Механизм Cistanche Deserticola, улучшающий функцию кишечника

Юань Гао, Чуаньцзе Цзун, Фэнь Лю, Лэй Фан, Рунлан Цай, Юэ Ши, Си Чен, Юнь Ци

Абстрактный

фенилэтаноидгликозиды(PhG), класс полифенольных соединений, считаются одним из основных биологически активных компонентовЦистанхепустыняYC Ma (CD), экстракт которого перорально используется в традиционной китайской медицине. Хотя в предыдущих фармакологических исследованиях сообщалось, что PhG проявляют множество активностей, их транспортные профили в кишечнике не были выяснены. В этом исследовании мы исследовали кишечную проницаемость богатого PhG экстракта (PRE) изЦистанхеДезертиколакак интегрированная система в модели монослоя клеток Caco-2 с использованием системы биоанализа. Результаты показали, что PRE в основном транспортируется за счет пассивной диффузии с плохой абсорбцией по градиенту концентрации без оттока, что обеспечивает фармакокинетические основы для клинического применения PhG вЦистанхе Дезертикола. Мы также определили кишечную проницаемость трех основныхPhG[актеозид (AC), изоактеозид (IS) и эхинакозид (EC)]по HLPC. Кроме того, мы разработали новый метод обнаружения флуоресценции ВЭЖХ для точного определения величины потока AC и IS. Как и ожидалось, транспортные характеристики трехPhGсогласуются с таковыми для PRE, что указывает на то, что настоящая система биоанализа подходит и надежна для оценки транспортных характеристик групп активного ингредиента (AIG) в PRE. Кроме того, эта система может также подходить для других растительных экстрактов, учитывая соответствующую биологическую активность.

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Введение

Клеточная линия Caco-2, полученная из аденокарциномы толстой кишки человека, обладает энтероцитоподобными характеристиками. В нормальных условиях клетки Caco-2 спонтанно дифференцируются из зрелых клеток и образуют интактные монослои [1]. Соседние клетки слипаются через плотные соединения, образованные на апикальной стороне монослоя, которые могут различать пассивно и активно транспортируемые лекарства через эпителиальный слой [2]. Благодаря морфологическому и биохимическому сходству с нормальными энтероцитами монослои клеток Caco-2 служат хорошо принятой in vitro моделью для изучения всасывающего потенциала кишечника и транспортных характеристик лекарственных средств [3, 4].

В отличие от химических веществ растительные экстракты (РЭ) представляют собой смеси, биологическая активность и активные компоненты которых часто недостаточно хорошо идентифицированы [5]. Кроме того, кишечные транспортные свойства ПЭ, в отличие от свойств его компонентов, тесно связаны с клиническим применением. Измерения потока тестового образца через монослой клеток Caco-2 обычно включают химические методы, такие как ВЭЖХ, ЖХ/МС и т. д. Хотя эти методы являются мощными инструментами, они сложны, требуют много времени, дороги и иногда требуют сложного оборудования. Что еще более важно, ни отдельный компонент, ни компонент меньшинства не могут отражать PE в целом. Таким образом, необходимо разработать новый подход, независимый от определения компонентов, для идентификации и оценки транспортных характеристик ПЭ.

ЦистанхепустыняYC Ma (CD), холопаразитическое растение, является распространенным средством традиционной китайской медицины, в основном используемым для лечения почечной недостаточности, слабости организма и запоров, и это использование официально зарегистрировано в Китайской фармакопее [6]. Фенилэтаноидные гликозиды (ФГ), в том числе эхинакозид (ЭК), актеозид (АЦ), изоактеозид (ИС) и др., представляют собой класс полифенольных соединений [7]. Они считаются одним из основных биоактивных компонентовЦистанхевиды [8]. Фармакологические исследования показали, что биоактивностьPhGразнообразен и включает антиоксидантный [9], антиусталостный [10], гепатопротекторный [11], иммуномодулирующий [12], противовоспалительный [7, 13] и нейропротекторный эффекты [14]. Однако особенности кишечного транспортаPhGне исследованы. В этом исследовании мы исследовали кишечную проницаемость богатого PhG экстракта (PRE) из CD как интегрированной системы и проницаемость трех основных PhG (AC, IS и EC) в дифференцированных клетках Caco-2. Наши результаты показали, что PRE в основном транспортируется посредством плохо поглощаемой пассивной диффузии по градиенту концентрации без оттока, что обеспечивает фармакокинетические основы для клинического применения PhG при БК.

Материалы и методы

Материалы

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS and EC (>98 процентов) были приобретены у Must Biotechnology Co. (Чэнду, Китай). Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), эмбриональная телячья сыворотка (FBS) и заменимые аминокислоты (NEAA) были произведены Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-луночные планшеты TranswellTM (площадь роста вставной мембраны 4,67 см2) были получены от Corning (Costar) Inc. (Тьюксбери, Массачусетс, США). Коллаген крысиного хвоста был получен от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Все реагенты и химикаты для ВЭЖХ-анализа были аналитической чистоты.

Приготовление ПРЕ из цистанхе пустынной.

Высушенный на воздухе материал CD измельчали ​​в порошок и экстрагировали путем перколяции с 70-процентным этанолом. Обогащенную PhG фракцию готовили, как описано ранее [10], и экстрагировали насыщенным водой н-бутиловым спиртом. Экстракт концентрировали и сушили при пониженном давлении. УФ-спектрофотометрия макропористой смолы [15] показала содержание PhG 78,4%. Окончательный образец представлял собой 1,75% выхода сырья по сухому весу. Полученный образец хранили при температуре -20 градусов до дальнейшего использования.

Определение AC, IS и EC с помощью ВЭЖХ

Для анализа содержания AC, IS и EC в PRE использовали систему ВЭЖХ Shimadzu, оснащенную программным обеспечением LC. Использовали колонку Intersil C18 с обращенной фазой (4,6 мм × 25 0 мм, 5 мкм), которую поддерживали при комнатной температуре. Подвижные фазы представляли собой ацетонитрил и воду, содержащую 0,1% фосфорной кислоты (об./об.) с градиентным элюированием (таблица 1) при скорости потока 1,0 мл/мин. Детектор УФ-спектрофотометра был установлен на 334 нм. Чтобы точно определить поток AC и IS, мы разработали новый метод обнаружения флуоресценции ВЭЖХ (HPLC-FLD). После структурного анализа и сканирования длины волны флуоресценции (данные не показаны) мы получили оптимальные условия обнаружения флуоресценции для AC (Ex: 338 нм, Em: 448 нм) и IS (Ex: 320 нм, Em: 434 нм).

Аналитический метод ВЭЖХ был подтвержден с использованием следующих рабочих характеристик: стабильность, линейность, чувствительность, прецизионность (внутрисуточная и междневная изменчивость) и точность. Аналиты в транспортном буфере хранили при 25°С в темноте в течение 24 ч и измеряли их стабильность. Аналиты были очень стабильны в присутствии витамина С ({4}},4 процента), поскольку значения относительного стандартного отклонения (RSD) в областях пиков были <3,5 процента.="" уравнение="" линейной="" регрессии,="" коэффициент="" корреляции,="" диапазон="" линейности,="" lod="" и="" loq="" для="" ac,="" is="" и="" ec="" показаны="" в="" таблице="" 2.="" lod="" (18–30="" нм)="" и="" loq="" (60–100="" нм)="" значения="" показывают,="" что="" методы="" hplc-fld="" и="" hplc-uv="" обладают="" высокой="" чувствительностью.="" все="" значения="" относительного="" стандартного="" отклонения,="" отражающие="" точность="" метода,="" составляли=""><2 процентов="" для="" внутридневной="" и="" междневной="" изменчивости,="" что="" указывает="" на="" хорошую="" точность.="" для="" оценки="" извлечения="" ac,="" is="" и="" ec="" добавляли="" к="" транспортному="" буферу,="" чтобы="" получить="" три="" уровня="" концентрации="" (высокий,="" средний="" и="" низкий).="" значения="" извлечения="" аналитов="" для="" данного="" метода="" приведены="" в="" таблице="" 3.="" средние="" значения="" извлечения="" варьировались="" от="" 90,0="" до="" 96,4="" процента,="" что="" указывает="" на="" хорошую="" точность.="" в="" заключение,="" установленные="" методы="" вэжх="" являются="" удовлетворительными="" в="" отношении="" линейности,="" чувствительности,="" прецизионности="" и="" достоверности="" количественного="" определения="" ac,="" is="" и="" ec="" в="" транспортном="">

Определение PRE с помощью системы биоанализа

Биоанализ (общая антиоксидантная способность) был основан на анализе FRAP (железовосстанавливающая/антиоксидантная способность), который мы описали ранее [16], и подтвержден с точки зрения линейности и точности (изменчивость в течение дня и между днями). Линейность метода биотестирования определяли на основании калибровочных кривых. Диапазон концентраций линейности составлял 0,0625 - 40 мкг/мл (y=0,0258x плюс 0,0968, R2=0,996). Прецизионность установленного метода биоанализа определяли с точки зрения внутридневной и междневной изменчивости для анализа PRE (10,0 мкг/мл). Внутридневную повторяемость метода определяли на основе пяти последовательных определений в один и тот же день. Междневную повторяемость измеряли на основе пяти последовательных определений в три разных дня. Значения RSD для точности метода составили 1,014 процента и 4,72 процента для внутридневной и междневной изменчивости, соответственно, что указывает на хорошую точность. Таким образом, установленный метод биоанализа является удовлетворительным в отношении линейности, точности и достоверности количественного определения PRE в транспортном буфере.

Культура клеток

Клетки Caco{{0}} культивировали при температуре 37 градусов и относительной влажности 95% в атмосфере, содержащей 5% CO2, и среде, состоящей из DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-глутамина, пенициллина ( 100 ЕД/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Среду меняли через день во время роста и дифференцировки клеток. Клетки выращивали в пластиковых колбах площадью 75-см2 и собирали каждые 3-5 дней с 0,05% ЭДТА-трипсином. Для транспортных экспериментов клетки высевали с плотностью 1×105 клеток/см2 на вставки Transwell, покрытые коллагеном. Приблизительно через 21 день после посева монослои использовали для экспериментов по транспортировке. Их целостность определяли путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) монослоев с помощью EVOM, оснащенного ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., США). Значения TEER монослоя клеток Caco-2 должны были превышать 500 О∙см2.

Транспортные эксперименты

Монослой промывали транспортным буфером (P-буфер, содержащий 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ глюкозы, 3 мМ CaCl2 и 145 мМ NaCl, pH 7,4), а затем предварительно инкубировали в течение 20 мин при 37 градусов. После удаления транспортного буфера свежий транспортный буфер, содержащий тестируемые образцы, добавляли в апикальную (AP) камеру (1,5 мл) в AP к базолатеральным (BL) направленным исследованиям или в BL камеру (2,5 мл) в BL к AP-направленным исследованиям. Для анализов AC, IS и EC с использованием ВЭЖХ аликвоту (300 мкл) отбирали из каждой приемной камеры через различные интервалы времени (30, 60, 90 и 120 мин). Приемную камеру пополняли одним и тем же объемом свежего подогретого (37°С) транспортного буфера после каждого отбора проб. Собранные образцы хранились при температуре -20 градусов для дальнейшего использования. Для определения PRE с помощью биоанализа брали пробы только через 120 мин. Из-за нестабильности PRE, AC, IS и EC для стабилизации образцов добавляли 0,4 процента (масса/объем) витамина С, чтобы определить содержание AC, IS и EC с помощью ВЭЖХ, а образцы для PRE Биотестирование проводили сразу после отбора проб. Рассчитывали значение коэффициента кажущейся проницаемости (Papp или 'Papp) каждого образца.

Анализ данных

Значения Papp в направлениях AP BL или BLAP AC, IS и EC рассчитывались на основе следующего уравнения: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), где Papp представляет собой коэффициент кажущейся проницаемости (см/с), определенный с помощью ВЭЖХ. (4Q/4t) — скорость появления тестируемого соединения (AC, IS или EC) на принимающей стороне (мкмоль/с); A – площадь поверхности вставки (см2); C0 — исходная концентрация исследуемого соединения на стороне донора (мкмоль/мл). В частности, единица массы «мкг» использовалась вместо «мкмоль» при расчете значений 'Papp. Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение.

Полученные результаты

Состав актеозида, изоактеозида и эхинакозида в PRE из Cistanche Deserticola

Поскольку AC, IS и EC считаются основными биоактивными PhG видов Cistanche [8], мы проанализировали их содержание в PRE с помощью ВЭЖХ-УФ. Репрезентативная хроматограмма показана на рис. 1. Идентификация этих компонентов была основана на сравнении времени удерживания и УФ-спектра с таковыми у подлинных стандартов при длине волны 334 нм. Содержание AC, IS и EC в PRE составляло 26,60%, 1,84% и 32,83% соответственно. Таким образом, на эти три соединения приходится 61,27% PRE; кроме того, приведенные выше результаты показывают, что содержание PhG в PRE составляет 78,4%. Таким образом, AC, IS и EC составляют примерно 80 процентов PhG в PRE.

Суммарная антиоксидантная способность PRE, AC, IS и EC

Сообщалось об исследованиях антиоксидантной активности PhG из CD [9], а AC, IS и EC составляют примерно 80 процентов PhG в PRE. Таким образом, общая антиоксидантная способность PRE, AC, IS и EC была проанализирована и выражена с использованием значений FRAP (× 10–6 ммоль). Как показано на рис. 2, при значении FRAP 8 × 10–6 ммоль конечные концентрации PRE, AC, IS и EC составляли 6,20 мкг/мл, 3,14 мкг/мл, 22,92 мкг/мл и 4,89 мкг/мл. мл соответственно, что указывает на то, что общая антиоксидантная способность этих четырех образцов ранжируется следующим образом: AC > EC > PRE > IS. Биоактивность PRE объясняется его группами активных ингредиентов (AIG). Приблизительно для 60 процентов PRE AC и EC показали более сильную общую антиоксидантную активность, чем PRE и IS. Поскольку IS (1,84%) составляет очень небольшую часть PRE, другие компоненты, такие как слабо антиоксидантный IS, также явно активны в PRE. Удивительно, но общая антиоксидантная активность различалась почти в 7-раза между АЦ и его изомером ИС, что свидетельствует не только о количестве фенольных гидроксильных групп [9], но и о положении фенольных гидроксильных групп в молекуле, влияющих на антигены. -окислительный эффект.

Проверка монослоев Caco-2

Чтобы подтвердить систему монослоя клеток Caco-2, значения Papp для пропранолола (хорошо транспортируемый маркер) и желтого Люцифера (плохо транспортируемый маркер) от AP к BL через монослои Caco-2 были определены как 1,51 × 10–5 см/с и 2,8 × 10–7 см/с соответственно, и эти значения согласуются с данными, опубликованными в предыдущих отчетах [17, 18]. Анализ активности щелочной фосфатазы также подтвердил, что монослои клеток Caco-2 качественно сравнимы с эпителием тонкой кишки [19].

Проницаемость актеозида, изоактеозида и эхинакозида

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1,0 × 10–5 см/с), тогда как у плохо всасывающихся препаратов они были низкими (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

Проницаемость PRE

Приведенные выше результаты показывают, что общая антиоксидантная способность PRE обусловлена, по крайней мере, 61,27% AIG из PRE. Таким образом, мы оценили TR PRE на основе его кривой зависимости концентрации от общей антиоксидантной способности и рассчитали значения Papp, чтобы отразить транспортные характеристики PRE. Значения Papp PRE для AP!BL и BL!AP составили (2,16 ± 0,26) × 10–7 см/с и (3,13 ± 0,29) × 10–7 см/с. с, соответственно, что свидетельствует о плохой проницаемости этого соединения. Кроме того, отток или активный транспорт не были очевидны, поскольку отношение «Papp BL к AP / «Papp AP к BL для PRE» составляло 1,45 [20]. Кроме того, двунаправленный TR PRE линейно увеличивался примерно между 300 и 900 мкг/мл (рис. 5). Отсутствие направленности результатов предполагает, что пассивная диффузия является основным транспортным механизмом PRE.

Обсуждение

По сравнению с высокоочищенными лекарственными препаратами ПЭ, как правило, представляет собой смесь, состоящую из сотен компонентов с самыми разными физико-химическими свойствами. Таким образом, ПЭ оказывает системное, многоцелевое и многоканальное синергетическое действие за счет своего сложного АИГ [21], что затрудняет анализ транспортных характеристик ПЭ. Для более научной оценки транспортных свойств ПЭ некоторые исследователи идентифицировали в ПЭ несколько компонентов, а не один компонент [22–24]. Тем не менее, ограниченное число составляющих не может отражать PE в целом. Однако определение всех компонентов в ПЭ невозможно. Более того, если различные компоненты ПЭ демонстрируют совершенно разные транспортные характеристики, комплексные транспортные характеристики ПЭ трудно определить.

В 1990-х годах для оценки TR антимикробных агентов использовались системы биоанализа [25]. К 2005 году Эгучи и его коллеги [26] оценили антиоксидантную активность экстракта моркови, используя среду BL из дифференцированных клеток Caco-2; этот подход больше подходит для отражения ситуаций in vivo.

Основываясь на предыдущем отчете об активности ФГ [9] и наших результатах (рис. 2), ТР АИГ в ППР можно оценить, определив общую антиоксидантную способность среды в приемной камере. После транспортных экспериментов мы обнаружили, что TR PRE одинаково в обоих направлениях, и этот транспорт был ненасыщенным и плохо поглощаемым ('Papp < ​​1.0="" ×="" 10–6="" см/с)="" [3]="" и="" это="" не="" указывало="" на="" отток,="" предполагая,="" что="" пассивная="" диффузия="" по="" градиенту="" концентрации="" является="" основным="" транспортным="" механизмом="" pre="" (рис.="" 5).="" кроме="" того,="" транспортные="" характеристики="" pre="" согласуются="" с="" характеристиками="" ac,="" is="" и="" ec,="" эффективных="" компонентов,="" проявляющих="" антиоксидантную="" активность="" в="" pre="" (рис.="" 4="" и="" таблица="" 4).="" этот="" результат="" был="" ожидаемым="" и="" указывал="" на="" то,="" что="" настоящая="" система="" биоанализа="" подходит="" и="" надежна="" для="" оценки="" транспортных="" характеристик="" aig="" в="" pre="" в="" дифференцированных="" клетках="">

В отличие от канонического значения Papp, которое обычно используется для отражения переноса отдельного соединения, значение Papp, полученное из TR на основе кривой концентрация-эффект, может отражать не только компоненты, проникающие через монослои с неповрежденной структурой, но и также включают другие факторы, связанные с активностью мишени, такие как метаболиты компонентов, продукты химической деградации и даже некоторые цитокины, секретируемые клетками Caco-2 в ответ на стимуляцию, которые могут влиять на биологическую активность мишени. Таким образом, упомянутый выше многофакторный фактор, а не только транспортируемые неповрежденные компоненты, определяет значение Papp. Следовательно, Papp может коррелировать более сильно в ситуациях Vivo, чем каноническое значение Papp [26]. В этом исследовании мы выяснили пассивно-диффузный и плохо всасываемый характер PRE на основе его значения Papp, и этот характер может быть связан с высокими дозами и длительным периодом клинического лечения целиакии [27]. Тем не менее, эти результаты обеспечат более систематическое руководство для клиницистов по применению CD, когда будут идентифицированы только транспортные характеристики большинства AIG при CD, а не только PhG.

Однако выбранный элемент биологической активности должен быть достаточно чувствительным, чтобы его можно было обнаружить в среде приемной камеры, что представляет собой проблему для создания системы биоанализа для оценки транспортных характеристик ПЭ. Кроме того, биоактивность также должна зависеть от как можно большего числа компонентов. В нашем исследовании анализ общей антиоксидантной способности был более подходящим, чем некоторые другие методы (рис. S1). Но даже в этом случае наш анализ может определить TR PRE только через 120 мин.

В совокупности в настоящем исследовании была создана новая система биоанализа для оценки кишечной проницаемости PRE в дифференцированных клетках Caco-2. Полученные результаты показали, что пассивная диффузия с низким уровнем поглощения по градиенту концентрации без оттока является основным транспортным механизмом PRE (рис. 5), который обеспечивает фармакокинетические основы для клинического применения ФГ при БК. Очевидно, что использование новой системы биоанализа для оценки TR и, таким образом, для расчета значений Papp для оценки кишечного транспортного свойства AIG в PE вполне осуществимо. Этот подход может также подходить для других ПЭ, учитывая соответствующую биологическую активность.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Влияние PRE на (A) супероксидный анион, (B) гидроксильный радикал, (C) продукт перекисного окисления липидов и (D) радикал DPPH. Процедуры анализа были выполнены в соответствии с предыдущими отчетами [1, 2] без использования транспортного буфера. Значения IC50 (50-процентная ингибирующая концентрация) и SC50 (50-процентная поглощающая концентрация) рассчитывали на основе стандартных кривых концентрация-реакция. (DOCX)

Вклад автора

Задумал и спроектировал эксперименты: YG XC YQ. Проведены эксперименты: YG CZ FL LF RC YS. Проанализированы данные: CZ YG YQ. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты анализа: RC. Написал статью: YG YQ

Департамент научно-исследовательского центра фармакологии и токсикологии, Институт развития лекарственных растений, Китайская академия медицинских наук и Пекинский союзный медицинский колледж, Пекин, КНР,

Хэйлунцзянский университет китайской медицины, Харбин, Хэйлунцзян, КНР