Общее количество гликозидов из стеблей Cistanche Tubulosa облегчает депрессивное поведение: двунаправленное взаимодействие фитохимических веществ и кишечной микробиоты

для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Ли Фань и др.

АННОТАЦИЯ

Фон: Как наиболее часто используемое в традиционной китайской медицине тонизирующее почки растение, высушенные сочные стеблиЦистанхетрубчатый(Schenk) Wight (CT) доказали свою эффективность при лечении депрессии. Однако компоненты антидепрессантов и их основной механизм остаются неясными.

Цель: изучить активные компоненты CT(Цистанхетрубчатый)против депрессии, а также потенциальные механизмы. Дизайн и методы исследования. Для оценки антидепрессивной активности полисахаридов, олигосахаридов и различных обогащенных гликозидами фракций, выделенных из CT, а также типичных метаболитов кишечной микробиоты, включая 3-гидроксифенилпропионовую кислоту ({{2), использовались поведенческие тесты отчаяния. }}HPP) и гидрокситирозол (HT). Кроме того, влияние биоактивных фракций и метаболитов на модели хронического непредсказуемого легкого стресса (CUMS) было изучено с помощью многочисленных фармакодинамических и биохимических анализов. Изменения гистологии толстой кишки и кишечного барьера наблюдали с помощью окрашивания и иммуногистохимического анализа. Микробные особенности кишечника и метаболизм триптофана-кинуренина исследовали с помощью секвенирования 16S рРНК и вестерн-блоттинга соответственно.

Полученные результаты: Общийгликозиды(ТГ) значительно облегчал депрессивное поведение по сравнению с другими разделенными фракциями, отражая синергетические эффекты фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов на гиперактивацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (ГГН) оси, тяжелое нейро- и периферическое воспаление и недостаточность в 5-гидрокситриптамине (5-HT) и мозговом нейротрофическом факторе в гиппокампе. Более того, ТГ(общие гликозиды)смягчал слабое воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера, а обилие нескольких родов бактерий сильно коррелировало с осью HPA и воспалением у крыс CUMS. Соответственно, экспрессия индоламин-2, 3-диоксигеназы 1 (IDO1) в толстой кишке была значительно снижена после ТГ.(общие гликозиды)прием, сопровождающийся подавлением триптофан-кинуренинового обмена. С другой стороны, ГТ также оказывала заметный антидепрессивный эффект за счет улучшения функции оси HPA, высвобождения провоспалительных цитокинов и метаболизма триптофана-кинуренина, в то время как она не могла в значительной степени регулировать нарушенную микробиоту кишечника так же, как ТГ. Удивительно, но превосходящие флуоксетин, ТГ и ГТ могут дополнительно улучшить дисфункцию гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и аномальный метаболизм циклических нуклеотидов.

Ключевые слова: Цистанхетрубчатый, общие гликозиды, гидрокситирозол, депрессия, микробиота кишечника

Нажмите, чтобы увидеть продукт cistanche Deserticola ma

Введение

Депрессия — это хроническое, повторяющееся и потенциально опасное для жизни психическое расстройство, которым страдает до 20 процентов населения во всем мире (Nabavi et al., 2017). В настоящее время, хотя многие антидепрессанты были одобрены, побочные эффекты вызывают беспокойство. Примечательно, что длительное лечение селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (СИОЗС), такими как флуоксетин, основным фармакологическим средством от депрессии, усугубляло такие проблемы, как хроническая сексуальная дисфункция (Bijlsma et al., 2014); это привлекло все большее внимание к открытию новых антидепрессантов из натуральных трав (Wang et al., 2019). В теории традиционной китайской медицины (ТКМ) дефицит почечного ян приводит к характеристикам производительности, аналогичным клиническим симптомам депрессии, таким как чувство подавленности, потеря интереса и сентиментальность (Yang et al., 2020), продвигая мысли для облегчения депрессивного поведения путем тонизирования Ян почек. Так совпало, что многие тонизирующие почки травы улучшают сексуальную функцию (Wu et al., 2015). Подобные исследования заставляют обратить внимание на потенциальное применениеЦистанхиХерба, который является наиболее часто используемым растением, тонизирующим почки, в традиционной китайской медицине и эффективен при лечении мужской сексуальной дисфункции (Wang et al., 2020) с точки зрения разработки антидепрессантов.ЦистанхиХерба, официально зарегистрированных как высушенные сочные стеблиЦистанхетрубчатый(Шренк) Уайт (Коннектикут) иЦистанхепустыня(YC Ma) в Китайской фармакопее (Wang et al., 2017) используется в Китае и других странах Восточной Азии с 15 века для лечения таких состояний, как недостаточность почек-ян, импотенция и женское бесплодие. Современные фармакологические исследования показывают, чтоЦистанхиHerba обладает множественными биологически активными свойствами, такими как повышение иммунитета, нейропротекция, антиоксидантное действие, омолаживающее действие и действие против усталости (Wang et al., 2017). Нейропротекторные свойстваЦистанхиHerba предполагает ее терапевтический потенциал при когнитивных заболеваниях, таких как инсульт, депрессия и болезнь Альцгеймера (Wang et al., 2020). В нашем предыдущем исследовании мы обнаружили, что КТ(Цистанхетрубчатый)Экстракт облегчал депрессивное поведение крыс с хроническим непредсказуемым легким стрессом (CUMS) (Li et al., 2018). На сегодняшний день химический анализ КТ(Цистанхетрубчатый)показали, что его основные составляющие включают фенилэтаноидные гликозиды, иридоидные гликозиды, полисахариды и олигосахариды (Jiang and Tu, 2009), однако тип соединения, который играет доминирующую роль в его антидепрессивном эффекте, остается неясным.

Многочисленные исследования подтвердили, что физиологическое действие кишечника (особенно комменсальной микробиоты) играет важную роль в развитии депрессии и может регулировать нейроэндокринную, вегетативную нервную и иммунную системы (Yang et al., 2020). Более того, взаимосвязь, связывающая метаболизм триптофана, кишечную микробиоту и депрессию, постепенно привлекала большое внимание. Измененная микробиота кишечника может активировать триптофан-кинурениновый путь, впоследствии снижая доступность триптофана в периферических и церебральных тканях, что приводит к дефициту 5-HT (Agus et al., 2018). Наше предыдущее исследование показало, что фенилэтаноидные гликозиды при ХТ(Цистанхетрубчатый)обычно обладают низкой биодоступностью и могут быстро метаболизироваться микробиотой кишечника в 3-гидроксифенилпропионовую кислоту (3-HPP) и гидрокситирозол (HT) (Li et al., 2016). Кроме того, КТ(Цистанхетрубчатый)Сообщалось, что экстракт восстанавливает гомеостаз микробиоты кишечника у крыс CUMS (Li et al., 2018). Основываясь на таких исследованиях, мы пришли к выводу, что двунаправленное взаимодействие фитохимических веществ и кишечной микробиоты может управлять антидепрессивным действием определенных биоактивных компонентов КТ.(Цистанхетрубчатый). В частности, соединения могут быть преобразованы в абсорбируемые метаболиты (такие как 3-HPP и HT) в желудочно-кишечном тракте кишечной микробиотой и впоследствии оказывать антидепрессивное действие. В свою очередь, структурные изменения кишечной микробиоты, вызванные биоактивными компонентами, могут одновременно играть жизненно важную роль в антидепрессивной активности.

Здесь, в нашем исследовании, мы использовали поведенческие тесты отчаяния для оценки антидепрессивной активности полисахаридов, олигосахаридов и различных обогащенных гликозидами фракций, выделенных из КТ.(Цистанхетрубчатый)водный экстракт (CTE) и типичные метаболиты микробиоты кишечника (включая 3-HPP и HT), что мы дополнительно подтвердили в модели хронического непредсказуемого легкого стресса (CUMS) с помощью нескольких фармакодинамических и биохимических анализов. Впоследствии мы исследовали, был ли его механизм против депрессии связан с двунаправленным взаимодействием фитохимических веществ и микробиоты кишечника.

Материалы и методы

Материалы

Все стандарты, используемые для химического анализа, были приобретены у Durst (Сычуань, Китай). 3-HPP, HT, флуоксетин и имипрамин были приобретены у Aladdin (Шанхай, Китай). Набор для количественного определения белка BCA был приобретен у Boster (Ухань, Китай). Компания Nanjing Jiancheng (Нанкин, Китай) предоставила 5-HT, BDNF, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-), интерлейкин-1бета (IL-1) и интерферон-гамма (IFN- ) наборы для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Наборы ИФА для кортикостерона (CORT), адренокортикотропного гормона (АКТГ) и кортикотропин-рилизинг-гормона (CRH) были приобретены у MultiSciences (Ханчжоу, Китай). Наборы ИФА для циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), тестостерона (Т) и гонадотропин-высвобождающего гормона (ГнРГ) были приобретены у Enzyme-linked Biotechnology (Шанхай, Китай). Наборы ELISA для триптофана и кинуренина были получены от Small Molecule Antibodies (Бордо, Франция). Первичные/вторичные антитела, включая zonula occludens 1 (ZO-1), индоламин 2, 3-диоксигеназу 1 (IDO1), -актин и HRP козий антикроличий IgG (H плюс L), были приобретены у Proteintech. (Ухань, Китай). Все остальные реактивы квалификации ч.д.а. или выше были получены от коммерческих поставщиков.

Приготовление различных фракций, отделенных от ХТЭ(Цистанхеэкстракт тубулозы)

КТ(Цистанхетрубчатый)был собран в ноябре 2015 г. в Хэтяне, Синьцзян, Китай, и подтвержден профессором Сяобо Ли. Образец ваучера (20151108) был депонирован в Фармацевтической школе Шанхайского университета Цзяо Тонг.

Измельченные образцы трижды экстрагировали дистиллированной водой (1:10, вес/объем) в течение 2 ч при 80~90 ◦C для получения КТР.(Цистанхеэкстракт тубулозы)(выход 57,1%). ХТЭ растворяли в дистиллированной воде, затем медленно перемешивали с этанолом (1:4, объем/объем) и выдерживали при 4°С в течение 24 часов. Затем осадок и супернатант собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Общие полисахариды (TP; выход 5,7%) получали промывкой 80%-ным этанолом и трехкратной депротеинизацией реактивом Сэвиджа из собранного осадка. Затем оставшийся супернатант хроматографировали на колонке с микропористой смолой D101 и элюировали дистиллированной водой и 40-процентным этанолом. Элюированная водная и 40-процентная этанольная фракции содержали суммарные олигосахариды (TO; выход 35,1 %).общийгликозиды(ТГ; выход 12,1%) соответственно. ТГ(общие гликозиды)затем снова элюировали дистиллированной водой и 5-, 10- и 40-процентным этанолом через микропористую смолу D101, а элюированные фракции 5-процентного и 40-процентного этанола представляли собой общие иридоидные гликозиды (TG-IrG; выход составлял 2,7 процента) и общие фенилэтаноидные гликозиды (ТГ-ФГ; выход 8,7%) соответственно.

Химический анализ

Во-первых, основные химические составляющие различных фракций, выделенных из КТР.(Цистанхеэкстракт тубулозы)были охарактеризованы с помощью UPLC-QTOF-MS. Во-вторых, относительное содержание общих углеводов и гликозидов определяли методом UV-Vis. В-третьих, основные компоненты (эхинакозид, вербаскозид, извербаскозид, 8-эпилогановая кислота и тенипозидная кислота) были количественно определены валидированным методом ВЭЖХ. Подробные параметры и проверка метода показаны в дополнительных материалах.

Эксперименты на животных

Конкретные графики экспериментов на животных показаны на рис. 1. Все экспериментальные животные были размещены и акклиматизированы в течение 1 недели до начала экспериментов в Центре лабораторных животных Шанхайского университета Цзяо Тонг (Шанхай, Китай) при контролируемой комнатной температуре (25 ± 2 ◦C; относительная влажность 55 ± 10 процентов) с циклом свет-темнота 12:12 часов. Это исследование было проведено в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных SJTU. Помещения для животных и протоколы были одобрены Комитетом по этике животных SJTU (№ A2019008).

Сто пятьдесят самцов мышей ICR (массой 18–20 г, возраст 6 недель) были приобретены у Shanghai Slack Biotechnology Company (Шанхай, Китай) и случайным образом разделены на 10 групп (n=15/группа). Субъекты и дозы для мышей с поведенческим отчаянием в каждой группе показаны в таблице 1. Дозы CTE(Цистанхеэкстракт тубулозы) и его выделенные фракции рассчитывали по следующей формуле: доза=4,55 г/кг сут. массы тела × выход, который был определен в соответствии с расчетами трех эквивалентных доз для человека на основе площади поверхности тела. Дозы положительного препарата имипрамина и метаболитов кишечной микробиоты (3-HPP и HT) устанавливали в соответствии с предыдущими исследованиями (Gupte et al., 2016; Pablos et al., 2019). После внутрижелудочного введения один раз в сутки в течение 7 дней на 8-й, 9-й и 10-й дни соответственно проводили тест открытого поля (ОПТ), тест подвешивания за хвост (ТХП) и тест принудительного плавания (ФПТ). Конкретные методы поведенческих тестов изложены в дополнительных материалах.

Семьдесят два самца крыс Sprague-Dawley (массой 160–180 г, возраст 6 недель) были приобретены у Shanghai Slack Laboratory Animal Company (Шанхай, Китай). Перед формальными экспериментами всех крыс после соответствующего обучения подвергали тесту предпочтения сахарозы (КПТ). Крысы были разделены на 8 групп (n=9/группа) в соответствии с их предпочтением сахарозы (дополнительная рис. S1). Субъекты и дозы для крыс в каждой группе показаны в таблице 1. Дозы были установлены в соответствии с коэффициентом преобразования между мышью и крысой на основе их эффективных доз у мышей с поведенческим отчаянием. А доза флуоксетина в качестве положительного контроля соответствовала предыдущему исследованию (Hou et al., 2017). Все группы получали серию хронических непредсказуемых легких стрессов (CUMS), за исключением контрольной группы. Стрессовые факторы применялись непрерывно и случайным образом в течение 4 недель (подробности см. В дополнительной таблице S1). Еда и вода были в свободном доступе для контрольных крыс, которые оставались нетронутыми в другой комнате, за исключением поведенческих тестов. Субъектам вводили внутрижелудочно за 1 час до процедуры CUMS в течение 4 недель. После 28 дней непрерывного воздействия стрессоров и введения препаратов ОФТ, КПТ и ФСТ проводили на 29-й, 31-й и 33-й дни соответственно. Конкретные методы поведенческих экспериментов показаны в дополнительных материалах.

Сбор проб и биохимический анализ

После поведенческих тестов голодающих крыс анестезировали пентобарбиталом натрия и собирали цельную кровь для получения образцов сыворотки. После перфузии сердца физиологическим раствором содержимое гиппокампа, толстой кишки и слепой кишки собирали и хранили при -80 ◦C. Дистальные сегменты толстой кишки удаляли и фиксировали в 4-процентном параформальдегиде. Уровни CORT, CRH, ACTH, TNF-, IL-1, IFN-, цАМФ, цГМФ, T, GnRH, триптофана и кинуренина в сыворотке, 5-HT, BDNF и TNF- в гиппокампе, а TNF- и IFN- в толстой кишке измеряли в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к соответствующим наборам ELISA.

Гистология, иммуногистохимия и вестерн-блоттинг

Для наблюдения за патологическими изменениями в ткани толстой кишки использовали окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и окрашивание альциановым синим периодической кислотой по Шиффу (AB-PAS). Кроме того, была проведена иммуногистохимическая оценка этих срезов для наблюдения за экспрессией белка ZO-1 в эпителиальных клетках толстой кишки (Ding et al., 2020). Подробная информация о подготовке образцов и вестерн-блоттинге для определения экспрессии белка IDO1 в толстой кишке и гиппокампе также описана в дополнительных материалах.

Композиционный анализ микробиоты кишечника

Высокопроизводительное секвенирование 16S рРНК было выполнено MajorBio Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а подробный метод и обработка данных показаны в дополнительных материалах.

статистический анализ

Данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для сравнения нескольких групп с использованием программного обеспечения SPSS 20.0. Различие считали значимым при p < 0,05.="" корреляции="" между="" кишечными="" микробами="" и="" некоторыми="" физиологическими="" факторами,="" связанными="" с="" депрессией,="" были="" проанализированы="" с="" использованием="" коэффициента="" корреляции="" спирмена="" на="" основе="" анализа="" тепловой="">

Полученные результаты

Химический анализ различных фракций, выделенных из ХТЭ(Цистанхеэкстракт тубулозы)

Основные компоненты были охарактеризованы с использованием UPLC-QTOF-MS (дополнительная таблица S2 и рис. S2), и в общей сложности был идентифицирован 21 компонент, в том числе 16 компонентов фенилэтаноидных гликозидов, 2 компонента фенольных гликозидов в CTE.(Цистанхеэкстракт тубулозы), ТГ и ТГ-ФГ; и 3 составляющие иридоидных гликозидов в ХТЭ(Цистанхеэкстракт тубулозы), TG и TG-IrG. В целом относительное содержание общих углеводов в ТП и ТО составило 60,3% и 80,8% соответственно. Относительное содержаниеобщийгликозидыв ТГ было 87,7 процента. Соответственно, на долю фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов приходилось 86,7% и 53,4% TG-PhG и TG-IrG соответственно. Содержание эхинакозида, вербаскозида, вербаскозида, 8-эпилогановой кислоты и тенипозидной кислоты в каждой фракции показано в таблице 2, а хроматограмма ВЭЖХ и данные проверки метода перечислены в дополнительной таблице S3 и на рисунке S3.

Влияние различных фракций, выделенных из КТР(Цистанхеэкстракт тубулозы)и типичные метаболиты кишечной микробиоты в поведенческих тестах отчаяния у мышей

Как показано на рис. 2, по сравнению с контрольной группой мыши, которым в течение 7 дней вводили имипрамин (положительный контроль), показали значительное сокращение времени неподвижности как в FST, так и в TST и не показали значительного влияния на общее расстояние, пройденное в OFT. . Аналогичные изменения наблюдались и в КТР.(Цистанхеэкстракт тубулозы), TG и HT, что указывает на то, что CTE, TG(общие гликозиды), и ГТ оказывали антидепрессивное действие, и их эффекты не были связаны с возбудимостью. Следовательно, ТГ(общие гликозиды)и HT были доминирующей биоактивной фракцией, отделенной от CTE и типичных метаболитов кишечной микробиотой соответственно. Интересно, что после введения TG-PhG и TG-IrG не было выявлено существенных изменений во времени иммобилизации в FST по сравнению с контролем или в TST после введения TG-PhG, что указывает на то, что присутствие фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов может играют важную роль в антидепрессивной активности CTE.

Фармакодинамические эффекты и биохимические изменения различных обогащенных гликозидами фракций и ГТ на крысах CUMS

Как показано в Таблице 3, у крыс, подвергшихся 28-дневной парадигме CUMS, наблюдалось значительное снижение (p < 0.001)="" предпочтения="" сахарозы="" в="" spt,="" общего="" пройденного="" расстояния,="" и="" количество="" вставаний="" в="" oft,="" а="" также="" значительное="" увеличение="" (p="">< 0,01)="" общего="" времени="" неподвижности="" в="" fst="" по="" сравнению="" с="" контролем,="" что="" свидетельствует="" об="" индукции="" депрессивно-подобных="" фенотипов="" у="" крыс="" cums.="" депрессивные="" проявления="" были="" обращены="" вспять="" в="" группе="" flx="" (положительный="" контроль).="" аналогично,="" лечение="" cte,="" tg,="" tg-phg,="" tg-irg="" и="" ht="" приводило="" к="" восстановлению="" предпочтения="" сахарозы="" до="" нормального="" уровня="" у="" крыс="" cums,="" которые="" составляли="" 102,7%,="" 94,1%,="" 89,8%,="" 91,9%="" и="" 94,3%="" от="" нормы.="" управления="" соответственно.="" последовательно="" в="" группах="" fst,="" cte="" и="" tg="" проявлялись="" наиболее="" очевидные="" эффекты,="" а="" время="" иммобилизации="" достигло="" 103,3%="" и="" 93,4%="" от="" такового="" в="" контрольной="" группе="" соответственно,="" в="" то="" время="" как="" время="" иммобилизации="" в="" группах="" tg-phg,="" tg-irg="" и="" ht="" только="" что="" достигли="" 62,1%,="" 73,2%="" и="" 69,9%="" контрольной="" группы.="" аналогичное="" достоверное="" увеличение="" (p="">< 0,05)="" наблюдалось="" в="" общем="" пройденном="" расстоянии="" и="" числе="" стоянок="" в="" офт="" после="">(Цистанхеэкстракт тубулозы), введение TG и HT, а также лечение TG-PhG и TG-IrG имели тенденцию к пересмотру количества вставаний на дыбы у крыс CUMS. Результаты показали, что ТГ является доминирующей биоактивной антидепрессантной фракцией, отделенной от ХТЭ, а фенилэтаноидные и иридоидные гликозиды незаменимы в проявлении его антидепрессивного эффекта. Более того, показано, что ГТ является одним из активных метаболитов ТГ in vivo.

Соответственно, страдающие CUMS значительно повышали уровни CORT, CRF, ACTH, TNF-, IL-1 и IFN- в сыворотке и TNF- в гиппокампе крыс по сравнению с таковыми в контрольной группе (p< 0.05),="" resulting="" in="" significant="" reductions="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" (fig.="" 3).="" except="" for="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" level="" of="" hippocampal="" bdnf="" between="" flx="" and="" cums="" groups,="" the="" above-mentioned="" alterations="" in="" cums="" rats="" could="" be="" significantly="" reversed="" (p="" <="" 0.05)="" after="" administration="" of="" fluoxetine,="" cte="">(Цистанхеэкстракт тубулозы), TG и HT, что указывает на то, что CTE, TG(общие гликозиды), и HT продемонстрировали улучшающие эффекты при гиперактивации оси HPA, тяжелом периферическом и нервном воспалении и дефиците {{0}} HT и BDNF. Аналогичным образом, лечение TG-IrG и TG PhG значительно снижало уровни сывороточного CORT, TNF-, IFN- и TNF- в гиппокампе и повышало уровень 5-HT в гиппокампе у крыс CUMS (p < {{8}="" }.05).="" значительное="" снижение="" (p="">< 0,05)="" уровней="" сывороточного="" crf="" и="" актг="" также="" наблюдалось="" в="" группе="" tg-irg="" по="" сравнению="" с="" группой="" cums.="" интересно,="" что="" уровни="" сывороточного="" cort,="" tnf-,="" acth="" и="" crf="" в="" группах="" tg-phg="" и="" tg-irg="" были="" значительно="" выше,="" чем="" в="" группе="" tg="" (p="">< 0,05),="" а="" уровни="" 5-ht="" в="" гиппокампе="" и="" bdnf="" демонстрировали="" противоположный="" характер="" экспрессии="" (p="">< 0,05).="" эти="" результаты="" показали,="" что="" эффекты="" tg-phg="" и="" tg-irg="" на="" гиперактивность="" оси="" hpa,="" периферическое="" и="" нервное="" воспаление="" и="" дефицит="" 5-ht="" были="" явно="" ниже,="" чем="" у="" tg,="" что="" указывает="" на="" то,="" что="" фенилэтаноидные="" и="" иридоидные="" гликозиды="" могут="" оказывать="" синергетическое="" воздействие="" на="" вышеупомянутые="" множественные="">

TG и HT регулируют ось HPG и метаболизм циклических нуклеотидов у крыс CUMS.

Были измерены уровни Т, ГнРГ, цАМФ и цГМФ, а также соотношение цАМФ и цГМФ (цАМФ/цГМФ) в сыворотке, подвергнутой CUMS, и результаты представлены в таблице 4. Концентрации Т, ГнРГ, цАМФ, и цАМФ/цГМФ в сыворотке были значительно снижены, а уровень цГМФ значительно повышен (p < 0.05)="" в="" группе="" cums="" по="" сравнению="" с="" контролем,="" что="" указывает="" на="" то,="" что="" воздействие="" cums="" привело="" к="" подавлению="" оси="" hpg.="" нарушения="" метаболизма="" циклических="" нуклеотидов.="" по="" сравнению="" с="" группой="" cums="" в="" группе="" flx="" не="" было="" значительных="" изменений.="" удивительно,="" но="" после="">(общие гликозиды)и лечения ГТ достоверное увеличение (p < {{0}}.05)="" было="" продемонстрировано="" в="" уровнях="" сывороточного="" t,="" gnrh,="" цамф="" и="" цамф/цгмф,="" в="" то="" время="" как="" уровень="" сывороточного="" цгмф="" был="" значительно="" снижен="" (p="">< 0,05).="" эти="" результаты="" показали,="" что="">(общие гликозиды)и HT регулировал ось HPG и метаболизм циклических нуклеотидов, что явно превосходило положительный контроль флуоксетина.

ТГ и ГТ облегчают незначительное воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера у крыс CUMS.

Окрашивание гематоксилином и эозином использовалось для оценки морфологического повреждения толстой кишки, и между экспериментальными группами не наблюдалось существенных различий в толстой кишке (рис. 4а). Кроме того, также были проанализированы эффекты ТГ и ГТ на воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера (рис. 4b-d). По сравнению с контрольной группой количество бокаловидных клеток и толщина слизистого слоя были уменьшены в группе CUMS. Соответственно, экспрессия белка ZO-1 и уровни IFN- и TNF- в толстой кишке были значительно снижены (p < 0.05)="" и="" повышены="" (p="">< 0,05).="" ),="" соответственно,="" предполагая,="" что,="" хотя="" явных="" гистологических="" повреждений="" не="" было,="" воздействие="" cums="" приводило="" к="" вялотекущему="" воспалению="" в="" толстой="" кишке="" и="" нарушению="" кишечного="" барьера.="" после="" флуоксетина="">(общие гликозиды), и лечение ГТ количество бокаловидных клеток и толщина слоя слизи были увеличены, а уровни IFN- и TNF- в толстой кишке были значительно снижены (p < 0.05).="" кроме="" того,="" тг="" и="" гт="" значительно="" повышали="" (p="">< 0,05)="" экспрессию="" белка="" zo-1="" до="" уровня,="" аналогичного="" таковому="" в="" контрольной="" группе.="" эти="" результаты="" показали,="" что="">(общие гликозиды)а ГТ может ослаблять слабовыраженное воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера у крыс CUMS.

Влияние ТГ и ГТ на состав микробиоты кишечника

После удаления неквалифицированных последовательностей было получено в общей сложности 1 874 721 эффективное чтение. Результаты альфа-разнообразия (рис. 5а) и бета-разнообразия (рис. 5б) показали, что, хотя богатство (Чао) и разнообразие (Шеннон) кишечной микробиоты в содержимом слепой кишки не различались, общая структура кишечной микробиоты в график анализа основных координат (PCoA) показал поразительную разницу между контрольной группой и группой CUMS. Более того, ТГ(общие гликозиды)и лечение ГТ значительно увеличивало бактериальное богатство крыс CUMS и индуцировало заметные различия на графике PCoA по сравнению с таковыми у крыс CUMS, показывая явное сходство с контролем, особенно когда TG(общие гликозиды)был проанализирован.

Таксономические изменения в микробиоте также подтвердили, что ТГ(общие гликозиды)оказывает существенное регулирующее влияние на состав кишечной микробиоты. После ТГ(общие гликозиды)Введение обилие большинства измененных таксонов у крыс CUMS было обращено на уровень, аналогичный таковому в контрольной группе. Значительное снижение (14,2 %, p < 0,05)="" и="" обогащение="" (53,6="" %,="">< 0.05)="" in="" the="" abundances="" of="" the="" phylum="" firmicutes="" and="" bacteroidetes="" were="" observed="" in="" the="" tg="">(общие гликозиды)группе по сравнению с группой CUMS (рис. 5в) соответственно. Соответственно, на уровне семейства (дополнительная таблица S4) TG снизила численность Ruminococcaceae (тип Firmicutes) и Peptococceae (тип Firmicutes) на 33,9 процента и 82,9 процента соответственно по сравнению с группой CUMS (p < 0.="" {{10}}5).="" наоборот,="" в="" группе="" tg="" наблюдалось="" значительное="" увеличение="" численности="" представителей="" семейства="" erysipelotrichaceae="" (тип="" firmicutes,="" 78,4="" процента,="" p=""><0,05) и="" muribaculaceae="" (тип="" bacteroidetes,="" 77,3="" процента,="" p=""><0,05). последовательно="" на="" уровне="" рода="" (рис.="" 5d)="" обилие="" anaerotruncus,="" harryflintia,="" ruminiclostridium_9,="" неклассифицированных_f_ruminococcaceae="" (представителей="" семейства="" rumino-coccaceae)="" и="" peptococcus="" (представитель="" семейства="" peptococceae)="" значительно="" уменьшился,="" в="" то="" время="" как="" norank_f_erysipelotrichaceae,="" allo="" baculum,="" dubosiella="" (представители="" семейства="" erysipelotrichaceae)="" и="" norank_f{{24}="" }muribaculaceae="" (представитель="" семейства="" muribaculaceae)="" показали="" более="" высокую="" численность="" в="" группе="" tg,="" чем="" в="" группе="" cums="">< 0.05).="" in="" addition,="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" tyzzerella_3,="" acetatifactor,="" and="" norank_f_lachnospiraceae="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae="" (p="" <="" 0.05),="" although="" the="" abundance="" of="" the="" family="" lachnospiraceae="" was="" similar="" across="" all="" experimental="" groups.="" unlike="" tg,="" ht="" decreased="" the="" abundances="" of="" partially="" altered="" taxa="" induced="" by="" cums,="" including="" the="" family="" ruminococcaceae,="" 3="" genera="" (anaerotruncus,="" harryflintia,="" and="" ruminiclostridium_9)="" assigned="" to="" the="" family="" ruminococcaceae="" and="" 2="" genera="" (tyzzerella_3,="" acetatifactor)="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae.="" additionally,="" converse="" variations="" were="" observed="" in="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae_ucg_013="" and="" streptococcus="" in="" the="" ht="" group.="" these="" results="" indicated="" that="" tg="" and="" ht="" exerted="" clear="" differences="" in="" the="" regulation="" of="" gut="" microbiota="" composition,="" and="" the="" effect="" of="" tg="" was="" superior="" to="" that="" of="" tg="" especially="" in="" altering="" the="" genera="" assigned="" to="" the="" family="" erysipelotrichaceae,="" peptococcaceae,="" and="">

Корреляционный анализ измененных микробных родов, пораженных ТГ(общие гликозиды)и HT, гормоны, связанные с осью HPA, провоспалительные цитокины, 5- HT и BDNF

Выяснить связи между изменениями состава микробиоты кишечника под влиянием ТГ.(общие гликозиды)и HT, а также соответствующие черты, связанные с депрессией, был проведен корреляционный анализ Спирмена. Как показано на рис. 6, уровни 5-HT и BDNF в гиппокампе значимо положительно коррелировали только с норангом_f_Muribaculaceae. В противном случае можно было бы выявить четкие корреляции между измененными микробными родами и гормонами, связанными с оси HPA. В частности, Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae, norank_f_ Erysipelotrichacea и Peptococcus были тесно связаны с функцией оси HPA. CORT, CRF и АКТГ в сыворотке имели отрицательную корреляцию с Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae и norank_f_Erysipelotrichacea и положительную связь с Peptococcus. Кроме того, Dubosiella и norank_f_ Erysipelotrichacea демонстрировали отрицательную связь с IFN- и гиппокампальным TNF- в толстой кишке, в то время как аналогичные отношения существовали у Allobaculum, Harryfinita, сывороточного и гиппокампального TNF-, а также у norank. _f_Lachnospiracea и сывороточные IFN- и TNF-. Напротив, Peptococcus был положительно связан с TNF- и TNF- в толстой кишке. Аналогично, norank_f_Muribaculaceae был положительно связан с сывороточными IFN- и TNF-. Эти результаты показали, что измененные микробные роды, особенно некоторые роды, принадлежащие к семействам Erysipelotrichaceae, Peptococceae и Muribaculaceae, которые были специфически затронуты ТГ, показали сильные ассоциации с гормонами, связанными с осью HPA, и провоспалительными цитокинами одновременно, демонстрируя критическую роль микробиоты кишечника в регуляции функции оси HPA и воспаления.

ТГ(общие гликозиды)и ГТ ингибируют метаболизм триптофана-кинуренина у крыс CUMS.

Эффекты ТГ(общие гликозиды)и ГТ на уровни триптофана и кинуренина в сыворотке крови крыс, а также экспрессию IDO1 в толстой кишке и гиппокампе. Как показано на рис. 7 и рис. 8, по сравнению с контрольной группой уровень триптофана в сыворотке был значительно снижен в группе CUMS, в отличие от повышенного уровня кинуренина и отношения кинуренина к триптофану (Kyn /Trp) и экспрессия белка IDO1 в толстой кишке и гиппокампе. По сравнению с группой CUMS сывороточный Kyn/Trp в группе FLX был значительно снижен (p< 0.05).="" tg="">(общие гликозиды)и лечение ГТ приводило к значительному увеличению уровня триптофана в сыворотке у крыс CUMS (p < {{0}}.05)="" и="" снижению="" уровней="" сывороточного="" кинуренина="" и="" kyn/trp.="" (р="">< 0,05).="" кроме="" того,="" тг="" значительно="" ингибировал="" экспрессию="" белка="" ido1="" в="" толстой="" кишке="" крыс="" cums="" (p="">< 0,05),="" в="" то="" время="" как="" между="" группами="" cums="" и="" тг="" наблюдалась="" недостоверная="" разница="" в="" экспрессии="" белка="" ido1="" в="" гиппокампе.="" однако="" влияние="" гт="" на="" экспрессию="" белка="" ido1="" в="" толстой="" кишке="" и="" гиппокампе="" было="" противоположным="" влиянию="" тг,="" что="" указывает="" на="" то,="" что="" тг="" и="" гт="" ингибировали="" метаболизм="" триптофана-кинуренина="" путем="" снижения="" экспрессии="" ido1="" в="" толстой="" кишке="" и="" гиппокампе="" крыс="" cums,="" соответственно.="">

Обсуждение

В этом исследовании для скрининга биоактивных соединений в КТ использовались две разные модели животных.(Цистанхетрубчатый)которые впервые облегчают депрессивное поведение. TP и TO, скорее всего, были неэффективными ингредиентами в CTE, в то время как TG(общие гликозиды)показали наибольший потенциал в лечении депрессии. Предыдущие исследования по КТ(Цистанхетрубчатый), так же какЦистанхерастений, в основном сосредоточились на биологической активности фенилэтаноидных гликозидов с самым высоким содержанием и пренебрегли важностью иридоидных гликозидов и других менее распространенных ингредиентов. Интересно, что наше исследование показало, что фенилэтаноидные и иридоидные гликозиды продемонстрировали синергетическое воздействие на гиперактивность оси HPA, тяжелое периферическое и нервное воспаление и дефицит 5-HT и BDNF в гиппокампе, что может быть важной причиной преимущественного антидепрессанта. эффект ТГ(общие гликозиды). Эти результаты также свидетельствуют о многокомпонентных и многоцелевых характеристиках фитотерапии и напоминают нам о том, что компоненты с более низким содержанием, даже микроэлементы, также могут играть ключевую роль в фармакологическом эффекте.

Хронический стресс вызывает гиперактивность оси HPA, которая способствует возникновению депрессии, а также подавление оси HPG за счет снижения высвобождения GnRH и/или чувствительности гипофиза к GnRH (Kirby et al., 2009). Между тем, цАМФ и цГМФ являются важными промежуточными узлами, которые зависят от многих нейротрансмиттеров и гормонов для проявления своих физиологических эффектов (Siawrys et al., 2002). Недавние исследования последовательно показали, что возникновение дефицита почек-ян тесно связано с дисфункцией оси гипоталамус-гипофиз-мишень (Zhang et al., 2019). При синдроме почечной недостаточности также наблюдалось заметное снижение уровней цАМФ и цАМФ/цГМФ в сыворотке. В этом исследовании мы обнаружили, что ТГ(общие гликозиды)может ингибировать уровни CORT, CRF и ACTH в сыворотке и повышать содержание T и GnRH в сыворотке у крыс CUMS, что указывает на восстановление дисфункции оси HPA и HPG после введения TG. Кроме того, ТГ(общие гликозиды)обратил значительное снижение уровня цАМФ/цГМФ в сыворотке у крыс, подвергшихся CUMS. Таким образом, потенциальный механизм, лежащий в основе CT(Цистанхетрубчатый) в лечении депрессии и недостаточности Ян почек могут быть частично схожи и заслуживают дальнейшего изучения. Кроме того, производство сексуального желания и поведения представляет собой сложный нервный рефлекторный процесс. Половые гормоны являются основными источниками центрального сексуального возбуждения, а недостаток половых гормонов может вызвать снижение полового влечения или сексуальную дисфункцию (Holloway and Wylie, 2015). В частности, чрезмерная 5-ГТ ингибирует высвобождение ГнРГ, что является основной причиной возникновения хронической сексуальной дисфункции после длительного лечения СИОЗС (Prasad et al., 2015). В нашем исследовании флуоксетин (представитель СИОЗС) был неэффективен при дисфункции оси HPG. Однако, хотя ТГ(общие гликозиды)значительно улучшал уровень 5-HT в гиппокампе, также наблюдались аналогичные изменения уровней T и GnRH в сыворотке, что улучшало подавление оси HPG. Эти результаты демонстрируют явное преимущество КТ.(Цистанхетрубчатый) в лечении депрессии, и внутренний механизм, ответственный за эти эффекты, нуждается в дальнейшем изучении.

Все больше данных свидетельствует о том, что кишечник является потенциальной мишенью для лечения хронических заболеваний с использованием природных соединений с низкой биодоступностью (Zhou et al., 2020). Недавние исследования (Wei et al., 2019) показали, что лечение CUMS вызывает изменения фекального микробиома и дефекты кишечного барьера, которые облегчают бактериальную инвазию в слизистую оболочку толстой кишки и усугубляют воспалительные реакции в толстой кишке. В соответствии с этим отчетом наши результаты показали, что 4 недели воздействия CUMS вызывали обширное истощение количества бокаловидных клеток и толщины слоя слизи в толстой кишке крыс, а также начало нарушения кишечного барьера, представленного повышенной проницаемостью кишечника, что определялось измерение белка ZO-1. Кроме того, в толстой кишке наблюдали повышенную экспрессию провоспалительных факторов (таких как TNF- и IFN-). Соответственно, эти результаты показали, что, хотя явных гистологических повреждений не было, лечение CUMS инициировало воспаление толстой кишки и нарушение кишечного барьера. Предыдущие исследования показали, что КТ повышает эффективность профилактики колита, вызванного DSS, у мышей (Jia et al., 2014). Непоследовательный, ТГ(общие гликозиды)также было показано, что он облегчает слабовыраженное воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера у крыс CUMS, что подчеркивает его потенциал для клинического лечения заболеваний, связанных с воспалением толстой кишки.

Обширные исследования также показали, что взаимосвязь, связывающая комменсальную микробиоту кишечника, ось HPA и воспаление, является сложной и играет решающую роль в развитии депрессии (Misiak et al., 2020). Изменения в составе микробиоты кишечника могут способствовать усиленному высвобождению цитокинов и синтезу малых биоактивных молекул (Du et al., 2020). Некоторые цитокины (такие как TNF-) могут проходить через гематоэнцефалический барьер и являются мощными активаторами оси HPA (Misiak et al., 2020). В свою очередь, гиперактивация оси HPA может способствовать дисбиозу микробиоты кишечника, хроническому воспалению в толстой кишке и изменению проницаемости кишечника (Misiak et al., 2020). В соответствии с предыдущими исследованиями, модификация кишечной микробиоты с помощью ТГ, вероятно, отвечает за ее облегчающее действие на депрессию. Мы заметили, что ТГ(общие гликозиды)изменили обилие микробных таксонов на разных уровнях у крыс, подвергшихся CUMS, до уровня, аналогичного контрольным. В частности, было обнаружено, что основные измененные роды, принадлежащие к семействам Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae и Muribaculaceae, сильно коррелируют с осью HPA и воспалением. В соответствии с нашими результатами сообщается, что семейства Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae и Muribaculaceae играют важную роль в поддержании целостности слизистого барьера и возникновении воспаления (Kankoush, 2015; Borton et al., 2017; Zhang et al., 2020). Поэтому мы предположили, что ТГ может сдерживать обилие некоторых родов, отнесенных к семействам Erysipelotrichacea, Peptococceae и Muribaculaceae, впоследствии облегчая слабовыраженное воспаление в толстой кишке, гиперактивность оси HPA и нарушение целостности слизистого барьера. Интересно, что в нашем исследовании только один род, названный nor ank_f_Muribaculaceae, коррелировал с 5-HT и BDNF в гиппокампе. Конкретный механизм связи остается неясным и требует дальнейшего изучения. В противном случае результаты также предполагают, что большинству измененных родов, вызванных TG, чрезвычайно трудно напрямую влиять на уровни 5-HT в гиппокампе. Чтобы объяснить, как изменения в составе кишечной микробиоты влияют на уровень 5-HT гиппокампа после лечения TG, наше внимание привлекла сложная взаимосвязь, связывающая метаболизм триптофана, ось HPA, воспалительные цитокины и 5-HT. Триптофан является незаменимой аминокислотой для человека, и менее 1 процента используется в синтезе белка, при этом большая часть (более 90 процентов) преобразуется IDO1 и триптофаном 2,3-диоксигеназой 2 (TDO2) в кинуренины, и приблизительно 5 процентов управляются триптофангидроксилазой по пути серотонина (Duan, et al., 2018). Уровень 5-HT в мозге в значительной степени зависит от периферической доступности триптофана, учитывая, что триптофан транспортируется в мозг через транспортеры нейтральных аминокислот (Duan et al., 2018). IDO1, скорость-лимитирующий фермент на первом этапе кинуренинового пути, в основном индуцируется IFN- и другими провоспалительными цитокинами, такими как IL-1 и TNF- (Kennedy et al., 2017). которые, как было показано, связаны с микробиотой кишечника в нашем исследовании. Как сообщалось, большее количество триптофана метаболизируется по кинурениновому пути, тем самым конкурентно снижая превращение триптофана в 5-HT и связывая это со снижением 5-HT, обычно наблюдаемым при депрессии (O'Mahony et al., 2015). Таким образом, более низкие уровни триптофана и более высокие Kyn/Trp являются общими и совпадают с повышенным риском депрессивного настроения. После введения ТГ сверхэкспрессия IDO1 в толстой кишке ингибировалась, что приводило к повышению уровня триптофана в сыворотке и снижению сывороточного Kyn/Trp, что выявило потенциальную связь между кишечной микробиотой и уровнем 5-HT в гиппокампе, затронутым ТГ. Между тем, BDNF, член семейства нейротрофинов, необходим для дифференцировки клеток, выживания нейронов, образования синапсов и процессов нейропластичности при депрессии (Greenberg et al., 2009). Недавние исследования показали, что BDNF тесно связан с барьерной функцией слизистой оболочки кишечника и кишечной микробиотой (Maqsood and Stone, 2016). Кроме того, сообщалось, что изменения в микробиоте кишечника могут повышать уровень экспрессии BDNF и, таким образом, влиять на развитие депрессивного поведения (Du et al., 2020). Однако, подобно вариациям 5-HT, для большинства измененных родов, вызванных TG в нашем исследовании, было крайне невозможно непосредственно влиять на уровни BDNF в гиппокампе, и внутренняя молекулярная связь и механизм нуждаются в дальнейшем изучении.

Напротив, HT, метаболит кишечной микробиоты TG(общие гликозиды), также продемонстрировал антидепрессивный эффект в настоящем исследовании, что согласуется с его преимущественным нейропротекторным действием (Hu et al., 2014). Вызывает обеспокоенность, что ГТ может также снижать уровень провоспалительных цитокинов, гормонов, связанных с осью ГГН и ГГГ, и концентрации 5-ГТ в гиппокампе до уровня, сходного с контрольным уровнем у крыс CUMS, в то время как большинство измененных микробных родов затрагивали при ГТ имел слабую корреляцию с вышеуказанными физиологическими показателями, что свидетельствует о том, что кишечная микробиота не может быть мишенью антидепрессивной активности ГТ. Кроме того, ГТ подавляла сверхэкспрессию IDO1 в гиппокампе, но не в толстой кишке, что сопровождалось повышением уровня триптофана в сыворотке. Возникновение видимых различий между ТГ(общие гликозиды)и ГТ может быть связано с превосходным всасыванием ГТ в кровоток и способностью ГТ преодолевать гематоэнцефалический барьер (Robles-Almazan et al., 2018), что также указывает на высокую метаболическую способность кишечной микробиоты. особенно важна антидепрессивная активность ТГ, помимо его физиологических функций. Следовательно, мы предварительно доказали, что двунаправленное взаимодействие фитохимических веществ и кишечной микробиоты играет решающую роль в лечении депрессии введением ТГ (как показано на рис. 9).

Вывод

В общем, ТГ.(общие гликозиды)был в основном ответственен за антидепрессивную активность CT(Цистанхетрубчатый), что отражает синергетическое действие фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов на гиперактивацию оси HPA, тяжелое периферическое и нервное воспаление и дефицит 5-HT и BDNF в гиппокампе. Кроме того, потенциальный молекулярный механизм антидепрессивного действия ТГ(общие гликозиды)было достигнуто за счет двунаправленного взаимодействия фитохимических веществ и кишечной микробиоты. Кроме того, улучшение подавленной оси HPG и аномалии циклических нуклеотидов с помощью TG(общие гликозиды)и ГТ, которые не регулировались лечением СИОЗС, представленными флуоксетином, указывали на явное преимущество ХТ при лечении депрессии. Такие модуляции представляют собой многообещающую стратегию лечения депрессии с помощью КТ.(Цистанхетрубчатый) и подобные традиционные травяные лекарства.

Вклад автора

XL, YP и LF разработали эксперименты и проанализировали данные. LF и JW провели эксперимент и проанализировали данные. LF и XL составили рукопись. PM способствовал экспериментам на животных и тестированию образцов, а LZ способствовал анализу состава микробиоты кишечника. Все данные были получены собственными силами, и бумажная фабрика не использовалась. Все авторы соглашаются нести ответственность за все аспекты работы, обеспечивая целостность и точность.

Декларация о конкурирующих интересах

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального ключевого проекта исследований и разработок (2017YFC1702400).

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы, связанные с этой статьей, можно найти в онлайн-версии по адресу doi:10.1016/j.phymed.2021.153471.

Из: 'общие гликозиды из стеблейЦистанхетрубчатыйоблегчить депрессивное поведение: двунаправленное взаимодействие фитохимических веществ и кишечной микробиоты за счетЛи Фань и др.

---Фитомедицина 83 (2021) 153471/ https://doi.org/10.1016/j.phymed.2021.153471