Гидроперегонка надземных частей E. Bonariensis позволила получить золотисто-желтый ЭМ

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

2.3.Хемометрический анализ

The EOs chemical compositions of the major compounds (>3 процента), полученные от разных эковидов P. Dioscorides и E. bonariensis, были сконструированы в виде матрицы. Эти собранные данные были подвергнуты агломеративной иерархической кластеризации (AHC) и анализу основных компонентов (PCA). Кластерный анализ эфирных масел P.dioscoridis показал, что исследуемая в настоящее время выборка P.dioscoridis тесно связана с египетскими эковидами, собранными в городе Эль-Садат, и мало коррелирует с образцами, собранными на пустынной дороге Каир-Суэц в Египте (рис. 3а). .доза цистанхеОднако настоящий образец отличался от образцов, приобретенных у коммерческого источника в Каире, Египет. Это означает, что коммерческие образцы не в чистом виде или могут быть смешаны с другими растениями.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

PCA эковидов P.dioscoridis показал, что проба, собранная на пустынной дороге Каир-Суэц в Египте, в основном характеризуется фарнезолом, гермакрендолом и лонгифоленом (рис. 3b). Однако образец, приобретенный из коммерческого источника в Каире, Египет, характеризуется содержанием гексадекановой кислоты и -казина.

С другой стороны, кластерный анализ ЭО E. bonariensis показал, что настоящая египетская выборка тесно связана с венесуэльским эковидом, но отличается от других эковидов (рис. 4а). В то время как индийский и тунисский эковиды показали близкое родство по составу ЭМ.Преимущества экстракта цистанхеPCA показал, что настоящий образец E. bonariensis характеризуется транс-альфа-фарнезеном, O-оцименом и транс- -фарнезеном (рис. 4b). Образец, собранный в Александрии, Египет, показал тесную корреляцию с а-бергамотеном, лимоном и у-куркумином, в то время как индийский эковид характеризуется -эвдесмолом, кариофилленоксидом, алло-аромадендреном и карвакролом.

Наблюдаемые различия между настоящими образцами и другими зарегистрированными образцами выявили полезную информацию, полученную из анализа ЭО, которая может быть полезным инструментом в хемотаксономии [27].

2.4. Антивозрастная активность

ЭО P. dioscoridis, E. bonariensis и смесь двух эфирных масел (1:1) обладают сильной ингибирующей активностью в отношении коллагеназы, эластазы, гиалуронидазы и тирозиназы (рис. 5). Все обработки ЭО показали сильное ингибирование фермента коллагеназы с IC50 1,85, 2,90 и 1,73 мкг/мл для P.dioscoridis, E.bonariensis и смеси соответственно. Кроме того, три обработки ЭО сильно ингибируют фермент эластазу с соответствующими значениями IC50 14,63, 16,52 и 1101 мкг/мл. Кроме того, было продемонстрировано сильное подавление гиалуронидазы с помощью трех обработок ЭО на основе соответствующих наблюдаемых значений IC50 17,18, 15,16 и 13,54 мкг/мл. В то же время три протестированных препарата продемонстрировали сильное ингибирование фермента тирозиназы со значениями IC50 19,52, 18,93 и 15,81 мкг/мл соответственно. Все результаты были построены на основе сравнения с полифенольным соединением, галлатом эпигаллокатехина (EGCG), в качестве стандартного антивозрастного эталона [44], который проявляет ингибирование коллагеназы, эластазы, гиалуронидазы и тирозиназы с IC50 1,56, 10,29, 12,71, и 14,37 мкг/мл.

цистанхе может омолаживать

Во внеклеточном матриксе деградация эластина и гиалуронана в основном коррелирует с двумя соответствующими протеолитическими ферментами, эластазой и гиалуронидазой, которые вызывают основные причины старения кожи, такие как морщины, дряблость. Более того, тирозиназа вызывала регуляцию синтеза меланина в меланоцитах человека, что приводило к кожным заболеваниям.В настоящем исследовании было оценено омолаживающее действие смеси двух эфирных масел в соотношении 1:1 для изучения синергетического эффекта комбинации двух эфирных масел. Результаты показали, что эфирное масло P.dioscoridis, E.bonariensis и смесь двух эфирных масел (1:1) обладают сильным омолаживающим действием. Эти результаты могут быть связаны с химическими компонентами этих масел. Антивозрастная активность прямо коррелировала с антиоксидантным потенциалом [45]. ГлавныйБыло описано, что компоненты обоих эфирных масел, сесквитерпены, играют важную роль в качестве антиоксидантов, противовоспалительных средств и, таким образом, замедляют старение [45]. Ту и Тавата [45] сообщили, что эфирное масло листьев Alpinia zerumbet проявляет антиоксидантную и омолаживающую активность из-за высокой концентрации терпеноидов, особенно сесквитерпенов. Кроме того, монотерпены были задокументированы как активные антивозрастные агенты в эфирном масле можжевельника обыкновенного [46] и душицы обыкновенной [47].Цистанче ЧингисханВ этих отчетах сделан вывод о том, что увеличение содержания свободных радикалов в эфирных маслах приводит к увеличению их омолаживающей активности. Основываясь на этом факте, высокие концентрации терпенов, особенно оксигенированных сескви- и монотерпенов, вызывали усиление омолаживающей активности эфирных масел этих двух растений. Все эти представленные данные позволяют сделать вывод о роли синергетических эффектов между компонентами эфирных масел. Этот факт роли синергетического эффекта был очевиден из наших результатов, в которых смесь двух эфирных масел (1:1) показала лучшую активность, чем индивидуальное эфирное масло каждого растения. В смеси двух эфирных масел повышение концентрации оксигенированные терпены, а также синергетические эффекты между компонентами обусловили повышение потенциала ингибирования.

2.5. Цитотоксическая активность эфирных масел P. dioscoridis и E. bonariensis

Цитотоксичность ЭМ надземных частей двух растений P. Dioscorides и E. bonariensis, а также смесь двух эфирных масел: (1:1) против трех линий раковых клеток, клеток аденокарциномы молочной железы (MCF-7), клеток рака легких (A-549 ) и клетки гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) показаны на рисунке 6. Результаты показали, что ЭО P. dioscoridis оказывает значительное ингибирование двух раковых клеток, MCF-7 и A-549, с IC50 37,3 и 22,3 мкМ соответственно (рис. 6А, В) без какой-либо активности против HepG2. В то время как ЭО E.bonariensis показал ингибирующий потенциал только в отношении HepG2 с ICso 25,6 мкМ (рис. 6C) с отрицательными результатами в отношении MCF-7 и A-549. Смесь двух эфирных масел в соотношении 1:1 не проявляла никакой активности против трех раковых клеток.

Значительная активность двух эфирных масел может быть связана с химическим составом, в котором синергетический эффект соединений способствует этой активности [48]. Сесквитерпены в обеих формах, оксигенированных и углеводородных, представляли собой очень эффективные соединения в качестве противоопухолевых лидеров [49, 50]. В нескольких отчетах сделан вывод о том, что увеличение содержания сесквитерпенов в эфирных маслах вызывает усиление противораковой активности [51, 52]. Например, сообщалось, что кариофиллен с высокой концентрацией в эфирных маслах является известным потенциальным цитотоксическим агентом, особенно против роста клеток аденокарциномы молочной железы (MCF-7) [53,54].Настоящие данные показали, что эти два эфирных масла являются селективными в отношении протестированных раковых клеток. Эта селективность полностью согласовывалась с несколькими задокументированными результатами ЭО, полученными из других растений. Например, было обнаружено, что эфирное масло, полученное из Sideritis perfoliata, Satureia thymbra, Salvia officinalis, Laurus nobilis и Pistacia Palestina, обладает селективным ингибирующим действием в отношении амеланотической меланомы (C32), почечной целладенокарциномы (ACHN), гормонозависимой карциномы простаты (LNCaP), и рак молочной железы (MCF-7)[55]. Кроме того, было обнаружено, что эфирные масла, экстрагированные из трех растений, Satureja montana, Coriandrum sativum и Ocimum basilicum, обладают селективной цитотоксической активностью в отношении HeLa, MDA-MB-453, K562 и MRC-5. 56]. Исчезновение смесей двух эфирных масел (1:1) можно объяснить отрицательным синергетическим эффектом каждого эфирного масла на другой, и об этом явлении сообщалось в некоторых отчетах. Haroun и Al-Kayali [57] обнаружили, что различные экстракты Thymbra spicata показали положительный синергетический эффект в сочетании с некоторыми эталонными антибиотиками против некоторых штаммов бактерий и в то же время отрицательный синергетический эффект против других штаммов.

3.Материалы и методы

3.1. Сбор и подготовка растительного сырья

Надземные части P.dioscoridis и E.bonariensis были собраны в двух популяциях вдоль пустынной дороги Каир-Александрия в Египте в ноябре 2019 г. Из каждой популяции были вырезаны образцы здоровых и свежих растений у трех особей и объединены в составные пробы (по две с каждого растения; P.dioscoridis и E.bonariensis). Два растения были аутентифицированы согласно Tackholm [58] и Boulos [25]. Ваучерные образцы (CZ-Dx908-019&CZ-Lx909-019) были депонированы в гербарии Национального исследовательского центра Египта.продление жизни цистанхеНадземные части подсушивали в тени, измельчали ​​в мелкий порошок и упаковывали в бумажные пакеты до дальнейшего анализа [13]. 3.2.Извлечение ЭО

Высушенный на воздухе порошок надземных частей P.dioscoridis и E. bonariensis (по 2{12}}0 г каждого) помещали отдельно в аппараты типа Клевенджера с использованием круглой колбы (2,5 л), содержащей вода (1,5 л) для гидродистилляции в течение 3 ч. Маслянистый слой каждого растения выделяли отдельно н-гексаном, затем сушили над безводным NagSO4 (0,5 г) и, наконец, хранили в стеклянных флаконах в морозильной камере до дальнейшего анализа с помощью ГХ-МС. Эту экстракцию ЭО каждого растения повторяли в двух экземплярах.

3.3. Анализ газовой хроматографии-масс-спектроскопии (ГХ-МИС) и исследования химических компонентов

Четыре образца эфирных масел (по два образца для каждого растения) были проанализированы с помощью газовой хроматографии-масс-спектроскопии (ГХ-МС) в Национальном исследовательском центре Египта [8]. Корректировка спецификаций прибора ГХ/МС произошла при следующих условиях: TRACE Газовые хроматографы GC Ultra (THERMO ScientificTM Corporate Waltham, Массачусетс, США), соединенные с одноквадрупольным масс-спектрометром Thermo Scientific ISQTM EC. Система ГХ-МС была оснащена колонкой TR{4}} MS с размерами 30 м × 0,32 мм в диаметре, толщиной пленки 0,25 мкм. Гелий в качестве газа-носителя при расходе 1,0 мл/мин с коэффициентом деления 1:10 с использованием следующей температурной программы: 60 градусов в течение 1 мин; для анализа использовали подъем со скоростью 4,0 градуса в минуту до 240 градусов и выдержку в течение 1 минуты. И инжектор, и детектор удерживались при температуре 210 градусов. Всегда вводили аликвоту 1 мкл разведенных образцов в гексане (1:10, масса/объем). Масс-спектры записывали методом электронной ионизации (EI) при 70 эВ, используя спектральный диапазон m/z 40-450. Химическая составляющая исследуемых эфирных масел была охарактеризована с помощью программного обеспечения для автоматизированной масс-спектральной деконволюции и идентификации (AMDIS) (www.amdis.net, по состоянию на 2 января 2020 г.), индексов удерживания (относительно н-алканов Ca-C22), сравнение масс-спектра с аутентичными (при наличии) и коллекцией спектральной библиотеки Wiley и базой данных библиотеки NSIT (Gaithersburg, MD, USA; Wiley, Hoboken, N, USA).

3.4. Антивозрастная активность эфирных масел

3.4.1. Антиколлагеназный анализ

Антиколлагеназный анализ двух исследованных эфирных масел растений, а также смеси 1:1 проводили в соответствии с Thring, et al. [59] с небольшими изменениями для использования в устройстве для чтения микропланшетов. Анализ проводили в 50 мМ трициновом буфере (рН 7,5) с 400 мМ NaCl и 10 мМ CaClz. Коллагеназу из Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23) растворяли в буфере для использования в исходной концентрации 0,8 ед/мл по данным об активности поставщика. Синтетический субстрат N-[3-(2-фурил)акрил-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) растворяли в трициновом буфере до 2 мМ. Два исследуемых ЭМ и смесь ЭМ двух растений (1:1, вес/вес) по отдельности инкубировали с ферментом в буфере в течение 15 мин перед добавлением субстрата для запуска реакции. Поглощение при 490 нм измеряли с использованием устройства для считывания микропланшетов (TECAN, Group Ltd., Маннедорф, Швейцария). Галлат эпигаллокатехина (EGCG) использовали в качестве положительного контроля.

3.4.2.Анализ антиэластазы

Для анализа ингибирования эластазы два исследуемых эфирных масла растений, а также смесь 1:1, этот анализ проводили в соответствии с Kim, et al. [60] с небольшими изменениями. Вкратце: эластазу поджелудочной железы свиньи растворяли с получением маточного раствора 3,33 мг/мл в стерильной воде. Субстрат, N-сукцинил-Ала-Ала-Ала-п-нитроанилид (AAPVN), растворяли в буфере с концентрацией 1,6 мМ. Тестовые ЭМ инкубировали с ферментом в течение 15 мин перед добавлением субстрата для начала реакции. Конечная реакционная смесь (общий объем 250 мкл) содержала буфер, 0,8 мМ AAAPVN, 1 мкг/мл PE и 25 мкг тестируемого образца.цистанче россияИсследуемые ЭМ и смесь ЭМ двух растений (1:1, мас./мас.) инкубировали по отдельности. EGCG использовали в качестве положительного контроля. Значения поглощения при 400 нм измеряли в 96-луночных титрационных микропланшетах с использованием устройства для считывания микропланшетов (TECAN, Inc.). Рассчитывают процент ингибирования для этого анализа.

3.4.3. Антитирозиназный анализ

Анализы ингибирования тирозиназы двух эфирных масел растений, а также смеси 1:1 проводились путем измерения образования хрома L-DOPA в соответствии с протоколом, описанным Batubara, et al. [61]. Вкратце, два ЭО и их смесь (1:1, вес/вес) по отдельности растворяли в растворителе с тремя определенными концентрациями (10, 100 и 250 мкг/мл). Анализы проводились путем введения следующих компонентов: (а) фосфатный буфер (120 мкл, 20 мМ, рН 6,8), (б) 20 мкл образца и (в) 20 мкл грибной тирозиназы (500 ЕД/мл в 20 мМ фосфатном буфере) в 96-луночные планшеты. После 15 мин инкубации при 25°С инициирование реакции происходило путем внесения 20 мкл раствора L-тирозина (0,85 мМ) в каждую лунку с последующей инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре. Активность фермента контролировали при 475 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (TECAN, Inc.). EGCG использовали в качестве положительного контроля. Расчет процента ингибирования тирозиназы выполняли по следующему уравнению: где A — поглощение контроля с ферментом, B — поглощение контроля без фермента, C — поглощение тестируемого образца с ферментом, а D — поглощение. поглощение тестируемого образца без фермента.

3.4.4. Антигиалуронидазный анализ

Метод флуориметрического анализа Моргана-Элсона выполняли в соответствии с Reissig, et al. 【62】, модифицированный Такахаши и др.【63】. В кратком описании 5 мкл тестируемых эфирных масел и смесь эфирных масел двух растений (1:1, вес/вес) по отдельности инкубировали в течение 1 0 мин при 37°С с бычьей гиалуронидазой (1,5 0 U） в 100 мкл 20 мМ буферного раствора фосфата натрия (рН 7,0), хлорида натрия (7 мМ), в дополнение к 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА) ). Реакцию анализа инициировали добавлением натриевой соли гиалуроновой кислоты (100 мкл) из петушиного гребня (0,03 процента в 300 мМ фосфата натрия, pH 5,35) к инкубационной смеси, затем смесь инкубировали при 37 градусах в течение 45 минут. . Осаждение непереваренной гиалуроновой кислоты проводили 1 мл кислого раствора альбумина, включающего 0,1% БСА в ацетате натрия (24 мМ) и уксусной кислоте (79 мМ, рН 3,75). Смесь останавливали, оставляя на 10 мин при комнатной температуре. температуру и флуоресценцию определяли с помощью устройства для считывания микропланшетов Tecan Infinite при возбуждении на длине волны 545 нм и эмиссии на длине волны 612 нм. В качестве положительного контроля использовали ЭГКГ. Процент ингибирования коллагеназы, эластазы и гиалуронидазы рассчитывали по следующему уравнению: где S: скорректированное поглощение образцов, содержащих ингибитор эластазы (активность фермента в присутствии образцов); и C: скорректированное поглощение. контролей (активность фермента в отсутствие образцов).

IC50, концентрацию, необходимую для ингибирования 50 процентов фермента в условиях анализа, оценивали по графическим графикам кривой доза-реакция для каждой концентрации с использованием программного обеспечения Graphpad Prism (Сан-Диего, Калифорния, США). 3.5.

Цитотоксичность двух эфирных масел

Цитотоксическую активность эфирных масел P.dioscoridis и E.bonariensis и их смеси (1:1, масс./масс.) по отдельности определяли в отношении трех раковых клеток человека, клеток аденокарциномы молочной железы (MCF-7 ), клетки рака легкого (A-549) и клетки гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) с использованием протокола сульфородамина B (SRB).

3.5.1. Культура клеток

Три линии раковых клеток, клетки аденокарциномы молочной железы (MCF-7), клетки рака легких (A-549) и клетки гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) были получены от VACCERA, Mokatam, Giza, Egypt. Клетки поддерживали в среде DMEM с добавлением 100 мг/мл стрептомицина, 100 единиц/мл пенициллина и 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки во влажной атмосфере с 5% (об./об.) CO2 при 37°С. 3.5.2. Анализ цитотоксичности

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа SRB. Аликвоты по 100 мкл клеточной суспензии (5 × 103 клеток) помещали в 96-луночные планшеты и инкубировали в полной среде в течение 24 часов. Клетки обрабатывали другой аликвотой по 100 мкл среды, содержащей ЭМ и их смесь (1:1 вес/вес), по отдельности, в различных концентрациях в диапазоне от (0,01, 1, 10 и 100 мкг/мл). Через 72 часа после воздействия лекарственного средства клетки фиксировали путем замены среды 150 мкл 10-процентного ТХУ и инкубировали при 4 градусах в течение 1 часа. Раствор ТХУ удаляли, клетки 5 раз промывали дистиллированной водой. Добавляли аликвоты по 70 мкл раствора SRB (0,4 мас.%) и инкубировали в темном месте при комнатной температуре в течение 10 мин. Планшеты промывали 3 раза 1% уксусной кислотой и оставляли сушиться на воздухе в течение ночи. Затем добавляли 150 мкл TRIS (10 мМ) для растворения связанного с белком пятна SRB; поглощение измеряли при 540 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов BMG LABTECH@-FLUOstar Omega (Ortenberg, Германия) [64, 65].

3.6.Обработка данных

Данные антивозрастной активности различных ферментов были представлены в трех повторностях и подвергнуты однофакторному ANOVA с последующим тестом Дункана с использованием CoStat версии 6.311 (CoHort, Монтерей, Калифорния, США, http://www.cohort. ком).

A matrix of the concentration of a total of 30 major chemical compounds (>3%)identified in the EO of five P. dioscoridis ecospecies was constructed, these samples were (1)present sample; (2) purchased from a market in Cairo, Egypt; (3)collected from El-Sadat City, Egypt; (4) collected from Cairo-Suez desert road, Egypt dring April; and (5) collected from Turkey. While for E.bonariensis, a matrix of 27 major chemical compounds (>3 процента) представляли собой шесть образцов, эти образцы были (1) настоящим образцом; (2) собраны в Александрии, Египет; (3) собраны в Монастире, Тунис; (4) собраны в Венесуэле; (5) собраны во Вьетнаме; и (6) собраны в Индии. Матрицы были подвергнуты анализу основных компонентов (PCA) и агломеративной иерархической кластеризации (AHC) с помощью статистического компьютерного пакета программного обеспечения XLSTAT (версия 2018, Addinsoft Inc., Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США).

4. Выводы

Herein, the GC-MS analysis of EOs of the above-ground parts of P. dioscoridis and E. bonariensis, revealed the identification of 29 and 35 compounds, respectively. Sesquiterpenes were characterized as the main components of EOs derived from the two plants. The major components of EO of P. dioscoridis were a-maliene, berkheyaradulen, dehydro-cyclolongifolene oxide, aromadendrene oxide-2,and β-muurolene. While, trans-x-farnesene, O-ocimene,and o-maaliene represented the abundant constituents of E. bonariensis EO.The observed variation in the EOs composition among the studied ecospecies and that reported support the changing of the taxa names. EOof P. dioscoridis exhibited cytotoxicity against the two cancer cells, MCF-7 and A-549, while the EO of the E. bonariensis showed activity only against HepG2. The EOs of P. dioscoridis and E. bonariensis as well as the mixture of them (1:1), exhibited significant anti-aging activity in which the mixture (1:1)>P. Dioscorides >Е. бонариенсис. Все эти данные позволяют сделать вывод, что изученные эфирные масла этих двух растений могут быть использованы в качестве ведущих средств против старения и рака.

Эта статья взята из Plants 2021, 10, 667. https://doi.org/10.3390/plants10040667 https://www.mdpi.com/journal/plants