Фактор, индуцируемый пероральной гипоксией Ингибитор пролилгидроксилазы Энародустат противодействует изменениям энергетического метаболизма в почках на ранних стадиях диабетической болезни почек

Контактное лицо: emily.li@wecistanche.com

Введение

Отделение нефрологии и эндокринологии Высшей школы медицины Токийского университета, Токио, Япония; Исследовательская стипендия для молодых ученых, Японское общество содействия развитию науки, Токио, Япония; биологические и фармакологические исследовательские лаборатории,

Центральный фармацевтический научно-исследовательский институт, Japan Tobacco Inc., Такацуки, Япония; Кафедра системной фармакологии, Высшая школа медицины Токийского университета, Токио, Япония; Лаборатория синтетической биологии, Центр исследования динамики биосистем RIKEN, Суйта, Япония; и Международный исследовательский центр нейроинтеллекта WPI, Институт перспективных исследований Токийского университета (UTIAS), Токийский университет, Токио, Япония.

Ингибиторы пролилгидроксилазы фактора, индуцируемого гипоксией (HIF), также известные как стабилизаторы HIF, увеличивают выработку эндогенного эритропоэтина и служат в качестве новых терапевтических средств против анемии ухроническийпочкаболезнь. HIF индуцирует экспрессию различных генов, связанных с энергетическим обменом, как адаптивный ответ на гипоксию. Однако остается неясным, как метаболическое перепрограммирование внутренней ткани путем стабилизации HIF влияет на патофизиологиюпочка болезни. Предыдущие исследования предполагают, что системные метаболические нарушения, такие как гипергликемия и дислипидемия, вызывают изменения почечного метаболизма, приводя к почечной дисфункции, включая диабетическую нефропатию. Здесь мы анализируем влияние энародустата (JTZ -951), перорального стабилизатора HIF, на почечный энергетический метаболизм на ранних стадиях диабетической болезни почек с использованием крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, и мышей с диабетом, индуцированным аллоксаном. Анализ транскриптома показал, что энародустат противодействует изменениям диабетического почечного метаболизма. Анализ транскриптома показал, что метаболизм жирных кислот и аминокислот повышался в диабетической почечной ткани и подавлялся энародустатом, тогда как метаболизм глюкозы повышался. Эти симметричные изменения были подтверждены анализом метаболома. В то время как метаболиты гликолиза и цикла трикарбоновых кислот накапливались, а аминокислоты восстанавливались в почечной ткани животных с диабетом, энародустат смягчал эти метаболические нарушения. Кроме того, энародустат увеличивает соотношение глутатиона к дисульфиду глутатиона и снимает окислительный стресс в почечной ткани животных с диабетом. Таким образом, стабилизация HIF противодействует изменениям энергетического обмена в почках, происходящим в начальной стадии.диабетикпочкаболезнь.

Цистанхе очень хорошо влияет на функцию почек.

Заявление о переводе

Ингибиторы пролилгидроксилазы фактора, индуцируемого гипоксией (HIF) (также известные как стабилизаторы HIF), увеличивают выработку эндогенного эритропоэтина и служат новыми терапевтическими средствами против анемии ухроническийпочкаболезнь. Наши анализы транскриптома и метаболома почечной ткани в моделях диабета у крыс и мышей показали, что энародустат (JTZ -951), пероральный стабилизатор HIF, противодействует изменениям почечного энергетического метаболизма на ранних стадиях диабетической нефропатии. Результаты дают важные данные для экстраполяции эффектов стабилизаторов HIF на почечный энергетический метаболизм в клинических условиях, хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, как это перепрограммирование почечного метаболизма стабилизаторами HIF влияет на прогрессированиедиабетикпочкаболезнь.

Вступление

Ингибиторы пролилгидроксилазы фактора, индуцируемого гипоксией (HIF), увеличивают выработку эндогенного эритропоэтина и служат новыми терапевтическими средствами против анемии при хронической анемии.почкаболезнь. Клетки наделены защитным механизмом против гипоксии, и HIF является основным регулятором этой защиты. Почки физиологически подвержены гипоксии, и хроническая гипоксия признается конечным общим путем, ведущим к терминальной стадии заболевания почек. Учитывая, что HIF индуцирует экспрессию различных генов, связанных с реакцией на гипоксию, стабилизаторы HIF могут оказывать плейотропное действие на прогрессирование гипоксии.почкаболезниа также улучшение состояния при анемии при хроническомпочкаболезнь. Интересно, что HIF индуцирует экспрессию гликолитических генов и киназы пируватдегидрогеназы, которая ингибирует использование пируватдегидрогеназой пирувата для подпитки митохондриального цикла трикарбоновых кислот (TCA).6,7 Это метаболическое перепрограммирование с цикла TCA на гликолиз подавляет потребление кислорода и имеет решающее значение. для адаптации клеток, подвергающихся воздействию гипоксической среды. Тем не менее, остается неясным, как метаболическое перепрограммирование почечной ткани путем стабилизации HIF влияет на патофизиологию почечной недостаточности.почка болезни. Диабетическая болезнь почек (ДБП) является основной причиной терминальной стадии болезни почек. Системные метаболические нарушения, такие как гипергликемия и дислипидемия, вызывают изменения почечного метаболизма, приводя к почечной дисфункции, включая ДБП. Предыдущие исследования показали повышенный метаболический поток и накопление метаболитов глюкозы и циклических метаболитов ТСА в диабетической ткани коры почек, что может быть связано с митохондриальной дисфункцией и прогрессированием ДБП. Мы предположили, что стабилизаторы HIF могут обратить вспять изменения метаболизма в диабетической ткани коры почек, учитывая, что HIF в качестве адаптивного ответа на гипоксию снижает метаболический поток в клетках, подавляя потребление кислорода. Таким образом, используя анализ транскриптома и метаболома, мы провели экспериментальное исследование, чтобы всесторонне понять, как энародустат (JTZ -951), пероральный стабилизатор HIF, влияет на изменения почечного метаболизма, возникающие на ранних стадиях ДБП.

РЕЗУЛЬТАТЫ: Энародустат индуцирует метаболическое перепрограммирование с цикла ТСА на гликолиз в клетках проксимальных канальцев почек.

Поскольку корковое вещество почек в основном состоит из проксимальных канальцев, мы сначала исследовали влияние энародустата на метаболический поток клеток проксимальных канальцев почек in vitro. Во-первых, митостресс-тест (Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Калифорния) и анализ скорости гликолиза (Agilent) были проведены в культивируемых клетках HK-2, линии клеток эпителия проксимальных канальцев человека (рис. 1а). Энародустат значительно снижал митохондриальное дыхание (цикл ТСА) и увеличивал базальный гликолиз, что указывает на метаболическое перепрограммирование с цикла ТСА на гликолиз (рис. 1; дополнительная рис. S1). Мы также провели эксперимент с использованием малой интерферирующей РНК (миРНК) для HIF -1 (рис. 2; дополнительная фигура S2). Нокдаун HIF-1 с помощью siRNA обратил вспять метаболические изменения (базальное дыхание, максимальное дыхание, резервную дыхательную способность и продукцию аденозинтрифосфата [АТФ]), индуцированные энародустатом, что показало, что метаболическое перепрограммирование в основном происходило через HIF-1 стабилизация (рисунок 2; дополнительная фигура S2). Активность пируватдегидрогеназы, важный фактор для использования клетками пирувата в качестве топлива для цикла трикарбоновых кислот, также снижалась под действием энародустата (рис. 2f), что согласуется с ранее опубликованными наблюдениями.

Исходные данные о крысах с диабетом, индуцированным стрептозотоцином

На основании результатов экспериментов in vitro мы предположили, что стабилизаторы HIF могут смягчать изменения метаболизма в ткани коры почек при диабете посредством метаболического перепрограммирования с цикла ТСА на гликолиз. Сначала мы выбрали крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином (STZ), в качестве модели для эксперимента по проверке концепции для проверки вышеупомянутой гипотезы. В этой модели диабет быстро индуцируется, что позволяет нам наблюдать чистое влияние диабета и стабилизаторов HIF на энергетический обмен в почечной ткани в течение короткого периода времени. Протокол исследования и основные данные экспериментов на крысах с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, показаны на рисунке 3а. Мы разделили крыс на 3 группы: группа А (ложная), группа Б (ДКД) и группа С (ДКД + энародустат). Уровни глюкозы плазмы крови, гликозилированного гемоглобина HbA1c, триглицеридов и общего холестерина на 14-й день были значительно повышены в диабетических группах по сравнению с группой А, тогда как между группами В и С не было существенных различий (рис. 3d-g). Хотя уровни креатинина в плазме не различались между группами, экскреция альбумина с мочой была значительно повышена, а гломеруломегалия была заметна в группе В по сравнению с группой А, и энародустат имел тенденцию обращать эти изменения (рис. 4). Уровни азота мочевины в крови были выше в диабетических группах, что отражает обезвоживание вследствие диабета. Таким образом, почки крыс, получавших STZ, в нашем исследовании представляют собой ранние стадии ДБП. Анализы транскриптома и метаболома проводили с использованием ткани коры почек этих крыс.

Транскриптомный анализ кортикальной ткани почек

Результаты транскриптомного анализа ткани коры почки показаны на рисунках 5 и 6. Анализ основных компонентов и анализ иерархической кластеризации показали, что группы A, B и C были разделены на разные кластеры соответственно (рис. 5a и b). Дифференциально экспрессируемые гены отбирали по │log2 кратности изменения (FC) │ больше или равно 0,5 и значению Q < 0,05.="" анализ="" онтологии="" генов="" и="" канонических="" путей="" показал,="" что="" гены,="" связанные="" с="" метаболизмом="" жирных="" кислот,="" активировались="" в="" группе="" в="" по="" сравнению="" с="" группой="" а.="" напротив,="" гены,="" связанные="" с="" метаболизмом="" глюкозы="" и="" реакцией="" на="" гипоксию,="" включая="" сеть="" hif{9}},="" активировались="" в="" группе="" с="" по="" сравнению="" с="" группой="" а.="" с="" группой="" b="" (рис.="" 5c="" и="" d).="" мы="" также="" провели="" анализ="" обогащения="" набора="" генов="" (gsea)="" с="" использованием="" транскриптомных="" данных="" (рис.="" 6,="" таблицы="" 1="" и="" 2).="" наборы="" генов="" метаболизма="" жирных="" кислот="" и="" аминокислот="" были="" усилены="" в="" группе="" в="" по="" сравнению="" с="" группой="" а="" (рис.="" 6).="" напротив,="" эти="" наборы="" генов="" были="" подавлены,="" а="" наборы="" генов="" метаболизма="" глюкозы="" были="" активированы="" в="" группе="" с="" по="" сравнению="" с="" группой="" в,="" показывая,="" что="" энародустат="" обращал="" изменения="" метаболизма,="" вызванные="" диабетом="" (рис.="" 6).="" более="" того,="" наборы="" генов="" цикла="" тса="" были="" подавлены="" в="" группе="" с="" по="" сравнению="" с="" группой="" в="" (таблица="" 2),="" что="" согласуется="" с="" представлением="" об="" индуцированном="" энародустатом="" метаболическом="" перепрограммировании="" в="" проксимальных="" канальцах,="" наблюдаемом="" в="" нашем="" исследовании="" in="" vitro.="" таким="" образом,="" энародустат="" противодействовал="" диабетическим="" изменениям="" почечного="" метаболизма="" с="" точки="" зрения="">

Метаболомный анализ кортикальной ткани почек

Мы измерили абсолютные концентрации 116 связанных с энергией метаболитов в ткани коры почек крыс (n =4 для каждой группы), случайно выбранных из каждой группы (дополнительная таблица S1; дополнительная фигура S3). Частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (PLS-DA) был выполнен для оценки значимости дискриминации по классам (рис. 7). Мы провели анализ обогащения набора метаболитов (MSEA) с использованием метаболитов с переменной значимостью PLS-DA в проекционной оценке (VIP) $ 1. Различия в метаболизме аминокислот, таких как глицин, серин, метионин, аспартат, глутамат, аргинин, пролин, и b-аланин между группами A и B. Различия в метаболизме аминокислот также наблюдались между группами В и С. Более того, процессы метаболизма глюкозы, такие как гликолиз и глюконеогенез, показали разные тенденции между группами В и С (рис. 7).

Визуализация данных транскриптома и метаболома на карте путей энергетического метаболизма

Мы визуализировали данные транскриптома и метаболома для всестороннего понимания изменений энергетического метаболизма (рис. 8). Было обнаружено, что гликолиз и метаболиты цикла ТСА накапливаются в группе В по сравнению с группой А, что может быть связано с избыточным притоком глюкозы и усилением метаболизма жирных кислот при ДБП. Концентрация аминокислот была снижена в группе В по сравнению с группой А, что отражает активацию метаболизма аминокислот (рис. 8а). Напротив, энародустат уменьшал накопление метаболитов гликолиза за счет облегчения протекания гликолиза. Энародустат также обращал вспять вызванные диабетом изменения в метаболитах и ​​аминокислотах цикла ТСА (рис. 8b). Более того, энародустат облегчал накопление глутатиондисульфида (GSSG) в диабетической почечной ткани и, таким образом, продемонстрировал более высокое соотношение глутатион/GSSG, что позволяет предположить, что энародустат ослаблял окислительный стресс при ДБП (рис. 8а и б). Снижение окислительного стресса было подтверждено уровнями маркера перекисного окисления липидов малонового диальдегида в ткани коры почек: энародустат обратил вспять накопление малонового диальдегида в диабетической ткани коры почек (дополнительная фигура S4). Таким образом, интеграция данных транскриптома и метаболома продемонстрировала, что энародустат противодействует изменениям энергетического метаболизма в почках, возникающим на ранних стадиях ДБП.

Симметричные изменения метаболизма (диабет по сравнению с энародустатом) подтверждены в альтернативной модели.

Мы провели анализ транскриптома у мышей с аллоксановым диабетом, еще одной модели диабета на животных, чтобы подтвердить наши выводы на крысиной модели. Протоколы исследования и исходные данные для модели на мышах показаны на рисунке 9. Экскреция альбумина с мочой была значительно повышена в группе B по сравнению с группой A, которая была реверсирована энародустатом (рисунок 9d). Кроме того, мы применили комплексный 3-анализ измерений (четкие, беспрепятственные коктейли визуализации мозга/тела и вычислительный анализ [CUBIC]–почки)16 для визуализации клубочков в почках. Гломеруломегалия была заметна в группе B по сравнению с группой A, которая была купирована энародустатом (рис. 9e). Анализ транскриптома почечной ткани у мышей с диабетом, индуцированным аллоксаном, показал симметричные изменения метаболизма (диабет по сравнению с энародустатом) таким же образом, как и в модели крыс с диабетом, индуцированным STZ (рис. 10): метаболизм жирных кислот повышался при диабете, тогда как метаболизм глюкозы метаболизм активировался энародустатом. Кроме того, метаболизм аминокислот повышался при диабете и подавлялся энародустатом. Таким образом, энародустат противодействовал изменениям почечного энергетического метаболизма, возникающим на ранних стадиях ДБП в модели диабета у мышей, индуцированного аллоксаном, а также в модели диабета у крыс, индуцированного СТЗ.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы продемонстрировали, что энародустат (JTZ-951), пероральный стабилизатор HIF, противодействует изменениям энергетического метаболизма в почках, возникающим на ранних стадиях ДБП в моделях диабета у крыс и мышей. Анализы транскриптома и метаболома показали симметричные изменения метаболизма в почечной ткани (диабет по сравнению с энародустатом): метаболизм жирных кислот и аминокислот повышался при ДБП, тогда как энародустат подавлял эти пути и дополнительно повышал метаболизм глюкозы (рис. 5–10).

До конца не выяснено, оказывает ли стабилизация HIF защитное действие на патофизиологию ДБП или нет. Предыдущие исследования показали, что диабетическая почечная ткань подвергается гипоксии17, а экспрессия HIF в диабетической почечной ткани недостаточна для ответа на их гипоксические состояния, что частично вызвано окислительным стрессом.18 Стабилизация HIF хлоридом кобальта улучшала статус окислительного стресса и уменьшала протеинурию и тубулоинтерстициального повреждения при DKD, индуцированной STZ.19 Результаты исследований на животных также показали, что стабилизация HIF защищает от развития ожирения,20 улучшает чувствительность к инсулину,20 и снижает уровень холестерина в сыворотке.21 Эти результаты свидетельствуют о защитных эффектах стабилизации HIF при развитии ДКД. Напротив, супрафизиологическая стабилизация HIF путем делеции von Hippel-Lindau, как сообщается, вызывает почечный фиброз. 22 Роль стабилизации HIF в прогрессировании ДБП может зависеть от контекста, учитывая плейотропные эффекты HIF и существование различных фенотипов ДБП. Цель этого исследования состояла в том, чтобы прояснить чистые эффекты стабилизации HIF на энергетический обмен в диабетической почке. В предыдущих отчетах указывалось, что при ДБП происходят изменения энергетического метаболизма. Sas et al.10 показали повышенный поток энергетического метаболизма и накопление метаболитов глюкозы в диабетической ткани коры почек, что может быть связано с митохондриальной дисфункцией. You et al.23 сообщили, что фумарат, метаболит цикла ТСА, накапливался в диабетической почечной ткани и непосредственно способствовал прогрессированию ДБП. Ранее мы показали, что метаболиты цикла ТСА накапливаются в диабетической почечной ткани, что устраняется ингибированием натрий-глюкозного котранспортера 2 или ограничением калорий. были повышены у пациентов с диабетом 1 типа без ДБП по сравнению с пациентами с ДБП. Активация PKM2 обращала вспять накопление метаболитов гликолиза и восстанавливала митохондриальную функцию, частично за счет увеличения потока гликолиза.24,25 Эти предыдущие отчеты предполагают, что накопление метаболитов гликолиза и цикла TCA может влиять на прогрессирование ДБП, которое можно смягчить за счет облегчения гликолиза, включая PKM2. активация. В нашем исследовании стабилизация HIF с помощью энародустата обращала вспять изменения энергетического метаболизма и уменьшала накопление гликолиза и метаболитов цикла TCA в диабетической ткани коры почек (рис. 8). Экспрессия гликолитических ферментов, включая PKM2, также повышалась под действием энародустата (дополнительная фигура S4B). Более того, энародустат уменьшал накопление GSSG и увеличивал соотношение глутатион/GSSG, что свидетельствует о том, что энародустат ослаблял окислительный стресс при ДБП (рис. 8). Это вызванное энародустатом снижение окислительного стресса также было подтверждено изменениями уровня малонового диальдегида в ткани коры почек (дополнительная фигура S4A). Эти результаты предполагают, что стабилизация HIF должна играть защитную роль в патофизиологии ДБП, по крайней мере, с метаболической точки зрения. Несомненно, мы не можем исследовать, оказывает ли метаболическое перепрограммирование путем стабилизации HIF прямое влияние на прогрессирование ДБП, потому что может быть невозможно различить чистые эффекты изменений метаболизма на почечный исход из-за плейотропной роли HIF. Однако в нашем исследовании умеренная экскреция альбумина с мочой и почечные патологические нарушения (гломеруломегалия и утолщение базальной мембраны клубочков), вызванные диабетом, были смягчены энародустатом в связи с нормализацией почечного энергетического метаболизма. Мы извлекли гены, изменения экспрессии которых коррелировали с уровнями альбумина в моче (257 зондов; 232 гена) из данных микрочипа в модели мышей с диабетом, индуцированным аллоксанами, и провели анализ обогащения путей (дополнительная фигура S5). В результате пути, связанные с митохондриальной мембраной и дыхательным транспортом электронов, активируются, что связано с уровнями альбумина в моче, что указывает на то, что митохондриальная нагрузка тесно связана с экскрецией альбумина с мочой. Таким образом, существует вероятность того, что метаболическая нормализация диабетической почечной ткани с помощью стабилизаторов HIF может снизить митохондриальную нагрузку и смягчить прогрессирование ДБП. Наши данные предполагают следующую патофизиологию ДБП с метаболической точки зрения: гипергликемия создает потребность в энергии для реабсорбции глюкозы в проксимальных канальцах почек; таким образом, цикл ТСА в митохондриях принудительно активируется для удовлетворения потребности в энергии на ранних стадиях ДБП (усиление метаболизма жирных кислот и аминокислот). И стабилизаторы HIF могут смягчить эту митохондриальную нагрузку за счет метаболического перепрограммирования с цикла ТСА на гликолиз (снижение метаболизма жирных кислот и аминокислот и усиление гликолиза), что может играть защитную роль против прогрессирования ДБП. Необходимы дальнейшие исследования, включая одноклеточные омики, чтобы выяснить, как митохондриальная нагрузка в почечной ткани напрямую влияет на патофизиологию ДБП. Другой интересный вопрос заключается в том, влияют ли стабилизаторы HIF непосредственно на всасывание глюкозы в проксимальных канальцах. Наши данные in vitro показали, что выработка АТФ значительно снижается под действием энародустата посредством метаболического перепрограммирования с цикла ТСА на гликолиз (рис. 1 и 2). Учитывая, что АТФ необходим для реабсорбции глюкозы натрий-глюкозным котранспортером 2, мы сначала предположили, что реабсорбция глюкозы может быть инактивирована энародустатом. Однако уровни глюкозы в моче существенно не различались между группами B и C в обеих моделях животных (дополнительная фигура S6). Вероятно, снижение продукции АТФ энародустатом в физиологической ситуации гораздо мягче по сравнению с его действием in vitro; таким образом, стабилизация HIF не влияет на абсорбцию глюкозы через натрий-глюкозный котранспортер 2, по крайней мере, в наших экспериментах на животных. Наше исследование имело 2 ограничения. Во-первых, мы использовали STZ-индуцированных диабетических крыс и аллоксан-индуцированных диабетических мышей в качестве моделей DKD на ранней стадии и наблюдали краткосрочные эффекты диабетических состояний. Однако в клинических условиях стабилизаторы HIF будут назначаться пациентам с анемией на поздних стадиях ДБП. Необходимы дополнительные исследования, чтобы понять влияние стабилизации HIF на изменения почечного метаболизма при поздних стадиях ДБП. Во-вторых, исследованию не хватало статистической мощности в отношении дисперсии концентраций метаболитов в данных метаболома, тогда как данные транскриптома имели статистическую мощность, достаточную для прояснения всей картины энергетического метаболизма. Поскольку не многие метаболиты показали значительную разницу между группами, мы провели PLS-DA и выбрали метаболиты с оценкой VIP PLS-DA больше или равной 1 для MSEA. Хотя трудно перекрестно проверить метаболические изменения, используя только данные метаболомики, результаты анализа метаболома были совместимы с данными транскриптомии (рис. 7 и 8), что обеспечивает дополнительную поддержку наблюдаемых эффектов изменений транскриптома на почечный энергетический метаболизм. В заключение, энародустат (JTZ-951), пероральный стабилизатор HIF, противодействует изменениям почечного энергетического метаболизма на ранних стадиях ДБП. Наше исследование предполагает, что стабилизация HIF может служить потенциальным вмешательством, направленным на нарушение регуляции почечного энергетического метаболизма при ДБП.

МЕТОДЫ

Митостресс-тест и анализ скорости гликолиза

Клетки HK-2 высевали на микропланшет с 96-лунками при плотности 1 * 10⁴клеток/лунку. На следующий день метаболический поток измеряли в режиме реального времени с помощью анализатора Seahorse XFe96 (Agilent) с использованием набора для стресс-тестирования Mito (103015-100; Agilent) или набора для анализа скорости гликолиза (103344- 100; Agilent). Концентрации глюкозы, пирувата и глутамина в культуральных средах составляли 10 ммоль/л, 1 ммоль/л и 2 ммоль/л соответственно.

трансфекция миРНК

Нокдаун HIF-1 был проведен с помощью Stealth RNAi для HIF1A человека (HSS104774 [№1] и HSS104775 [№2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Отрицательный контроль Stealth RNAi siRNA Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) использовали в качестве отрицательного контроля.

Вестерн-блоттинг

Первичными антителами, используемыми для окрашивания, были антитела против HIF-1 человека (поликлональные кроличьи, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) и антитела против актина человека (поликлональные кроличьи, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. , Луис, Миссури). Вторичным антителом было козье анти-кроличье IgG-антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Эксперименты на животных

Крысы Crl: CD (Sprague Dawley) и мыши Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) были получены от Charles River Laboratories Japan Inc. (Иокогама, Япония). Все эксперименты были одобрены Институциональным наблюдательным советом Токийского университета (номер утверждения P17-110). Все процедуры с животными выполняли в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных). Протоколы исследования показаны на рисунках 3 и 9.

Транскриптомный анализ

Тотальную РНК из кортикальной ткани почек выделяли с использованием набора Miniprep GenElute Mammalian Total RNA (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich). Тотальную РНК (100 нг) метили с использованием комплекта для маркировки Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent), а затем гибридизовали с микрочипом SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K (для крыс; Agilent) и SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (для мыши) соответственно. Все эксперименты с микрочипами были выполнены компанией DNA Chip Research Inc. (Токио, Япония). Необработанные данные были обработаны с помощью пакета R limma в Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) для выполнения коррекции фона и нормализации данных с использованием метода квантильной нормализации. Пакетные эффекты были удалены с помощью ComBat (Bioconductor) в эксперименте на крысах. Дифференциально экспрессируемые гены определяли по │log2 FC│ больше или равно 0,5 и значению Q < 0,05.="" генная="" онтология="" и="" анализ="" канонических="" путей="" были="" проведены="" с="" использованием="" механизма="" корреляции="" basespace="" (illumina,="" сан-диего,="" калифорния).="" данные="" микрочипа="" были="" депонированы="" в="" национальном="" центре="" биотехнологической="" информации="" об="" экспрессии="" генов="" как="" серия="" gse131221="" (крыса)="" и="" gse139317="">

Анализ обогащения набора генов

GSEA — это вычислительный метод, который определяет, показывает ли априорно определенный набор генов статистически значимые, согласующиеся различия между двумя биологическими состояниями. GSEA выполняли с использованием GSEA v.3.0 (Broad Institute, Кембридж, Массачусетс). Пути с частотой ложных открытий < 0,25="" считались="">

Метаболический анализ

Измерения метаболизма были выполнены Human Metabolome Technologies Inc. (Цуруока, Япония). Концентрации метаболитов рассчитывали путем нормализации площади пика каждого метаболита по отношению к площади внутреннего стандарта и с использованием стандартных кривых, полученных в результате 3-точечной калибровки. См. также Дополнительные методы.

Анализ обогащения набора метаболитов

Анализ данных метаболомики проводился с использованием интегрированной веб-платформы MetaboAnalyst 4.0. Был выполнен PLS-DA, и были рассчитаны соответствующие баллы VIP. Для MSEA использовали метаболиты с оценкой VIP PLS-DA больше или равной 1.

Количественное определение зон клубочков при почечных патологиях

Мы случайным образом сделали 3 патологических изображения из каждого образца, окрашенного периодической кислотой-Шиффом, и измерили каждую область клубочков, соответственно, с помощью Фиджи (распределение ImageJ; Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд).

CUBIC-почка

Комплексное 3-размерное изображение клубочков в почечной ткани было выполнено с использованием CUBIC в соответствии с нашими предыдущими работами. Вкратце, фиксированные почки мышей погружали в CUBIC-L для делипидирования, а затем подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию. Наконец, показатель преломления был подобран путем размещения образцов в CUBIC-R plus. Полные трехмерные изображения прозрачных почек были получены с помощью специальной флуоресцентной микроскопии светового листа (MVX10-LS; Olympus, Токио, Япония). Первичным антителом, использованным для окрашивания, было антитело против подоцина (кроличье поликлональное, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). Вторичным антителом был ослиный антикроличий IgG, конъюгированный с Alexa Flour 555- (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).

статистический анализ

Для множественных сравнений применялся {{0}}вариантный анализ с последующим апостериорным тестом множественных сравнений Тьюки, если это уместно. Все статистические анализы проводились с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). P <0,05 считался="" статистически="" значимым.="" данные="" представлены="" как="" среднее="" ±="" стандартное="">

РАСКРЫТИЕ

Миннесота получила гонорары, консультационные услуги или финансирование исследований от KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Bayer, Boehringer Ingelheim. , и Алексион. TT получил исследовательский грант от JT. Энародустат (JTZ-951) был предоставлен JT, Токио, Япония. EAS и HRU являются соавторами патентов, принадлежащих RIKEN. Часть этого исследования была проведена в сотрудничестве с корпорацией Olympus и программным обеспечением, поддерживаемым Bitplane. Другой автор заявил об отсутствии конкурирующих интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарны доктору Шухей Яо и доктору Синдзи Танаке за ценные обсуждения. Мы также благодарим д-ра Цуёси Иноуэ, д-ра Сатору Фукуда и г-жу Кахору Амитани за их техническую поддержку. Эта работа была частично выполнена при поддержке Центра изотопных наук Токийского университета. Эта работа была поддержана научным сотрудником Японского общества содействия развитию науки (JSPS) (грант JSPS KAKENHI 19J11928 для SH), грантом для научных исследований (B) (грант JSPS KAKENHI 18H02824 для MN). ), Грант в помощь для научных исследований (C) (грант JSPS KAKENHI 17K09688 для TT) и Грант в помощь для научных исследований в инновационных областях (грант KAKENHI 26111003 для MN).