, MOD=IOD/площадь) для полупрозрачных -количественный анализ.

Вестерн-блот анализ

Вестерн-блоттинг проводили, как описано в предыдущем исследовании [18]. Вкратце, ткани почек гомогенизировали в лизирующем буфере и количественно определяли с использованием набора для анализа белков Брэдфорда (AR0197, Boster Biological Technology, Ухань, Китай). Затем гомогенаты подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, переносили на поливинилиденфторидную мембрану и блокировали блокирующим буфером (4% обезжиренное сухое молоко) в течение 90 мин. Затем их инкубировали с первичными антителами (Wnt4; ренин; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; белок 1, ассоциированный с Kelch-подобным ECH (Keapl, GB11847, Service-bio, Ухань, Китай); актин (AC026, Abclonal, Ухань, Китай); и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH, AC033, Abclonal, Ухань, Китай)) в течение ночи при 4°С с последующей инкубацией с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с присутствием флуоресцентного вещества, в течение 1 ч при комнатной температуре. . Интересующие белки сканировали с помощью ИК-сканера Odyssey (LI-COR Biosciences, Небраска, США) и количественно определяли интенсивность сигнала с использованием программного обеспечения Image Studio. Уровни белка нормализовали по отношению к -актину или GAPDH.

UPLC-Q-TOF-MS анализ образцов почек

Ткани почек взвешивали и гомогенизировали в охлажденном льдом физиологическом растворе (вес/объем =1:1). Затем к 200 мкл образцов гомогената ткани добавляли 1 мл ацетонитрила с последующей ультразвуковой экстракцией в течение 30 мин. Экстракт центрифугировали при 12,{7}} g и 4 градусах в течение 10 мин. Супернатант отбирали во флакон для анализа. Хроматографическое разделение осуществляли на сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, USA) с системой LC, включающей колонку Acclaim RSLC 120 C18 (2,2 мкм, 2,1×100 мм); Термо Сайентифик).Преимущества экстракта цистанхеПодвижная фаза состояла из растворителя А (ацетонитрил) и воды с {{0}},1% муравьиной кислоты (В). Разделение проводили с помощью градиентной элюции следующим образом: 10-70 процент А от 0 до 3 мин, 70-78 процент А от 4 до 13 мин, 78-90 процент А от 14 до 15 минут, 90 процентов -10 процентов A с 15 до 16 минут и 10 процентов A с 16 до 20 минут. Объем инъекции тестируемого образца составлял 2 мкл. Масс-спектрометрический (МС) анализ проводили с использованием источника ESI при следующих условиях: капиллярное напряжение в положительном режиме составляло 3,5 кВ, а капиллярное напряжение в отрицательном режиме составляло 3,2 кВ. Давление распылителя 2,0 бар, температура сухого газа 230 градусов, скорость потока 8 л/мин.

статистический анализ

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; однофакторный дисперсионный анализ был использован для сравнения между группами. Значение АР менее 0,05 считалось статистически значимым.

Полученные результаты

CF улучшил старение и фиброз почек у мышей SAMP8

Чтобы исследовать влияние CF на почки мышей SAMP8, в почках измеряли активность SA- -gal. На рис. 1а активность SA- -gal в тканях почек значительно увеличилась в группе М (синее усиление). Введение CF-L и CF-M значительно ингибировало активность -галактозидазы в почках мышей SAMP8, в то время как улучшение с помощью CF-H не было значительным. Кроме того, почечный индекс в модельной группе был значительно ниже, чем в контрольной группе (рис. 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

МВ улучшил функцию почек, окислительный стресс и уровни воспаления у мышей SAMP8

Кроме того, исследовали показатели функции почек каждой группы мышей, в том числе объем мочи у мышей за 12 ч, уровень Cr и азота мочевины в сыворотке крови, уровень белка в моче. Как показано на рис. 2a-d, уровни белка мочи, сывороточного Cr и азота мочевины сыворотки в модельной группе были значительно выше, чем в контрольной группе (рис. 2a, P).<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">Цистанче ЧингисханЗатем было изучено, влияет ли CF на окислительный стресс и воспаление в почках быстро стареющих мышей. Как показано на рис. 2e-h, уровни SOD и GSH-Pxin в почках группы М были значительно ниже, чем у группы Con, а уровни IL-1 были значительно выше, чем у группы Con. группа Кон. После лечения CF вышеперечисленные показатели улучшились, особенно лучше эффект улучшения от CF-L и CF-M.

МВ активировал путь Nrf2 в почках мышей SAMP8.

Уровень экспрессии p-Nrf2 измеряли в тканях почек, чтобы выяснить, участвует ли путь Nrf2 в защитном эффекте CF (рис. 3a-c) в настоящем исследовании. Уровень экспрессии p-Nrf2 значительно снизился только в группе SAMP8 (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF ослабляет активацию передачи сигналов Wnt/-catenin/RAS в почках мышей SAMP8

Для дальнейшего изучения потенциального механизма МВ, оказывающего антифиброзный эффект. Локализацию белка проводили с помощью иммуногистохимии. Как показано на рис. 4а, уровень экспрессии Wnt4 и

-катенин индуцировался преимущественно в клетках почечных канальцев. Сходные результаты наблюдались при оценке AGTR1, мишеней нижестоящего пути передачи сигналов Wnt (Fig. 4a). После этого была проведена количественная оценка уровня экспрессии белка, и результаты показали, что белки Wnt4, -катенин, ренин и AGTR1 накапливались в ткани почек мышей в модельной группе, тогда как CF значительно ингибировал эти изменения (рис. 4б-е). ). Кроме того, уровень экспрессии CTGF также определяли и количественно анализировали. В соответствии с вышеупомянутыми результатами, CTGF в основном экспрессировался в почечных канальцах, а CF заметно ингибировал активность CTGF (рис. 4d g).

CF и его соединения ингибировали старение клеток NRK-52E, индуцированное D-gal.

D-gal-индуцированные NRK-52E-клетки использовали для скрининга некоторых действующих веществ при МВ, для определения материальной основы лечения сенильных почек экстрактом МВ. Результаты показали, что CF увеличивал жизнеспособность клеток дозозависимым образом, а соединения

SDC-0-14,16 и SDC-1-8, выделенные из муковисцидоза, лучше влияли на пролиферацию клеток. Кроме того, 25 мкг/мл CF и соединения SDC-0-14,16 и SDC-1-8 проявляли эффект ингибирования активности -галактозидазы (рис. 5).

CF улучшил анализ PCA ткани почек у мышей SAMP8 Анализ основных компонентов (PCA) был выполнен для изучения эффектов CF на мышах SAMP8. Как показано на рис. 6а, существует очевидная группировка между контрольной и модельной группами (R2X=0.542; Q2=0.38), что позволяет предположить, что эндогенные метаболиты мышей SAMP8 отличались от SAMR1. мышей, что заставляет их отклоняться от группы SAMR1. Как показано на рис. 6b, разные группы CF также сгруппированы в разные классы из контрольной и модельной групп, и группы CF приблизились к контрольной группе, что указывает на то, что

эндогенные метаболиты мышей SAMP8 с муковисцидозом были аналогичны метаболитам мышей SAMR1.

Обсуждение

Старение играет важную роль в прогрессировании ХБП [19]. По мере прогрессирования фиброза ХБП стареющие клетки экспрессируют и секретируют профибротические факторы (TGF-, CTGF и т. д.) и провоспалительные факторы (IL-1, IL-6, TNF- и т.д. ), которые являются факторами секреторного фенотипа, ассоциированными со старением, тем самым ускоряя почечный фиброз [20, 21]. В настоящее время традиционная китайская медицина достигла хороших результатов в лечении почечного фиброза с меньшим количеством побочных эффектов [22]. В этом исследовании изучалось интервенционное воздействие экстракта CF на почечный фиброз у мышей SAMP8. Для этого исследования была выбрана линия мышей SAMP8, которая была разработана на основе показателей продолжительности жизни, старения и патологических фенотипических оценок мышей AKR/ и представляла собой модель ускоренного старения исключительно генетического происхождения [23,24]. Исследования показали, что изменения почечной патологии мышей линии SAMP8 (9 месяцев) включают тубулоинтерстициальный фиброз и фокально-сегментарный гломерулосклероз [25]. И было обнаружено, что фиброз почек у мышей SAMP8 связан с возрастом [6]. Поэтому мы проверили активность -галактозидазы и

уровень почечного фиброза у мышей SAMP8 и обнаружили, что CF-L и CF-M улучшают фиброз почек и активность -галактозидазы у мышей SAMP8 (рис. 1). И мы также проверили выделение мочи у мышей. В соответствии с ранее опубликованными исследованиями, показывающими, что CF, полученный двумя разными способами, обладает мочегонным действием [13], экстракт значительно увеличивает объем мочи у мышей SAMP8. Кроме того, настоящее исследование показало, что добавки с CF улучшали функцию почек, активность антиоксидантных ферментов и уровни воспалительных факторов у мышей SAMP8 (рис. 2).

В последние годы система Keap1-Nrf2 привлекла внимание многих ученых благодаря своим антиоксидантным и противовоспалительным свойствам. Его фармакологический потенциал в лечении заболеваний почек широко изучался в доклинических и клинических исследованиях [26]. Nrf2 является основным регулятором транскрипции генов, связанных с окислительно-восстановительным статусом и антиоксидантными эффектами [27]. Исследования показали, что фосфорилирование необходимо для активации Nrf2 и индукции гена-мишени [28]. Активация Nrf2 улучшала прогрессирование ХБП, предотвращая окислительный стресс и поддерживая клеточный окислительно-восстановительный гомеостаз [29]. Являясь ключевым фактором транскрипции, Nrf2 играет решающую роль в защите от окислительного стресса, регулируя нижестоящие антиоксиданты и ферменты детоксикации [30]. Ким и др. сообщили, что ресвератрол, как мощный активатор Nrf2, улучшает прогрессирующее повреждение почек, связанное со старением [31]. В настоящем исследовании CF улучшал аттенуацию Nrf2 в почках мышей SAMP8, не влияя на уровень экспрессии Keapl, что позволяет предположить, что неочищенный экстракт CF может улучшать окислительное повреждение в почках путем активации пути Nrf2 (рис. 3).

Почечный фиброз характеризуется чрезмерным отложением внеклеточного матрикса (ECM), что приводит к образованию рубцов в почечной паренхиме [32]. Трансформирующий фактор роста- (TGF-) считается ключевым цитокином в гиперактивации фибробластов [33, 34]. Конечно, воздействия только на сигнальный путь TGF недостаточно для уменьшения почечного фиброза. Некоторые исследования показали, что CTGF, Wnt/-катенин, ренин-ангиотензиновая система, окислительный стресс и т. д. вовлечены в почечный фиброз [35-37]. Wnt/-catenin представляет собой эволюционно законсервированный сигнальный путь, участвующий в регуляции тканевого гомеостаза, развитии органов и репарации повреждений [38]. Цистернас и др. обсудили профибротический эффект передачи сигналов Wnt как в скелетных мышцах, так и в почках [39]. Все больше доказательств установило, что сигнальный путь Wnt/-catenin играет решающую роль в регуляции развития и прогрессирования почечных фиброзных поражений после травмы [40-42]. Сигнал Wnt/-catenin относительно слаб в почках здоровых взрослых людей и активируется, когда почки подвергаются различного рода повреждениям [43].

У млекопитающих семейство Wnt включает по крайней мере 19 членов, критически важных для развития почек. И по крайней мере 15 из этих членов семейства по-разному активируются в стареющих почках, включая Wnt4 [6]. Результаты настоящего исследования показали, что уровень экспрессии белка Wnt4 в почках мышей SAMP8 был значительно выше, чем у мышей SAMR1, что подтверждалось как вестерн-блоттингом, так и иммуногистохимическим анализом (рис. 4а, г и е). По совпадению уровень экспрессии белка -катенина также повышался. Кроме того, как Wnt4, так и -катенин экспрессировались в эпителиальных клетках почечных канальцев, что было выявлено с помощью иммуногистохимического анализа (Fig. 4a и f). Wnt/-катенин вызывает фиброз почек, индуцируя множественные фиброгенные гены, такие как компоненты RAS, матриксную металлопротеиназу -7 (MMP-7), ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) и Snail [37]. ]. Чжоу и др. описали Wnt/-catenin как основной восходящий регулятор, который контролирует экспрессию всех тестируемых компонентов RAS в почках [44]. Чжоу и др. использовали крысиную модель нефрэктомии 5/6 (5/6 NX), чтобы показать уровни экспрессии основных компонентов РАС в головном мозге и почках, таких как ангиотензиноген, ангиотензинпревращающий фермент и ангиотензин II AT{{25 }}рецептор был значительно активизирован. Повышенный уровень экспрессии ингибировался центральным блокатором Wnt, который представлял собой аденоассоциированный вирусный вектор, сверхэкспрессирующий ген DKK1 [45]. Точно так же настоящее исследование показало, что AGTR1 все еще экспрессируется в эпителии почечных канальцев, а уровни экспрессии ренина и AGTR1 в тканях почек мышей SAMP8 были значительно выше, чем у мышей SAMR1 (Fig. 4a и dg). Эти результаты показали, что сигнальный путь Wnt/-catenin/RAS был активирован в почках мышей SAMP8, и CF эффективно ингибировал активацию этого пути.

CTGF выполняет множество биологических функций, в том числе способствует митозу хемотаксических клеток, вызывает адгезию и способствует пролиферации клеток и синтезу ЕСМ [35,46]. CCN2(CTGF) модулирует передачу сигналов Wnt путем связывания с белком 5/6, родственным рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP5/6), для дальнейшего опосредования фиброза [39, 47]. В других исследованиях использовали замалчивание генов, чтобы обнаружить и подтвердить, что Nrf2 регулирует путь Wnt, регулируя уровень экспрессии CTGF, воздействуя на почечное интерстициальное заболевание. Кроме того, Nrf2 регулировал уровень транскрипции CTGF в основном через регулятор транскрипции CTGF c-Fos [48]. Иммуногистохимический анализ показал, что CTGF и pc-Fos экспрессируются преимущественно в эпителиальных клетках почечных канальцев, а pc-Fos также распределяется в клубочках. Количественный анализ показал, что уровни экспрессии обоих белков ингибировались CF (рис. 3b и e и 4a и c). Наконец, анализ PCA был использован для дальнейшего подтверждения того, что МВ улучшает повреждение почек у мышей SAMP8 (рис. 6). Настоящее исследование предоставило доказательства того, что CF не только активирует передачу сигналов Nrf2, но также зависит от Nrf2 для балансировки окислительного стресса и воспаления, ингибирует передачу сигналов Wnt/-catenin/RAS и улучшает старение почек и почечный фиброгенез. Однако в этом эксперименте мы также обнаружили непоследовательное улучшение эффекта CF на окрашивание по Массону и SA- -gal. Предполагается, что это может быть связано с непоследовательным прогрессированием почечного старения и почечного фиброза у мышей SAMP8. Степень почечного старения у мышей в этом эксперименте может быть более серьезной, чем фиброз. Следовательно, улучшающий эффект CF-H на почечное старение у мышей SAMP8 не был таким очевидным, как эффект почечного фиброза.

В качестве восстанавливающего моносахарида D-галактоза широко используется при различных возрастных заболеваниях in vivo и in vitro. Было обнаружено, что D-gal вызывает старение и повреждение клеток NRK-52E [49], вызывает старение эпителиальных клеток проксимальных канальцев почек человека (клетки HKC-8) и увеличивает уровни экспрессии двух почечных маркерные белки фиброза FN и a-SMA [6]. В этом исследовании D-gal использовали для индукции клеток NRK-52E in vitro. Используя анализ МТТ и окрашивание -галактозидазой для обнаружения соединений, выделенных из муковисцидоза, было обнаружено, что SDC-0-14,16 и SDC-1-8 повышают жизнеспособность клеток, индуцированную D-gal, и ингибируют D-gal-индуцированный клеточное старение (рис.5). Они предположили, что SDC-0-14,16 и SDC-1-8 могут быть материальной основой для МВ, замедляющего старение почек. SDC-1-8 является одним из фенилэтаноидных гликозидов. Было обнаружено, что фенилэтаноидные гликозиды продлевают жизнь Caenorhabditis Elegans [50], обладают антивозрастным [51] и нейропротекторным действием [52-54]. Они задают направление для нашего последующего исследования фармакологических эффектов CF.

Выводы

В заключение, исследования in vivo показали, что МВ уменьшает почечный фиброз у пожилых мышей. Некоторые потенциальные активные ингредиенты были обнаружены в экспериментах in vitro. Эти результаты предоставили фармакологическую поддержку для лечения заболеваний почек с помощью МВ и направление для дальнейших исследований активных ингредиентов МВ.

Эта статья взята из Cao et al. Дополнительная медицина и методы лечения BMC (2022) 22:52