Регулируемые теафлавином конденсаты Imd контролируют кишечный гомеостаз и старение дрозофилы

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

РЕЗЮМЕ

Черный чай является наиболее широко потребляемым чайным напитком в мире, и неоднократно сообщалось, что он обладает омолаживающими свойствами. Однако остается в значительной степени неизвестным, участвуют ли теафлавины, один тип характерных фитохимических веществ в экстрактах черного чая, в регулировании старения и продолжительности жизни у потребителей. В этом исследовании мы показываем, что теафлавины играют полезную роль в предотвращении возрастной несостоятельности кишечника и дисбактериоза, тем самым замедляя старение у дрозофилы. Механически теафлавины регулируют сборку конденсата Imd, чтобы негативно управлять сверхактивацией сигналов Imd в кишечнике плодовой мушки. Кроме того, теафлавины предотвращают колит, вызванный DSS, у мышей, что позволяет предположить, что теафлавины играют роль в модуляции целостности кишечника. В целом, наше исследование раскрывает молекулярный механизм, с помощью которого теафлавины регулируют гомеостаз кишечника, вероятно, посредством контроля слияния Imd.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

ВВЕДЕНИЕ

Старение, характеризующееся снижением физиологических функций в отдельных системах органов и растущим риском заболеваний и смерти, связано с накоплением повреждений молекул, клеток и тканей (Alavez et al., 2011; Bartke et al., 2019; Engeet). др., 2017). Выявление функциональных материалов или химических веществ, предотвращающих биологический износ, замедляющих процесс старения и увеличивающих продолжительность жизни, несомненно, имеет ключевое значение (Bar-ardo et al., 2017; Kapahi et al., 2017). Предыдущие исследования показали, что черный чай, наиболее широко потребляемый чай в мире, обладает значительной активностью, замедляющей старение (Cameron et al., 2008; Fei et al., 2017; Kumar and Rizvi, 2017; Naumovski et al., 2019). ; Пэн и др., 2009; Сяо и др., 2020). Пищевые добавки с экстрактами черного чая эффективно увеличивают продолжительность жизни экспериментальных животных, таких как черви (Feet al., 2017), дрозофилы (Peng et al., 2009; Site al., 2011), мыши (Site al., 2011). ; Xiao et al., 2020) и крысы (Kumar and Rizvi, 2017).

Хорошо известно, что экстракты черного чая в основном содержат два вида фитохимических веществ, а именно катехины и теафлавины (TF) (Cameron et al., 2008; Kondo et al., 2019; Li et al., 2013), последний из которых вырабатываются из катехинов эндогенной полифенолоксидазой и пероксидазой в процессе окисления при производстве черного чая (Li et al., 2013). Ряд исследований определил антивозрастную роль катехинов за счет уменьшения окислительного стресса и возрастного воспаления, а также уменьшения повреждения тканей (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Si et al. .2011; Ваанер и др., 2015). Однако функциональные исследования вклада ТФ в старение сильно отстают от исследований катехинов, поскольку трудно извлечь достаточное количество ТФ из листьев черного чая для медицинских исследований (Takemoto and Takemoto, 2018). Недавно было разработано несколько биосинтетических методов для массового производства TF (Takemoto and Takemoto, 2018), что позволило изучить точные биологические эффекты TF и ​​лежащие в их основе регуляторные механизмы.

В последнее время все больше данных подчеркивают ключевую роль кишечника в модуляции старения и продолжительности жизни (Guo et al., 2014; Jji et al., 2019; Maynard and Weinkove, 2018; Rothenberg and Zhang, 2019; Salazar et al. , 2018). Эпителий кишечника, который действует как избирательный барьер, позволяет поглощать питательные вещества, ионы и воду и ограничивает контакт хозяина с вредными объектами, включая микроорганизмы, пищевые антигены и токсины окружающей среды (Capo et al., 2019; Nicholson et al. , 2012; Рю и др., 2010). В качестве ткани с высоким оборотом у людей кишечный тракт обеспечивает наилучшую среду обитания для симбиотических микроорганизмов, включая естественные анаэробные условия, обилие питательных веществ и подходящую температуру и pH.

Рисунок 1. Теафлавины продлевают жизнь дрозофилы и улучшают способность лазать.

(A и B) Самок плодовых мушек культивировали со стандартными кормами, которые были дополнены 1 мг/мл или 2,5 мг/мл теафлавинами (TF) или без TF в качестве базового. Мух переносили в свежие флаконы, содержащие новую среду, через день, и мертвых мух подсчитывали на протяжении всей взрослой жизни. Были проанализированы и показаны кривые выживания (A) и средняя продолжительность жизни (B) самок мух.

(Cand D) Самки w18 получали стандартные корма для дрозофилы (обозначаемые как базальные) или корма с добавками 1 мг/мл или 2,5 мг/ETF соответственно. Шесть независимых групп мух в указанном возрасте (10 дней, 30 дней, 40 дней и 50 дней соответственно) подвергали анализам кафе (С) и кормлению флуоресцеином (D). значение, образуя в организме ниши, занимаемые конкретными видами бактерий (Bonfini et al., 2016; Buchon et al., 2013; Nicholson et al., 2012). Между тем, эти симбиотические микроорганизмы и их метаболиты также прямо или косвенно влияют на переработку питательных веществ; пищеварение и всасывание; энергетический баланс; иммунная функция; развитие и созревание желудочно-кишечного тракта; и многие другие важные физиологические активности (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Maynard and VVeinkove, 2018; Nicholson et al., 2012). Взаимовыгодные отношения между двумя симбионтами могут поддерживать стабильность и динамическое равновесие кишечной микроэкосистемы (Bonfini et al., 2016; Brodeerick, 2016; Broderick et al., 2014; Guo et al., 2014; May-nard and Weinkove, 2018; Николсон и др., 2012).

цистанхе может омолаживать

Серия исследований показала, что врожденный иммунный ответ имеет решающее значение для поддержания гомеостаза микробиоты кишечника и сохраняется от беспозвоночных до позвоночных (Guillouet al., 2016; Guo et al., 2014; Ryu et al., 2006, 2010; Vijay- Кумар и др., 2010). У дрозофилы два основных сигнальных пути, а именно пути Toll и иммунодефицита (Imd), участвуют во врожденных иммунных реакциях (Lu et al., 2020; Myllymakiet al., 2014; Valanne et al., 2011). Примечательно, что путь Toll дрозофилы имеет сходство с путями рецептора -1 интерлейкина млекопитающих (IL-1R) и MyD88-зависимого Toll-подобного рецептора (TLR), тогда как путь Imd аналогичен пути к пути рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) и TRIF-зависимому пути TLR у млекопитающих (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011). Эти два пути контролируют экспрессию антимикробных пептидов (AMP) посредством активации факторов транскрипции NF-KB (Imler, 2014; Myllymaki et al., 2014; Valanne et al., 2011).биофлавоноидыСигнальный путь Imd обычно активируется грамотрицательной бактериальной инфекцией и приводит к экспрессии другого набора AMP, такого как аттацин, цекропин и диптерицин (Kleino and Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Для экспрессии этих АМП требуется рецептор белка распознавания пептидогликана (PGRP)-LC в пути Imd, а также сигнал-зависимое расщепление и ядерная транслокация Relish, фактора транскрипции семейства NF-kB (Kleino and Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014). Недавнее исследование показало, что образование амилоида необходимо для активации пути Imd Drosophila при распознавании бактериальных пептидогликанов (Kleino et al., 2017). Однако остается неизвестным, участвует ли этот конденсат Imd в других биологических процессах, таких как поддержание гомеостаза кишечника и регуляция старения.

В настоящем исследовании мы использовали плодовых мушек и мышей в качестве животных моделей для изучения роли ТФ в контроле целостности кишечника и старении. Мы показали, что ТФ задерживают возрастную гиперпролиферацию стволовых клеток кишечника, защищают от дисбиоза кишечного микробиома и предотвращают активацию сигнального пути Imd, тем самым продлевая продолжительность жизни дрозофилы. Дальнейшие механистические исследования показали, что TF отрицательно способствуют передаче сигналов Imd, возможно, за счет блокирования конденсации Imd, а не его убиквитинирования. Более того, мы обнаружили, что ТФ очень эффективны в предотвращении индуцированного DSS колита у мышей. В совокупности наши результаты показывают потенциальную роль TF в модуляции поведения Imd, что может быть ключевым фактором их положительного вклада в гомеостаз кишечника и увеличение продолжительности жизни.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Пищевые добавки теафлавинов продлевают жизнь дрозофилы

Чтобы выяснить, влияют ли теафлавины (TF) на старение и продолжительность жизни дрозофилы, мы выращивали самок мух w'118 со стандартными кормами для выращивания, которые были дополнены 1 мг/мл или 2,5 мг/мл TF, и проводили анализы продолжительности жизни, как описано ранее (Ji et al. ., 2019). Контролем считали мух, получавших рацион с добавлением равного объема растворителя ТФ (H2O). Как показано на рисунке 1А, добавление в пищу относительно низкой концентрации ТФ (1 мг/мл) незначительно продлевало продолжительность жизни плодовых мушек, а высокая концентрация ТФ (2,5 мг/мл) оказывала значительное положительное влияние на увеличение продолжительности жизни. Примечательно, что длительное поглощение высоких концентраций TF (2,5 мг/мл) привело к увеличению средней продолжительности жизни самок мух примерно на 8 дней (рис. 1B), что свидетельствует о полезной роли TFsin в регулировании продолжительности жизни дрозофилы. Аналогичные результаты были получены, когда мы проверили потенциальное влияние дополнительных ТФ на продолжительность жизни самцов мух w'*'''8 (рис. S1A и S1B).

Рисунок 2. Теафлавины предотвращают возрастную дисфункцию кишечника и дисбактериоз микробиоты у дрозофилы.

(A и B) Потеря целостности кишечника оценивалась с помощью Smurftest в возрасте 10, 30, 40 и 50 дней у взрослых самок w18. Примеры не-Смурфа и Смурфа были показаны в (А). Процентное содержание смурфов в различных указанных группах было проанализировано и показано на (B).

(C) Было проанализировано и показано количество бактерий, сохраненное с помощью количественной ПЦР гена 16S рРНК в файлах самок w18 из разных указанных групп.

(DF) Было выполнено секвенирование комменсального бактериального гена 16S рРНК. Были проанализированы и представлены пропорции бактериальных таксонов (D), тепловая карта основных микробных таксонов (F) и относительная численность гаммапротеобактерий (F).

Рисунок 2. Продолжение

(G и H) Кишечники вырезали у указанных самок мух, получавших 2,5 мг/мл TF или без TF в качестве контроля в возрасте 10 и 40 дней. Изображения слайдов средней кишки были получены с помощью флуоресцентной микроскопии для сигналов GFP (G). Статистический анализ, показывающий процент GFP-положительных клеток, показан на (H).

(I) Кишки от указанных самок мух были собраны и подвергнуты анализу иммунного окрашивания с использованием антител против фосфорилированного гистона 3 (pH3). Были проанализированы и представлены статистические результаты количественного определения pH3-положительных клеток в кишечнике. В B, C, H и данные анализируются с помощью двустороннего критерия Стьюдента и представлены как средние значения ± SEM.NS, незначимо,*p<><0.001. see="" also="" figure="">

Известно, что ETF имеют горький вкус, а горькие продукты обычно избегаются как потребителями, включая плодовых мушек, так и млекопитающих (Yamazaki et al., 2014; Yang et al., 2018). Затем мы попытались выяснить, могут ли ТФ влиять на потребление пищи дрозофилами, поскольку предыдущие исследования доказали, что диетические ограничения приводят к увеличению продолжительности жизни как у позвоночных, так и у беспозвоночных (Hudry et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Moger-Reischer et al. ., 2020). Для этого мы сначала выполнили анализ кафе, широко используемый подход для прямого и точного измерения скорости кормления с использованием капиллярного питателя, содержащего жидкую среду, как описано ранее (Ja et al., 2007). Как показано на рисунках 1C и S1C, пищевые добавки TF (1 мг/мл и 2,5 мг/мл соответственно) почти не изменили потребление пищи подопытными мухами. Чтобы еще раз подтвердить это, мы затем использовали флуоресцеин в качестве пищевого индикатора (Rera et al., 2012; Wang et al., 2005) и провели анализ естественного питания (Danilov et al., 2015). Как показано на рисунках 1D и S1D, нам не удалось обнаружить каких-либо корреляций между добавками ТФ и уровнями потребления пищи. Взятые вместе, наши результаты показали, что полезная роль TF в увеличении продолжительности жизни может быть не связана с диетическими ограничениями у дрозофилы.

Дополнительные ТФ необязательны для воздействия на энергетический гомеостаз дрозофилы.

Было высказано предположение, что полифенолы черного чая оказывают положительное влияние на предотвращение ожирения, ингибируя переваривание, всасывание и потребление липидов и сахаридов, тем самым снижая потребление калорий (Cameron et al., 2008). Затем мы попытались выяснить, связано ли регулируемое ТФ увеличение продолжительности жизни LDrosophila с изменениями в поглощении питательных веществ и накоплении энергии. Для этого мы сначала изучили уровни триацилглицеридов (ТАГ), одного из наиболее часто обнаруживаемых липидных метаболитов (Tennessen et al., 2014), у самок мух на протяжении всей их жизни, как описано ранее (Fan et al., 2017).купить цистанхеКак показано на рисунке 1E, обработка TF практически не повлияла на общее содержание TAG в разные возрастные периоды. Когда мы дополнительно определили содержание гликогена и количество циркулирующих углеводов (глюкозы и трегалозы) с помощью набора Hexokinase (Li et al., 2018; Ten-nessen et al., 2014), результаты показали, что не было очевидных изменений между образцами с или без обработки ТФ (рис. 1F-1H). Следует отметить, что последовательные результаты были получены при изучении метаболических фенотипов с использованием самцов w118 в качестве животных моделей (рис. S1E-S1H). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что диетические добавки TF необходимы для регуляции углеводного и энергетического гомеостаза на протяжении всей жизни дрозофилы.

Далее мы исследовали кинетику естественного старения дрозофилы при вмешательстве пищевых ТФ, выполнив тесты быстрого итеративного отрицательного геотаксиса (RING), как описано ранее (Dilliane et al., 2017; Staats et al., 2018). Как показано на рисунках 1l, 1J, S1l и S1J, индексы лазания в возрасте (40 дней) w1118 (как самок, так и самцов) в группах, получавших добавки TF, были заметно улучшены (почти 12-процентное увеличение у самок и почти 18-процентное повышение у самцов). ) по сравнению с контрольными группами, что позволяет предположить, что TF потенциально улучшают лазание дрозофилы и двигательную активность.

Теафлавины предотвращают возрастную несостоятельность кишечника и дисбактериоз микробиоты

Предыдущие исследования показали, что двигательная активность и продолжительность жизни плодовых мушек тесно связаны с состоянием здоровья хозяина, таким как пол, диета, возраст и генотип (Caruso et al., 2013; Heintz and Mair, 2014). Недавно несколько линий доказательств доказали, что сохранение кишечного сигнального гомеостаза Imd улучшает целостность кишечника, предотвращая чрезмерную пролиферацию ISC и клеток-предшественников, а также задерживая возрастную дисфункцию кишечного эпителия, что, в свою очередь, положительно влияет на здоровье организма (Clark et al. , 2015; Го и др., 2014). У дрозофилы сокращение продолжительности жизни тесно связано с дисфункцией кишечного эпителиального барьера, и развитие целостности этого барьера в процессе старения приводит к увеличению продолжительности жизни (Clark et al., 2015; Guoet al., 2014; Jet al., 2019). Таким образом, мы стремились определить, изменяют ли TF целостность кишечника, выполняя анализ Smurf, метод, который был описан ранее (Clark et al., 2015; Rera et al., 2011). Как показано на рисунке 2A, тестированные плодовые мушки, у которых синие красители были ограничены пищеварительным трактом, были названы не-смурфами (левая панель на рисунке 2A). Если бы наблюдались синие красители

Рисунок 3. Продолжение

(EG) Кишки были выделены из файлов самок w1118, получавших 2,5 мг/мл TF или без TF в качестве базального в возрасте 10 дней, 30 дней, 40 дней и 50 дней, соответственно. Суммарную РНК экстрагировали и подвергали анализу ОТ-ПЦР. Были проанализированы и показаны уровни экспрессии мРНК диптерицина (F), аттацина (F) и цекропина A1(G). В EG данные анализируются с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента и показаны как среднее значение ± SEM.NS, не значимо, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

просачиваясь из кишок в брюшную полость, хозяева считались смурфами (правая панель на рис. 2А). В соответствии с предыдущими выводами (Кларк и др., 2015), доля смурфов постепенно увеличивалась с возрастом (рис. 2В). Интересно, что доля взрослых смурфов значительно снизилась в группах, получавших TF, по сравнению с контрольной группой того же возраста у обеих самок (с 8,2 до 3,7 процента, с 19,4 до 15,6 процента и с 35,4 до 27,1 процента для групп). в возрасте 30 дней, 40 дней и 50 дней, соответственно, рисунок 2B) и взрослых мужчин (с 2,7 процента до 0,9 процента, с 6,9 процента до 0,9 процента и с 8,3 процента до 2,7 процента в возрасте 30 лет). дней, 40 дней и 50 дней соответственно, рисунок S2A), что указывает на то, что ТФ могут предотвращать дисфункцию кишечного барьера у старых плодовых мушек. Следует отметить, что мы наблюдали большее снижение доли смурфов у самцов (снижение почти на 65,8%, 86,9% и 67,4% в возрасте 30 дней, 40 дней и 50 дней соответственно), чем у мужчин в возрасте - совпадающие самки (уменьшение почти на 54,1%, 19,5% и 23,3% в возрасте 30 дней, 40 дней и 50 дней соответственно), подразумевая, что ТФ могут играть более важную роль в снижении кишечной несостоятельности у самцов мух.

Предыдущие исследования показали, что возрастная дисфункция кишечного барьера часто коррелирует с дисбактериозом микробиоты кишечника (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014). Таким образом, мы исследовали кишечный комменсальный бактериальный состав после добавления ТФ. Сначала мы использовали универсальные праймеры и провели количественные эксперименты с ПЦР для количественной оценки уровней бактериального гена 16S рРНК. Как показано на рисунке 2C, в возрастных срезах общая бактериальная популяция в группах вмешательства с ТФ показала поразительное снижение (почти 45 процентов -55 процентов) по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить, что добавление ТФ, вероятно, предотвращает расширение микробиоты во время старения. . Затем мы провели метагеномику, чтобы подробно изучить изменения в кишечном микробном сообществе, вызванные добавлением пищевых добавок с ТФ. Как показано на рисунках 2D-2F, доля гаммапротеобактерий, размножение которых, как было установлено, тесно связано с нарушением кишечного барьера (Clark et al., 2015), очевидно, уменьшалась при добавлении ТФ в старый кишечник ( снижение почти на 7%), подразумевая, что ТФ положительно способствуют гомеостазу кишечной микробиоты во время старения у дрозофилы.

Теафлавины улучшают пролиферативный гомеостаз кишечника у дрозофилы

We further examined the intestinal integrity of flies that were treated with or without TFs. First, we employed the widely-used P{Esg-Gal4}/P{Uasp-GFP};{Tub-Gal80*s}strain(referred to as esgts>GFP), в котором стволовые клетки кишечника (ISC) и клетки-предшественники были помечены GFP. Как показано на рисунках 2G и 2H, количество GFP-позитивных клеток в группах вмешательства TF в возрасте 40 дней (было подсчитано 20 кишок) было намного меньше (почти 29,7 процента), чем в контрольной группе того же возраста (почти 47,6 процента и было подсчитано 19 кишок), что позволяет предположить, что ТФ могут ингибировать возрастную гиперпролиферацию ИСК. Кроме того, мы провели эксперименты по иммуноокрашиванию с использованием антител против фосфогистона 3 (pH3), специфического маркера митотических клеток в тканях кишечника. Мы наблюдали меньше pH3-положительных клеток в кишечнике пожилых взрослых, получавших ТФ (среднее число 20,6), чем у контрольной группы (среднее число 39,5, рис. 2). В совокупности наши результаты показывают, что пищевые добавки с ТФ улучшают пролиферативный гомеостаз кишечника и предотвращают возрастную дисплазию микробиоты, тем самым замедляя старение у дрозофилы.

Теафлавины отрицательно модулируют кишечные сигналы Imd

Чтобы изучить лежащие в основе молекулярные механизмы, с помощью которых TF положительно влияют на гомеостаз кишечника дрозофилы, мы провели анализ РНК-seq с использованием образцов кишечника взрослых самок w1118 соответствующего возраста, получавших лечение с TF или без него. Фрагменты на тысячу оснований на миллион (FPKM) показали, что общие паттерны экспрессии генов были одинаковыми между двумя экспериментальными группами (рис. 3A). Однако дальнейший анализ дифференциальной экспрессии выявил в общей сложности 229 дифференциально экспрессируемых генов, из которых 99 активировались, а 126 подавлялись (рис. 3В). Интересно, что анализ генной онтологии этих генов показал, что путь иммунного ответа был сильно изменен при добавлении пищевых добавок с TF (рис. 3C).

Было доказано, что у дрозофилы врожденные иммунные сигнальные пути играют доминирующую роль в регуляции возрастного гомеостаза кишечника и долголетия (Clark et al, 2015; Guo et al, 2014). Затем мы сосредоточились на изучении паттернов экспрессии антимикробных пептидов (АМП) ниже сигналов врожденного иммунитета. Как показано

Рисунок 4. Продолжение

(D) Очищенные белки Imd инкубировали с различными концентрациями TF (50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ соответственно) при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем образцы подвергали спектральному анализу флуоресцентного излучения с использованием указанных длин волн (возбуждение при 430 нм, излучение от 450 до 550 нм с шириной щели 5 нм). Образец без ТФ использовали в качестве базового контроля.

（E and F）Lysates of guts from NP11>Мух Myc-Imd готовили и инкубировали с ТФ (100 мкМ) при комнатной температуре в течение 30 мин. Анализы SDD-AGE (верхняя панель на E) и SDS-PAGE (нижняя панель на E) были выполнены для анализа агрегатов белка Imd. В качестве контроля загрузки использовали тубулин.цистанхБыл проведен денситометрический анализ для количественного определения конденсата Imd в различных образцах, и результаты показаны на (F). (G) репрезентативная хроматограмма образца TF.

(H и I) Очищенные белки Flag-Imd инкубировали с TF, TF1, TF2a, TF2b или TF3 (100 мкМ для каждого образца) или с равным объемом буфера (контроль) при комнатной температуре в течение 30 минут, как указано. Затем образцы подвергали анализам SDD-AGE (верхняя панель в H) и SDS-PAGE (нижняя панель в H) для определения характера агрегации Imd. Был проведен денситометрический анализ для количественного определения конденсата Imd в различных образцах, показанный на (). В C, F и I данные проанализированы с помощью двустороннего критерия Стьюдента и показаны как средние значения ± SEM.***p< 0.001.="" see="" also="" figure="">

на рисунке 3D гены AMP, регулируемые путем иммунодефицита (Imd), включая диптерицин A (DptA), диптерицин B (DptB), аттацин A (AttA), цекропин A1 (CecA1), цекропин A2 (CecA2) и цекропин С (Cece) были значительно снижены (на 39,4%, 72,3%, 10,5%, 86,5%, 99,8% и 36,1% соответственно) в группах, получавших ТФ, по сравнению с контрольными группами. Для дальнейшего подтверждения результатов, полученных в результате анализа РНК-секвенций, мы провели количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (gRT-PCR) для количественной оценки относительных уровней экспрессии генов AMP, связанных с Imd, в образцах кишечника дрозофилы, полученных в четырех разных возрастных точках. включая 10 дней, 30 дней, 40 дней и 50 дней. Как показано на рисунках 3E-3G, уровни экспрессии мРНК некоторых генов, включая диптерицин, аттацин и цекропин A1, были значительно снижены (почти на 35,9 процента -66,6 процента) у получавших ТФ старые кишки. В совокупности наши данные показали, что ТФ потенциально противодействуют активации сигнального пути Imd в клетках кишечника дрозофилы во время старения.

Теафлавины незаменимы для регуляции транскрипции пути Imd или убиквитинирования Imd.

Мы стремились изучить связь между TF и ​​Imd и провели анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано ранее (Lan et al., 2020). Как показано на рисунке 4А. TF проявляли умеренную аффинность связывания с очищенным белком Imd при расчетной константе Kp 8,078 мкМ. Затем мы стремимся определить, как TF контролируют кишечный сигнальный путь Imd. Основываясь на результатах анализа транскриптома данных РНК-секвенирования, мы обнаружили, что уровни экспрессии ключевых регуляторных факторов в сигнальном пути Imd, таких как PGRP-LC, Imd и Relish, практически не изменялись при обработке ТФ (рис. S3A). ). Кроме того, мы собрали образцы кишечника мух, которые получали пищевые добавки с TF или без них в разном возрасте, и провели эксперименты qRT-PCR для специфического выявления паттернов экспрессии этих генов. Как показано на рисунке S3B, уровни мРНК некоторых генов, включая effete, faded, tak1, pgrp-Ica, uev1a, Bendless, Relish, imd, pgrp-sc2, tab2, ird5 Kenny и diap2, были одинаковыми в контрольных группах. и группы вмешательства TF, предполагая, что TF не участвуют в регуляции сигналов Imd на уровне транскрипции.

Затем мы изучили профили убиквитинирования Imd, поскольку предыдущие исследования показали, что убиквитинирование Imd необходимо для нижестоящей передачи сигнала в пути Imd (Myllymaki et al., 2014; Zhou et al., 2005). Сначала мы провели анализ сдвига E1 ​​in vitro и обнаружили, что обработка TF не оказывает явного влияния на ферментативные реакции E1 и убиквитина с образованием конъюгированного E1/Ub (рис. S4A). Кроме того, мы трансфицировали клетки дрозофилы S2 плазмидами, экспрессирующими Imd, меченный Flag, вместе с Ub, меченным HA, а затем обрабатывали клетки с TF или без них. Дальнейшие анализы убиквитинирования показали, что добавление ТФ практически не влияло на уровни убиквитинированного Imd в культивируемых клетках (рис. S4B и S4C). Чтобы определить взаимосвязь между ТФ и убиквитинированием Imd in vivo, мы использовали трансгенную муху P {NP1-Gal4}/P{Uasp-Myc-Imd}; P{Tub-Gal80*} (обозначаемую как NP1*). s> Myc-Imd), в котором белок Imd, меченный Myc, был высоко экспрессирован в клетках кишечника (рис. S4D). Наши эксперименты по убиквитинированию показали, что пищевые добавки с TF не нужны для модулирования убиквитинирования Imd в тканях кишечника (рисунки S4D и S4E). В совокупности наши результаты показали, что TF отрицательно управляют сигналами Imd дрозофилы, не влияя на паттерн убиквитинирования Imd.

Теафлавины предотвращают образование конденсата Imd

Недавнее исследование показало, что агрегация Imd важна для активации нижестоящих генов в пути Imd (Kleino et al., 2017). Затем мы попытались выяснить, регулируют ли ТФ процесс

Рисунок 5. Продолжение

(F и G) Самки w18 (обозначаемые как imd plus/plus), гетерозиготные и гомозиготные мутанты imd' (обозначаемые как imd plus/- и imd-/- соответственно) выращивались на стандартных кормах для дрозофилы (обозначаемых как Basal) или пищевые добавки с 2,5 мг/мл (называемые ТФ), а затем подвергали анализу продолжительности жизни. Кривая выживания (F) и средняя продолжительность жизни (G) были проанализированы и показаны.

В и F для статистического анализа использовали тест Log Rank. В BE и для статистического анализа использовали двусторонний t-критерий Стьюдента, и данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. NS, не имеет значения, *p<0.05, **p="" <="" 0.01,=""><0.001. see="" also="" figure="">

Имд агрегатное образование. Во-первых, мы очистили меченные Myc белки Imd из культивируемых клеток S2 и инкубировали белки с различными концентрациями TF (рис. 4B). Интересно, что мы обнаружили, что TF заметно предотвращали агрегацию Imd (уменьшение на 81,7% -89,7%, рисунки 4B и 4C), что подтверждается нашими анализами электрофореза в агарозном геле с полуденатурирующим детергентом (SDD-AGE). Чтобы подтвердить этот вывод, мы дополнительно провели анализы связывания тиофлавина-Т и получили согласованные результаты (рис. 4D). Наконец, мы вырастили трансгенных мух NP1ts > Myc-Imd, которые получали пищевые добавки с TF или без них, и собрали образцы кишечника взрослых взрослых особей. Эксперименты SDD-AGE показали, что агрегация Imd в значительной степени подавлялась TF в клетках кишечника (снижалась на 16,7% -22 процентов, рисунки 4E и 4F).

Чтобы определить, как ТФ способствуют контролированию сборки конденсата Imd, мы подвергли ТФ ВЭЖХ-анализу и обнаружили, что они в основном содержат четыре типа мономеров (рис. 4G), а именно теафлавин (TF1), теафлавин 3-O-галлат ( TF2a), теафлавин-3'-O-галлат (TF2b) и теафлавин-3,3'-ди-O-галлат (TF3), что согласуется с предыдущими отчетами (Li et al., 2013; Takemoto and Takemoto, 2018). . Затем мы инкубировали каждое из этих химических веществ с очищенным Imdprotein и проводили эксперименты SDD-AGE. Как показано на рисунках 4H и 4l, обработка всех этих мономеров TF привела к заметному снижению (на 59,5%, 60,9%, 58,4%, 58,2% и 55,8% для TF, TF1, TF2a, TF2b и TF3 соответственно) совокупные уровни Imd. В совокупности наши результаты показали, что TF негативно регулируют сигнальный путь Imd дрозофилы, вероятно, путем контроля поведения конденсатов Imd.

Теафлавины увеличивают продолжительность жизни дрозофилы в зависимости от Imd.

To examine whether TFs prolong Drosophila lifespan depending on their regulatory role in Imd, we specifically knocked down Imd in gut tissues using the transgenic flies P{NP1-gal4)PITub-gal80*}/P{Uasp-imd-IR(KK)} (referred to as Imd RNAi). As shown in Figures 5A and 5B, dietary supplementation of TFs extended the lifespan of controls (elevation of nearly 7.2 days in the mean lifespan), whereas prevention of Imd expression in guts apparently reversed the lifespan extension caused by TFs. Consistent results were obtained when we utilized male Imd RNAi and control flies to perform lifespan assays (Figures S5A and S5B). Further qRT-PCR assays showed that the mRNA expression levels of AMP genes at ages of 10 days, 30 days, 40 days, and 50 days, including diptericin, attacin, and cecropin A1.hardly changed in the gut tissues of Imd RNAi flies(Figures 5C-5E), whereas additional TFs caused reductions of 31%-72.3% in mRNA abundances of these genes in samples from control groups. To confirm these results from Imd RNAi flies, we first performed lifespan assays using w18(control, referred to as imd+/+), imd' heterozygous (referred to as imd+/-), and homozygous(referred as imd-/-)mutant flies. We found that TFs addition extended lifespan and increased mean life longevity of imd+/-flies (elevation of nearly 6.2 days, Figures 5F and 5G). However, this lifespan extension effect by TFs was almost abolished in imd-/-flies (Figures 5F and 5G). Next, we performed lifespan assays utilizing Relish RNAi(NP1's>Relish RNAi and control(NP1ts>плюс) летает. потому что Relish является ключевым фактором транскрипции, ответственным за экспрессию генов AMP ниже Imd (Myllymaki et al., 2014). Как показано на Fiqures S5C и S5D. Добавление в рацион TF заметно увеличивало продолжительность жизни контрольных мух, и это увеличение продолжительности жизни было значительно предотвращено у мух Relish RNAi. В совокупности наши данные показали, что пищевые добавки TF положительно влияют на продолжительность жизни дрозофилы, вероятно, в зависимости от кишечных сигналов Imd.

Чтобы увидеть, происходит ли увеличение продолжительности жизни с помощью TF в аксеническом фоне, мы провели анализы продолжительности жизни с использованием самок w1118 в аксенических условиях. Как показано на рисунках S5E и S5F, добавление различных концентраций ТФ (1 мг/мл и 2,5 мг/мл) почти не повлияло на соотношение смертности и средней продолжительности жизни у взрослых в возрасте до 18 лет. Поскольку аксенические условия выращивания могут в значительной степени предотвращать обильную микробиоту, тем самым ограничивая сигналы Imd в разрезах (Clarke al., 2015), наши данные предполагают, что TF продлевают продолжительность жизни дрозофилы за счет модуляции врожденных иммунных сигналов, регулируемых кишечной микробиотой.

Рисунок 6. Теафлавины облегчают индуцированный DSS колит у мышей CD-1.

(A) Лечение ТФ не влияло на потребление воды в различных группах мышей CD-1.

(BD) Введение через зонд различных концентраций TF (1 мг/мл, 2,5 мг/мл и 5 мг/мл, соответственно) уменьшало укорочение толстой кишки и увеличение селезенки, вызванное DSS, у мышей CD-1. Были показаны репрезентативные изображения (B) и статистический анализ толстой кишки (C) и селезенки (D). (E) Введение различных концентраций ТФ (1 мг/мл, 2,5 мг/мл и 5 мг/мл соответственно) предотвращало несостоятельность кишечника, вызванную DSS, у мышей CD-1. (F и G) Колонки собирали у указанных групп мышей. Тотальную РНК экстрагировали и подвергали анализу qRT-PCR для определения уровней экспрессии мРНК TNFa(F) и IL-6 (G).

(HL) Колонки от различных групп мышей собирали в продольном направлении и подвергали анализу окрашивания HE. Образцы были исследованы под микроскопом, и были получены и показаны репрезентативные изображения указанных образцов (HL). Шкала баров, 40 мкм. (M-Q') СЭМ-изображения, показывающие микротрихомы толстой кишки из разных указанных образцов. Масштабные линейки, 50 мкм (MQ) и 4 мкм (M'-Q').

В CG данные анализируются по двустороннему критерию Стьюдента и отображаются как среднее ± SEM.NS, не значимо, *p<><><0.001. see="" also="" figure="">

Теафлавины облегчают колит, вызванный DSS, у мышей CD-1

Для дальнейшего изучения потенциальной роли TF в поддержании гомеостаза кишечника у млекопитающих мышей CD-1 использовали для индукции колита с помощью декстрансульфата натрия (DSS). Мышам внутрижелудочно вводили различные концентрации ТФ (1 г/л, 2,5 г/л или 5 а/л) или воду в качестве контроля в течение четырех недель с последующим лечением 2-процентным DSS в питьевой воде в течение 7 дней. Чтобы увидеть, влияют ли TF на количество выпитого DSSa в разных группах мышей, мы ежедневно наблюдали за потреблением мышами алкоголя. Как показано в Fiqure6A, лечение TF не влияет на потребление напитков у мышей с индуцированным DSS колитом, у мышей, получавших DSS, развился синдром колита с диареей и/или гематохезией, которые были предотвращены дозозависимым лечением TF (рис. S6A-S6E).цистанчеКроме того, вмешательство с ТФ спасло сокращение длины толстой кишки, вызванное DSS, и уменьшило увеличение селезенки (рис. 6B-6D).

Затем мы использовали декстран-4000-FITC (FITC-DX) для изучения барьерной функции кишечника у этих мышей. Как показано на рисунке 6E, у мышей из групп, получавших DSS, наблюдалась высокая концентрация FITC-DX в образцах крови, что указывает на несостоятельность кишечника у этих животных. Однако вмешательство с TF значительно предотвращало транспорт FITC-DX из органов пищеварения в система кровообращения (уменьшение на 56,1 процента -77,5 процента, рисунок 6E). Примечательно, что введение ТФ не изменяло проницаемость кишечника мышей в нормальных условиях (рис. S6F). Поскольку воспаление играет ключевую роль в развитии колита на мышиной модели, мы дополнительно провели эксперименты с qRT-PCR, показав, что лечение TF значительно снижает экспрессию IL -6 и TNF в кишечнике мышей, получавших DSS (рис. 6F и 6G).

Для дальнейшего анализа патологических изменений в толстой кишке мы провели анализ окрашивания гематоксилин-эозином (HE). Как показано на рисунках 6H-6L и S6G-S6J, серьезное повреждение эпителия, вызванное DSS, заметно уменьшалось при лечении TF дозозависимым образом. Сканирующая электронная микроскопия этих образцов кишечника также дала согласованные результаты (рис. 6M-6Q' и S6K-S6N'). В совокупности наши результаты показали, что TF играют полезную роль в защите функции кишечного барьера как у насекомых, так и у млекопитающих.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы исследовали физиологические функции ТФ в модулировании кишечного гомеостаза и долголетия, а также лежащие в их основе молекулярные механизмы. Мы показали, что пищевые добавки с ТФ положительно способствуют профилактике возрастного дисбиоза кишечной микробиоты и замедлению дисфункции кишечного эпителия, тем самым увеличивая продолжительность жизни дрозофилы. Наши механистические исследования in vitro и in vivo показали, что TF, вероятно, играют негативную роль в контроле пути передачи сигналов Imd, блокируя слияние Imd. Более того, мы обнаружили, что колит, вызванный DSS, можно эффективно облегчить добавлением TF у мышей CD-1. Наши результаты подтверждают мнение о том, что ТФ выгодно способствуют гомеостазу кишечника как у беспозвоночных, так и у позвоночных.

Пищевые добавки с теафлавинами продлевают жизнь дрозофилы

Потребление чая популярно во всем мире и уступает только потреблению воды (Rothenberg and Zhang, 2019). Многочисленные исследования были сосредоточены на физиологических функциях, часто с использованием как экспериментальных, так и клинических подходов (Cameron et al., 2008; Niu et al., 2013; Peng et al., 2009; Rothenberg and Zhang. 2019; Spindleret al., 2013; Takemoto). и Takemoto, 2018; Unno et al., 2020; Zhou et al., 2020. Было широко показано, что чай приносит пользу здоровью за счет снижения уровня липидов и за счет эффектов против ожирения, а основными функциональными соединениями в чае являются катехины, особенно галлат эпигаллокатехина (EGCG) (Abbas and Wink, 2009; Modernelli et al., 2015; Niu et al., 2013; Wagner et al., 2015; Xiong et al., 2018). Предыдущие исследования также показали, что зеленый чай и черный чай может увеличить продолжительность жизни и здоровья плодовых мушек (Site al., 2011; Wagner et al., 2015), червей (Fei et al., 2017; Xiong et al., 2018) и крыс (Imran et al., 2018). .,2018; Niu et al.2013), а основным регуляторным механизмом является эффективное предотвращение окислительного стресса с помощью EGCG посредством модуляции сигналов АФК.преимущества цистанхе,Однако остается неизвестным, играют ли ТФ как характерные «золотые» соединения черного чая роль в регуляции старения и продолжительности жизни. Это исследование предоставляет убедительные доказательства, свидетельствующие о том, что вмешательство TF необязательно для воздействия на потребление пищи, а долгосрочное поглощение TF с пищей значительно увеличивает продолжительность жизни как самцов, так и самок плодовых мушек. Эти результаты служат руководством для дальнейших исследований функций TFs в долголетии млекопитающих.

Теафлавины улучшают возрастной дисбактериоз микробиоты и способствуют гомеостазу кишечника. Прогрессирующий дисбаланс пролиферативного гомеостаза и регенеративной способности является отличительной чертой старения и возрастных заболеваний (Clark et al., 2015; Heintz and Mair, 2014; Maynard and Weinkove, 2018; Rera). и др., 2012). Хроническое воспаление связано с потерей гомеостаза и увеличением заболеваемости раком у стареющих организмов (Bartke et al., 2019; Kapahi et al., 2017; Xiao et al., 2020). Это особенно важно для барьерного эпителия, такого как кишечный эпителий (Guo et al., 2014; Maynard and Weinkove, 2018). С помощью модели развития возрастной дисплазии в стареющем кишечнике мы продемонстрировали, что улучшение взаимодействий хозяина и комменсала в эпителии стареющего барьера может способствовать здоровью и продолжительности жизни. Мы использовали ряд неинвазивных подходов для оценки функции кишечника и динамики микробиоты при старении. Во-первых, анализ Smurf показал положительную роль TF в регуляции дисфункции эпителиального барьера при старении. Затем анализ иммуноокрашивания с использованием нескольких трансгенных мух показал, что TF задерживают чрезмерную пролиферацию ISCs и оборот дифференцированных клеток. Наконец, секвенирование микробиома показало, что TF подавляют возрастную экспансию кишечной комменсальной микрофлоры. Эти результаты убедительно показали, что TF играют ключевую роль в замедлении процесса старения хозяина за счет поддержания гомеостаза кишечника.

Теафлавины смягчают чрезмерные иммунные реакции в кишечнике, негативно регулируя передачу сигналов Imd.

Было высказано предположение, что необходимо поддерживать тонкий баланс между иммунной функцией кишечника и микробиотой, чтобы обеспечить долгосрочный гомеостаз барьерного эпителия (Guo et al., 2014; Maynard and Weinkove, 2018). Предыдущие исследования также показали, что хроническое чрезмерное воспаление в кишечнике связано с возрастной дисфункцией барьерного эпителия и является признаком старения (Clark et al., 2015; Guo et al., 2014; Ji et al., 2019). . Таким образом, поддержание здоровой комменсальной популяции за счет сохранения врожденного иммунного гомеостаза в таких эпителиях является многообещающим подходом к укреплению здоровья и долголетия (Bonfini et al., 2016; Broderick, 2016; Clark et al., 2015). Чтобы изучить молекулярные механизмы с помощью какие ТФ задерживают старение, мы провели анализ секвенирования РНК, используя рассеченный кишечник с обработкой ТФ или без нее. Наши данные свидетельствуют о том, что группа генов с высокой экспрессией в кишечнике контрольных плодовых мушек по сравнению с таковой у животных, получавших ТФ, была обогащена генами, классифицируемыми как гены «иммунного ответа». Дальнейший биоинформационный анализ и анализы get-PCR показали, что экспрессия генов AMP, связанных с Imd, резко ингибируется добавлением в рацион TF. Результаты экспериментов на мышах CD-1 с использованием DSS для индукции аномальных иммунных ответов в кишечнике дополнительно подтвердили представление о том, что TF действуют как защитники от воспаления кишечника.

Теафлавины подавляют сигналы, определяя амилоидную сборку Imd.

Как ТФ отрицательно регулируют сигнальный путь Imd? На основании результатов транскриптомного анализа мы обнаружили, что ТФ незаменимы для регуляции транскрипции ключевых факторов сигнального пути Imd. Интересно, что мы наблюдали очевидную аффинность связывания TF с очищенным белком Imd с помощью анализа SPR, что предполагает вероятность того, что TF могут играть роль в контроле поведения белка Imd или процесса его посттрансляционной модификации. Предыдущие исследования подчеркивали ключевую роль убиквитинирования в передаче сигнала Imd (Kleino and Silverman, 2014; Myllymaki et al., 2014), а предотвращение убиквитинирования Imd приводит к полному отключению передачи сигналов Imd (Myllymaki et al., 2014; Thevenon и др., 2009). Однако наши анализы убиквитинирования in vitro и in vitro показали, что ТФ почти не влияют на характер убиквитинирования Imd. Недавнее исследование показало, что образование амилоида необходимо для активации пути IMD дрозофилы при распознавании бактериальных пептидогликанов (Kleino et al., 2017). Интересно, что наши анализы SDD-AGE и связывания ThT показали, что слияние Imd предотвращается TF. Предотвращение агрегации Imd путем нокдауна или мутации Imd в клетках кишечника, по-видимому, обращало вспять благотворное влияние TF на увеличение продолжительности жизни. Чтобы еще раз подтвердить наши выводы, было бы интересно изучить, не являются ли TF более функциональными для увеличения продолжительности жизни у плодовых летунов, когда консервативный криптический мотив RHIM (cRHIM, аминокислоты от 118-го до 121-го) Imd специфически нокаутируется разрушенным, на основании того, что преступление в Imd необходимо для его агрегации и образования амилоида (Kleino et al., 2017). Тем не менее, наше исследование подчеркивает ключевую роль TF в контроле кишечного гомеостаза и процесса старения, возможно, посредством модуляции слияния Imd. Будущие исследования должны быть сосредоточены на изучении того, какие остатки или области Imd связаны с TF и ​​как это связывание приводит к предотвращению конденсации Imd. Более того, наши находки в системе млекопитающих показали, что TF могут эффективно защищать толстую кишку от воспаления, вызванного экзогенным ядовитым химическим DSS, что указывает на консервативную регулирующую роль TF в поддержании гомеостаза кишечника. Стоит исследовать, играют ли TF роль в управлении сборкой белков в тканях млекопитающих.

Эта статья взята из zhongwenxie@ahau.edu.cn