Быстрый и спонтанный послеродовой клиренс Plasmodium falciparum связан с изгнанием плаценты

Среди беременных женщин с защитным иммунитетом к малярии Plasmodium falciparum в паразитемии часто преобладают VAR2CSA-положительные инфицированные эритроциты (ИЭ). VAR2CSA опосредует секвестрацию ИЭ в плаценте. Мы предположили, что наблюдавшееся ранее спонтанное послеродовое избавление от паразитемии у таких женщин связано с изгнанием плаценты, удаляющей очаг секвестрации VAR2CSA-положительных ИЭ. Мы оценили паразитемии и транскрипцию генов до и вскоре после родов у 17 ганских женщин. Резкое снижение послеродовой паразитемии сопровождалось избирательным снижением транскрипции гена, кодирующего VAR2CSA. Наши результаты дают механистическое объяснение более раннему наблюдению.

Ключевые слова.

приобретенный иммунитет; VAR2CSA; pfEMP1; плацентарная малярия; малярийный плазмодий; беременность; гены var; вариантно-специфический иммунитет.

Жители районов со стабильной трансмиссией паразитов Plasmodium falciparum приобретают стойкий защитный иммунитет к малярии в детстве, рассмотрено в ссылке [1]. Белок 1 мембраны эритроцитов P. falciparum (PfEMP1) представляет собой семейство паразитарных антигенов, кодируемых примерно 60 генами var на геном и опосредующих секвестрацию зрелых инфицированных эритроцитов (ИЭ) на сосудистые рецепторы хозяина, рассмотренные в ссылке [2]. Несмотря на важность PfEMP1 в приобретенном защитном иммунитете, женщины в таких районах тем не менее становятся очень восприимчивыми к малярии во время беременности. Это связано с заражением паразитами, экспрессирующими PfEMP1 VAR2CSA-типа, что приводит к накоплению ИЭ в межворсинчатом пространстве, вызывая плацентарную малярию [2, 3].

VAR2CSA опосредует адгезию ИЭ к низкосульфатированному хондроитинсульфату (CSA), рецептору хозяина, который обычно ограничен плацентой [4]. Рецептор-специфическая секвестрация ИЭ является важной стратегией выживания паразитов, поскольку предотвращает разрушение селезенки зрелых ИЭ [2]. Таким образом, VAR2CSA-положительные ИЭ находятся в крайне невыгодном положении у небеременных хозяев, а VAR2CSA-специфический иммуноглобулин G (IgG) не приобретается до первой беременности [2, 3]. Этим объясняется высокая восприимчивость беременных женщин (и особенно первородящих) к малярии, вызванной P. falciparum, даже в районах со стабильной паразитарной трансмиссией, где прочный защитный иммунитет приобретается задолго до достижения детородного возраста [3]. В инфекциях, вызванных P. falciparum у беременных женщин, действительно часто преобладают паразиты, экспрессирующие VAR2CSA [5], хотя также часто обнаруживаются паразиты, экспрессирующие другие типы PfEMP1 (и предположительно секвестрирующиеся вне плаценты) [6]. Исходя из этого, мы предлагаем выделить 2 принципиально разных типа малярии у беременных. Одной из них является плацентарная малярия, которая вызывается паразитами, экспрессирующими VAR2CSA, и возникает в основном у женщин с низкой рождаемостью без существенного специфического для VAR2CSA защитного иммунитета. Другой тип — малярия, вызываемая паразитами, экспрессирующими другие типы PfEMP1, и при которой ИЭ секвестрируются в неплацентарных тканях. Этот последний тип не ограничивается беременными женщинами и может встречаться у женщин любого паритета. Это просто отражает пробелы в вариантном (в основном PfEMP1) специфичном иммунитете в целом [7].

Имея это в виду, мы предположили, что более ранние сообщения о спонтанном разрешении паразитемии P. falciparum у беременных женщин в Африке в течение нескольких дней после родов [8, 9] отражают внезапное исчезновение очага секвестрации VAR2CSA-позитивных ИЭ как плацента отторгается во время родов.

МЕТОДЫ

Учебный центр и участники

Исследование проводилось в 5 медицинских учреждениях (Абура-Дунква, Бирива, Манкесим, Мори и Солтпонд) в центральном регионе Ганы. Передача P. falciparum в районе исследований стабильна, но со значительными сезонными колебаниями.

В период с ноября 2020 г. по февраль 2021 г. были отобраны беременные женщины на ближнем сроке, давшие письменное согласие на участие в исследовании после получения устной и письменной информации о его целях. Женщины с любыми формами осложнений беременности исключались из участия. Хотя большинство женщин получали прерывистое профилактическое лечение в рамках текущей политики дородового ухода в Гане (дополнительная таблица 1), ни одна из них не получала противомалярийного лечения в какой-либо форме на протяжении всего исследования (т. е. незадолго до родов до конца их участие через несколько дней). Исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Мемориального института медицинских исследований Ногучи (NMIMR-IRB CPN 005/20-21) и комитетом по этике исследований Службы здравоохранения Ганы (GHS-ERC 005/08/20).

Обнаружение и количественная оценка инфекции P. falciparum

Инфекцию паразитами P. falciparum определяли с помощью экспресс-теста, микроскопии мазков крови, окрашенных по Гимзе, и количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), по существу, как описано ранее [10, 11], с использованием собранных образцов периферической крови. ДНК, экстрагированная из шестикратного 10-разведения культуры in vitro P. falciparum IT4 на кольцевой стадии при паразитемии 1%, использовалась для построения стандартной кривой, позволяющей количественно определить паразитемию с помощью количественной ПЦР.

Анализ транскрипции гена var

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 градуса от ожидаемого значения. Обилие транскриптов рассчитывали с использованием 2-ΔCt, где среднее значение ΔCt=означает пару праймеров Ctvar - среднее значение Ctendogenous контроля.

Статистический анализ

Ассоциации между транскрипцией var2csa и клиническими переменными были проверены с помощью ранговой корреляции Спирмена с поправкой на множественное тестирование. Корреляцию между паразитемиями, обнаруженными при микроскопии и с помощью ПЦР, оценивали с помощью теста корреляции Пирсона продукт-момент. Данные, полученные в разные моменты времени, сравнивали с помощью дисперсионного анализа повторных измерений (RM-ANOVA) или RM-ANOVA по рангам (RM-ANOVA-R), в зависимости от ситуации, с последующим апостериорным тестированием парных различий. Программное обеспечение SigmaPlot версии 14 (Systat Inc) использовалось для анализа данных и значений P.<.05 were considered significant.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Участники исследования

В общей сложности 377 давших согласие женщин прошли скрининг на инфекцию P. falciparum во время родов. Из них 15 (4,0%) были паразитопозитивными при микроскопии мазка периферической крови из пальца, 24 (6,4%) - при экспресс-тесте и 50 (13,3%) - при ПЦР. Основываясь на этих результатах, 17 женщин с положительным результатом экспресс-теста были отобраны для последующего наблюдения через 8–16 часов после родов, через 24–48 часов после родов и через 48–72 часа после родов. Клиническая информация об участниках исследования обобщена в дополнительной таблице 1. Статистически значимых ассоциаций между долей паразитов, транскрибирующих var2csa, и любой из перечисленных клинических переменных не было.

Послеродовая очистка от паразитемии

На момент родов все участники исследования были паразитированы по мазку крови и/или количественной ПЦР (дополнительная таблица 1). Через 8-16 часов после родов у 14 из 17 женщин обнаруживаемая под микроскопом паразитемия спонтанно уменьшилась (т. е. без терапевтического вмешательства) (рис. 1А). К 24–48 часам после родов паразитемии еще больше снизились и были очень низкими или не обнаруживались у большинства женщин (P=0,03 по сравнению с дородовым периодом, Friedman RM-ANOVA-R). Еще через 24 часа у всех женщин, кроме 1, не было обнаруживаемой паразитемии (P=0,005 по сравнению с дородовым периодом, RM-ANOVA-R). Что касается паразитемий, обнаруженных с помощью ПЦР (рис. 1В), послеродовые паразитемии были значительно ниже на 24–48 часов и 48–72 часа, чем до родов (P <0,001, RM-ANOVA-R). Уровни также были значительно ниже через 48–72 часа после родов, чем через 8–16 часов после родов (P <0,001, RM-ANOVA-R). Паразитемии, оцененные с помощью микроскопии и количественной ПЦР, значительно коррелировали (P <0,001). Эти данные подтверждают предыдущие сообщения о быстрой и спонтанной послеродовой элиминации паразитемии P. falciparum у женщин, проживающих в районах со стабильной трансмиссией этого паразита [8, 9].

Паразитная транскрипция генов var

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Prior to delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >90 процентов от общей транскрипции var) у 9/17 женщин, а транскрипция var2csa может быть обнаружена у всех (рисунок 2 и дополнительный рисунок 1). Таким образом, транскрипция генов var, не связанных с плацентарной малярией, была обнаружена (в дополнение к var2csa) у всех дородовых участниц и преобладала у некоторых женщин, в соответствии с предыдущими наблюдениями [6].

Доля транскриптов var2csa уменьшилась во время послеродового наблюдения у всех женщин (рис. 2 и дополнительная рис. 1) параллельно со снижением паразитемии (рис. 1). Таким образом, имел место заметный сдвиг от транскрипции var2csa до родов к транскрипции других генов var после родов. Единственными исключениями (среди тех женщин, у которых были доступны данные послеродовой транскрипции) были участницы B213, S003, S001 и B201 (дополнительный рисунок 1). Однако, основываясь на наблюдении, что послеродовые паразитемии также заметно снизились среди этих женщин (рис. 1), мы считаем вероятным, что соответствующий сдвиг в сторону от транскрипции var2csa был бы замечен, если бы были доступны данные из более поздних временных точек. В целом данные полностью согласуются с избирательным исчезновением VAR2CSA-положительных ИЭ, как мы и предполагали.

ОБСУЖДЕНИЕ

PfEMP1 представляет собой семейство белков, экспортируемых внутриэритроцитарными паразитами P. falciparum на поверхность ИЭ, где они функционируют как лиганды адгезии для различных сосудистых рецепторов хозяина [2]. Эти лиганды кодируются клонально вариантным семейством генов var, насчитывающим около 60 членов на гаплоидный геном паразита. Гены транскрибируются и транслируются взаимоисключающим образом, гарантируя, что только один PfEMP1 экспрессируется на поверхности IE в любой момент времени. Тем не менее, каждый паразит может переключаться между своими различными генами var, что позволяет изменять специфичность адгезии ИЭ и антигенные свойства [2].

Белки PfEMP1 могут быть сгруппированы и подгруппированы в соответствии с набором структурных критериев, влияющих на их функциональные характеристики [2]. Таким образом, группа A PfEMP1 (кодируемая примерно десятком генов var на геном) опосредует адгезию ИЭ к рецепторам хозяина, таким как EPCR и ICAM -1, и участвует в патогенезе тяжелой детской малярии в целом и церебральной малярии. в частности [2]. Напротив, транскрипция генов, принадлежащих к группам B и C, по-видимому, связана с неосложненной малярией и бессимптомными инфекциями. Наконец, PfEMP1 VAR2CSA-типа, кодируемый всего одним или несколькими генами var2csa на геном паразита, функционально и антигенно полностью отличается от всех других PfEMP1 и активно участвует в патогенезе, а также в приобретенном иммунитете к плацентарным инфекциям. малярия [2, 3, 13].

Кроме того, большая часть имеющихся данных указывает на VAR2CSA как на основной и, вероятно, единственный добросовестный лиганд CSA. Наконец, ранее было показано, что периферическая паразитемия у беременных с пожизненным воздействием P. falciparum включает и часто преобладает ИЭ, которые VAR2CSA-позитивны и имеют общий характерный фенотип плацентарных инфекций P. falciparum [5, 13–13]. 15]. На этом основании мы предположили, что наиболее убедительным объяснением спонтанного избавления от паразитемии у беременных женщин в течение нескольких дней после родов [8, 9] является селективная деструкция селезенки VAR2CSA-позитивных ИЭ после изгнания плаценты во время родов, что эффективно удаляет их родственный рецептор адгезии.

Представленные здесь результаты подтверждают ранее сообщавшееся [8, 9] быстрое послеродовое устранение периферической паразитемии P. falciparum (рис. 1). Кроме того, они подтверждают наблюдения о том, что периферическая паразитемия у африканских беременных женщин включает паразитов, транскрибирующих var2- csa [6, 15] (рисунок 2 и дополнительный рисунок 1), и в них часто преобладают паразиты. Однако наиболее важно то, что наши данные расширяют эти более ранние наблюдения, предоставляя впервые убедительные доказательства механистического объяснения быстрого послеродового очищения от периферических паразитов у женщин с приобретенным естественным путем иммунитетом к малярии, вызванной P. falciparum. Помимо численно очень незначительной и лишь погранично значимой разницы в транскрипции var группы A1 (дополнительная фигура 2), единственным значительным и статистически значимым изменением в транскрипции генов var после родов было снижение относительной транскрипции var2csa (рисунок 2B и дополнительная Фигура 2).

Наше исследование имеет ограничения. Размер выборки небольшой. Это в основном связано с успешным внедрением прерывистого профилактического лечения малярии для беременных женщин, что сделало плацентарную малярию намного менее распространенной и потребовало скрининга многих женщин для выявления подходящих участников. Кроме того, ограниченные возможности в нашем исследовательском центре препятствовали прямой оценке специфичности рецепторов адгезии собранных ИЭ или их иммунологического фенотипа. Тем не менее, текущие данные и более ранние результаты органично сочетаются.

В заключение мы представили доказательства того, что резкое исчезновение очага секвестрации VAR2CSA-положительных ИЭ при изгнании плаценты в значительной степени способствует быстрому и спонтанному послеродовому клиренсу паразитемии P. falciparum у женщин с естественным контактом с этими паразитами. Паразиты, транскрибирующие другие гены var и демонстрирующие PfEMP1 не-VAR2CSA-типа на поверхности ИЭ, часто неспособны размножаться и вызывать заболевания у взрослых в эндемичных районах из-за защитного PfEMP1-специфического иммунитета к малярии, приобретенного в детстве [2]. . Дальнейшая выживаемость ИЭ без VAR2CSA в послеродовом периоде может быть дополнительно нарушена физиологическими процессами, связанными с родами, такими как провоспалительные иммунные реакции. Наконец, неявный прием противомалярийных препаратов непосредственно перед родами, вероятно, может способствовать этому. Какой бы ни была причина, паразитемия заметно уменьшилась после родов у некоторых женщин, где паразиты, транскрибирующие var2csa, составляли лишь меньшую часть дородовой паразитемии, и этот вывод заслуживает дальнейшего изучения. Наше исследование подтверждает ключевую роль PfEMP1 в приобретенном иммунитете к малярии в целом и, в частности, VAR2CSA в патогенезе и иммунитете плацентарной малярии.

Дополнительные данные

Дополнительные материалы доступны в Журнале инфекционных заболеваний онлайн. Состоящие из данных, предоставленных авторами в интересах читателя, размещенные материалы не редактируются и являются исключительной ответственностью авторов, поэтому вопросы или комментарии должны быть адресованы соответствующему автору.

Примечания

Авторские вклады.

NGA, MPQ, MFO и LH внесли свой вклад в концепцию и дизайн исследования. NGA провела сбор образцов. NGA, MPQ и LH провели анализ данных. NGA, MPQ и LH подготовили рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Благодарности.

Мы благодарны всем женщинам, согласившимся принять участие в нашем исследовании. Мы также благодарим всех акушерок, врачей, фельдшеров и медсестер в различных медицинских учреждениях за их помощь в сборе образцов.

Отказ от ответственности.

Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Финансирование для оплаты стоимости публикации в открытом доступе для этой статьи было предоставлено Данидой.

Финансовая поддержка.

Эта работа была поддержана Данидой (номер гранта 17-02-KU для проекта MAVARECA-II), включая аспирантуру в NGA. Исполнительное агентство по исследованиям Европейской комиссии поддержало MPQ (номер гранта 101028915, индивидуальная стипендия Марии Склодовской-Кюри 2020 г.). , проект PAMSEQ).

Возможные конфликты интересов.

Все авторы: о конфликте интересов не сообщалось. Все авторы представили форму ICMJE для раскрытия потенциальных конфликтов интересов. Выявлены конфликты, которые редакция считает относящимися к содержанию рукописи.

Рекомендации