Общее количество гликозидов из стеблей Cistanche Tubulosa облегчает депрессивное поведение

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ли Фан, Ин Пэн, Цзинвэнь Ван, Пин Ма, Лицзюань Чжао, Сяобо Ли *

АННОТАЦИЯ

Фон:В качестве наиболее часто используемогодетоксицирующая трава Ян почекв традиционной китайской медицине было показано, что высушенные сочные стебли Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) эффективны при лечении депрессии. Однако компоненты антидепрессантов и их основной механизм остаются неясными.

Цель:Изучить активные компоненты КТ против депрессии, а также потенциальные механизмы. Дизайн и методы исследования. Для оценки антидепрессивной активности полисахаридов, олигосахаридов и различных обогащенных гликозидами фракций, выделенных из CT, а также типичных метаболитов кишечной микробиоты, включая 3-гидроксифенилпропионовую кислоту ({{2), использовались поведенческие тесты отчаяния. }}HPP) и гидрокситирозол (HT). Кроме того, влияние биоактивных фракций и метаболитов на модели хронического непредсказуемого легкого стресса (CUMS) было изучено с помощью многочисленных фармакодинамических и биохимических анализов. Изменения гистологии толстой кишки и кишечного барьера наблюдали с помощью окрашивания и иммуногистохимического анализа. Микробные особенности кишечника и метаболизм триптофана-кинуренина исследовали с помощью секвенирования 16S рРНК и вестерн-блоттинга соответственно.

Полученные результаты:Общие гликозиды (ТГ) значительно облегчали депрессивное поведение по сравнению с различными отдельными фракциями, отражая синергетические эффекты фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов на гиперактивацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГН), тяжелое нейро- и периферическое воспаление, дефицит 5-гидрокситриптамина (5-HT) и мозгового нейротрофического фактора в гиппокампе. Более того, ТГ смягчал слабовыраженное воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера, а обилие нескольких родов бактерий сильно коррелировало с осью HPA и воспалением у крыс CUMS. Соответственно, экспрессия индоламин-2, 3-диоксигеназы 1 (IDO1) в толстой кишке была значительно снижена после введения ТГ, что сопровождалось подавлением метаболизма триптофана-кинуренина. С другой стороны, ГТ также оказывала заметный антидепрессивный эффект за счет улучшения функции оси HPA, высвобождения провоспалительных цитокинов и метаболизма триптофана-кинуренина, в то время как она не могла в значительной степени регулировать нарушенную микробиоту кишечника так же, как ТГ. Удивительно, но превосходящие флуоксетин, ТГ и ГТ могут дополнительно улучшить дисфункцию гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и аномальный метаболизм циклических нуклеотидов.

Польза цистанче сальсыможет еще большеулучшить дисфункцию.

Введение

Депрессия — это хроническое, повторяющееся и потенциально опасное для жизни психическое расстройство, которым страдает до 20 процентов населения во всем мире (Nabavi et al., 2017). В настоящее время, хотя многие антидепрессанты были одобрены, побочные эффекты вызывают беспокойство. Примечательно, что длительное лечение селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (СИОЗС), такими как флуоксетин, основным фармакологическим средством от депрессии, усугубляло такие проблемы, как хроническая сексуальная дисфункция (Bijlsma et al., 2014); это привлекло все большее внимание к открытию новых антидепрессантов из натуральных трав (Wang et al., 2019). В теории традиционной китайской медицины (ТКМ) дефицит почечного ян приводит к характеристикам производительности, аналогичным клиническим симптомам депрессии, таким как чувство подавленности, потеря интереса и сентиментальность (Yang et al., 2020), продвигая мысли для облегчения депрессивного поведения путем тонизирования Ян почек. Так совпало, что многие тонизирующие почки травы улучшают сексуальную функцию (Wu et al., 2015). Такие исследования заставляют нас обратить внимание на потенциальное применение Cistanches Herba, которая является наиболее часто используемой травой, тонизирующей почки, в ТКМ и эффективной при лечении мужской сексуальной дисфункции (Wang et al., 2020), с точки зрения разработки антидепрессантов. Cistanches Herba, официально зарегистрированные как высушенные сочные стебли Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (CT) и Cistanche Deserticola (YC Ma) в Китайской фармакопее (Wang et al., 2017), использовались в Китае и других странах Восточной Азии. с 15-го века для лечения таких состояний, как недостаточность почек-ян, импотенция и женское бесплодие. Современные фармакологические исследования показывают, что Cistanches Herba обладает множественной биологической активностью, такой как усиление иммунитета, нейропротекция, антиоксидантное действие, замедление старения и снижение усталости (Wang et al., 2017). Нейропротекторные свойства Cistanches Herba предполагают его терапевтический потенциал при когнитивных заболеваниях, таких как инсульт, депрессия и болезнь Альцгеймера (Wang et al., 2020). В нашем предыдущем исследовании мы обнаружили, что экстракт CT облегчал депрессивное поведение крыс с хроническим непредсказуемым легким стрессом (CUMS) (Li et al., 2018). На сегодняшний день химический анализ CT показал, что его основные составляющие включают фенилэтаноидные гликозиды, иридоидные гликозиды, полисахариды и олигосахариды (Jiang and Tu, 2009), однако тип соединения, который играет доминирующую роль в его антидепрессивном эффекте, остается неясным.

Многочисленные исследования подтвердили, что физиологическое действие кишечника (особенно комменсальной микробиоты) играет важную роль в развитии депрессии и может регулировать нейроэндокринную, вегетативную нервную и иммунную системы (Yang et al., 2020). Более того, взаимосвязь, связывающая метаболизм триптофана, кишечную микробиоту и депрессию, постепенно привлекала большое внимание. Измененная микробиота кишечника может активировать триптофан-кинурениновый путь, впоследствии снижая доступность триптофана в периферических и церебральных тканях, что приводит к дефициту 5-HT (Agus et al., 2018). Наше предыдущее исследование показало, что фенилэтаноидные гликозиды в CT обычно обладают низкой биодоступностью и могут быстро метаболизироваться в 3-гидроксифенилпропионовую кислоту (3-HPP) и гидрокситирозол (HT) микробиотой кишечника (Li et al. др., 2016). Кроме того, сообщалось, что экстракт CT восстанавливает гомеостаз микробиоты кишечника у крыс CUMS (Li et al., 2018). Основываясь на таких исследованиях, мы пришли к выводу, что двунаправленное взаимодействие фитохимических веществ и кишечной микробиоты может управлять антидепрессивным действием определенных биоактивных компонентов КТ. В частности, соединения могут быть преобразованы в абсорбируемые метаболиты (такие как 3-HPP и HT) в желудочно-кишечном тракте кишечной микробиотой и впоследствии оказывать антидепрессивное действие. В свою очередь, структурные изменения кишечной микробиоты, вызванные биоактивными компонентами, могут одновременно играть жизненно важную роль в антидепрессивной активности.

Материалы и методы

Материалы

Все стандарты, используемые для химического анализа, были приобретены у Durst (Сычуань, Китай). 3-HPP, HT, флуоксетин и имипрамин были приобретены у Aladdin (Шанхай, Китай). Набор для количественного определения белка BCA был приобретен у Boster (Ухань, Китай). Компания Nanjing Jiancheng (Нанкин, Китай) предоставила 5-HT, BDNF, фактор некроза опухоли-альфа (TNF-), интерлейкин-1бета (IL-1) и интерферон-гамма (IFN- ) наборы для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Наборы ИФА для кортикостерона (CORT), адренокортикотропного гормона (АКТГ) и кортикотропин-рилизинг-гормона (CRH) были приобретены у Multi Sciences (Ханчжоу, Китай). Наборы ИФА для циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), тестостерона (Т) и гонадотропин-высвобождающего гормона (ГнРГ) были приобретены у Enzyme-linked Biotechnology (Шанхай, Китай). Наборы ELISA для триптофана и кинуренина были получены от Small Molecule Antibodies (Бордо, Франция). Первичные/вторичные антитела, включая zonula occludens 1 (ZO-1), индоламин 2, 3-диоксигеназу 1 (IDO1), -актин и HRP козий антикроличий IgG (H плюс L), были приобретены у Proteintech. (Ухань, Китай). Все остальные реактивы квалификации ч.д.а. или выше были получены от коммерческих поставщиков.

добавка экстракта цистанхе

Приготовление различных фракций, отделенных от ХТЭ

КТ была собрана в ноябре 2015 года в Хэтиане, Синьцзян, Китай, и подтверждена профессором Сяобо Ли. Образец ваучера (20151108) был депонирован в Фармацевтической школе Шанхайского университета Цзяо Тонг.

Измельченные образцы трижды экстрагировали дистиллированной водой (1:10, вес/объем) в течение 2 ч при 80~90 ◦С для получения КТР (выход 57,1%). ХТЭ растворяли в дистиллированной воде, затем медленно перемешивали с этанолом (1:4, объем/объем) и выдерживали при 4°С в течение 24 часов. Затем осадок и супернатант собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Общие полисахариды (TP; выход 5,7%) получали промывкой 80%-ным этанолом и трехкратной депротеинизацией реактивом Сэвиджа из собранного осадка. Затем оставшийся супернатант хроматографировали на колонке с микропористой смолой D101 и элюировали дистиллированной водой и 40-процентным этанолом. Элюированная водная и 40-процентная этанольная фракции содержали общие олигосахариды (ТО, выход 35,1%) и общие гликозиды (ТГ, выход 12,1%) соответственно. TG снова элюировали дистиллированной водой и 5%, 10% и 40% этанолом через микропористую смолу D101, и элюированные фракции 5% и 40% этанола представляли собой суммарные иридоидные гликозиды (TG-IrG; выход составил 2,7%). и суммарные фенилэтаноидные гликозиды (ТГ-ФГ; выход 8,7%) соответственно.

Химический анализ

Во-первых, основные химические составляющие различных фракций, выделенных из CTE, были охарактеризованы с помощью UPLC-QTOF-MS. Во-вторых, относительное содержание общих углеводов и гликозидов определяли методом UV-Vis. В-третьих, основные компоненты (эхинакозид, вербаскозид, изовербаскозид, 8-эпилогановая кислота и генипозидовая кислота) были количественно определены с помощью валидированного метода ВЭЖХ. Подробные параметры и проверка метода показаны в дополнительных материалах.

Рис. 1. Блок-схема экспериментов на животных

Таблица 1. Субъекты и дозировка для мышей или крыс в каждой группе.

Эксперименты на животных

Конкретные графики экспериментов на животных показаны на рис. 1. Все экспериментальные животные были размещены и акклиматизированы в течение 1 недели до начала экспериментов в Центре лабораторных животных Шанхайского университета Цзяо Тонг (Шанхай, Китай) при контролируемой комнатной температуре (25 ± 2 ◦C; относительная влажность 55 ± 10 процентов) с циклом свет-темнота 12:12 часов. Это исследование было проведено в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных SJTU. Помещения для животных и протоколы были одобрены Комитетом по этике животных SJTU (№ A2019008).

Сто пятьдесят самцов мышей ICR (массой 18–20 г, возраст 6 недель) были приобретены у Shanghai Slack Biotechnology Company (Шанхай, Китай) и случайным образом разделены на 10 групп (n=15/группа). Испытуемые и дозы для мышей с поведенческим отчаянием в каждой группе показаны в таблице 1. Дозы CTE и его выделенных фракций рассчитывали по следующей формуле: доза=4,55 г/кг сут. массы тела × выход, которая была определена в соответствии с расчетами трех эквивалентных доз для человека на основе площади поверхности тела. Дозы положительного препарата имипрамина и метаболитов кишечной микробиоты (3-HPP и HT) устанавливали в соответствии с предыдущими исследованиями (Gupte et al., 2016; Pablos et al., 2019). После внутрижелудочного введения один раз в сутки в течение 7 дней на 8-й, 9-й и 10-й дни соответственно проводили тест открытого поля (ОПТ), тест подвешивания за хвост (ТХП) и тест принудительного плавания (ФПТ). Конкретные методы поведенческих тестов изложены в дополнительных материалах.

Семьдесят два самца крыс Sprague-Dawley (массой 160–180 г, возраст 6 недель) были приобретены у Shanghai Slack Laboratory Animal Company (Шанхай, Китай). Перед формальными экспериментами всех крыс после соответствующего обучения подвергали тесту предпочтения сахарозы (КПТ). Крысы были разделены на 8 групп (n=9/группа) в соответствии с их предпочтением сахарозы (дополнительная рис. S1). Субъекты и дозы для крыс в каждой группе показаны в таблице 1. Дозы были установлены в соответствии с коэффициентом преобразования между мышью и крысой на основе их эффективных доз у мышей с поведенческим отчаянием. А доза флуоксетина в качестве положительного контроля соответствовала предыдущему исследованию (Hou et al., 2017). Все группы получали серию хронических непредсказуемых легких стрессов (CUMS), за исключением контрольной группы. Стрессовые факторы применялись непрерывно и случайным образом в течение 4 недель (подробности см. В дополнительной таблице S1). Еда и вода были в свободном доступе для контрольных крыс, которые оставались нетронутыми в другой комнате, за исключением поведенческих тестов. Субъектам вводили внутрижелудочно за 1 час до процедуры CUMS в течение 4 недель. После 28 дней непрерывного воздействия стрессоров и введения препаратов ОФТ, КПТ и ФСТ проводили на 29-й, 31-й и 33-й дни соответственно. Конкретные методы поведенческих экспериментов показаны в дополнительных материалах.

Таблица 2. Содержание эхинакозида, вербаскозида, изовербаскозида, 8-эпилогановой кислоты и генипозидовой кислоты в каждой фракции.

Сбор проб и биохимический анализ

После поведенческих тестов голодающих крыс анестезировали пентобарбиталом натрия и собирали цельную кровь для получения образцов сыворотки. После перфузии сердца физиологическим раствором содержимое гиппокампа, толстой кишки и слепой кишки собирали и хранили при -80 ◦C. Дистальные сегменты толстой кишки удаляли и фиксировали в 4-процентном параформальдегиде. Уровни CORT, CRH, ACTH, TNF-, IL-1, IFN-, цАМФ, цГМФ, T, GnRH, триптофана и кинуренина в сыворотке, 5-HT, BDNF и TNF- в гиппокампе, а TNF- и IFN- в толстой кишке измеряли в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к соответствующему набору ELISA.

Гистология, иммуногистохимия и вестерн-блоттинг

Для наблюдения за патологическими изменениями в ткани толстой кишки использовали окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и окрашивание альциановым синим периодической кислотой по Шиффу (AB-PAS). Кроме того, была проведена иммуногистохимическая оценка этих срезов для наблюдения за экспрессией белка ZO-1 в эпителиальных клетках толстой кишки (Ding et al., 2020). Подробная информация о подготовке образцов и вестерн-блоттинге для определения экспрессии белка IDO1 в толстой кишке и гиппокампе также описана в дополнительных материалах.

Композиционный анализ микробиоты кишечника

Высокопроизводительное секвенирование 16S рРНК было выполнено MajorBio Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а подробный метод и обработка данных показаны в дополнительных материалах.

статистический анализ

Данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовали для сравнения нескольких групп с использованием программного обеспечения SPSS 20.0. Различие считали значимым при p < 0,05.="" корреляции="" между="" кишечными="" микробами="" и="" некоторыми="" физиологическими="" факторами,="" связанными="" с="" депрессией,="" были="" проанализированы="" с="" использованием="" коэффициента="" корреляции="" спирмена="" на="" основе="" анализа="" тепловой="">

Полученные результаты

Химический анализ различных фракций, выделенных из ХТЭ

Основные компоненты были охарактеризованы с использованием UPLC-QTOF-MS (дополнительная таблица S2 и рис. S2), и в общей сложности был идентифицирован 21 компонент, в том числе 16 компонентов фенилэтаноидных гликозидов, 2 компонента фенольных гликозидов в CTE, TG и TG-. ФГ; и 3 компонента иридоидных гликозидов в CTE, TG и TG-IrG. В целом относительное содержание общих углеводов в ТП и ТО составило 60,3% и 80,8% соответственно. Относительное содержание суммы гликозидов в ТГ составило 87,7%. Соответственно, на долю фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов приходилось 86,7% и 53,4% TG-PhG и TG-IrG соответственно. Содержание эхинакозида, вербаскозида, изовербаскозида, 8-эпилогановой кислоты и генипозидиновой кислоты в каждой фракции показано в таблице 2, а хроматограмма ВЭЖХ и данные проверки метода перечислены в дополнительной таблице S3 и на рисунке S3.

Рис. 2. Влияние различных фракций, выделенных из CTE и типичных метаболитов микробиотой кишечника, на FST, TST, OFT у мышей.

Влияние различных фракций, выделенных из CTE и типичных метаболитов микробиотой кишечника, на поведенческие тесты отчаяния у мышей

Как показано на рис. 2, по сравнению с контрольной группой мыши, которым в течение 7 дней вводили имипрамин (положительный контроль), показали значительное сокращение времени неподвижности как в FST, так и в TST и не показали значительного влияния на общее расстояние, пройденное в OFT. . Подобные изменения также наблюдались в группах CTE, TG и HT, что указывает на то, что CTE, TG и HT проявляли антидепрессивную активность, и эти эффекты не были связаны с возбудимостью. Следовательно, TG и HT были доминирующей биоактивной фракцией, отделенной от CTE и типичных метаболитов кишечной микробиотой соответственно. Интересно, что после введения TG-PhG и TG-IrG не было выявлено существенных изменений во времени иммобилизации в FST по сравнению с контролем или в TST после введения TG-PhG, что указывает на то, что присутствие фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов может играют важную роль в антидепрессивной активности CTE.

Таблица 3 Влияние различных обогащенных гликозидами фракций и ГТ на FST, SPT и OFT у крыс CUMS.

Фармакодинамические эффекты и биохимические изменения различных обогащенных гликозидами фракций и ГТ на крысах CUMS

Как показано в Таблице 3, у крыс, подвергшихся 28-дневной парадигме CUMS, наблюдалось значительное снижение (p < 0.001)="" предпочтения="" сахарозы="" в="" spt,="" общего="" пройденного="" расстояния,="" и="" количество="" вставаний="" в="" oft,="" а="" также="" значительное="" увеличение="" (p="">< 0,01)="" общего="" времени="" неподвижности="" в="" fst="" по="" сравнению="" с="" контролем,="" что="" свидетельствует="" об="" индукции="" депрессивно-подобных="" фенотипов="" у="" крыс="" cums.="" депрессивные="" проявления="" были="" обращены="" вспять="" в="" группе="" flx="" (положительный="" контроль).="" аналогично,="" лечение="" cte,="" tg,="" tg-phg,="" tg-irg="" и="" ht="" приводило="" к="" восстановлению="" предпочтения="" сахарозы="" до="" нормального="" уровня="" у="" крыс="" cums,="" которые="" составляли="" 102,7%,="" 94,1%,="" 89,8%,="" 91,9%="" и="" 94,3%="" от="" нормы.="" управления="" соответственно.="" последовательно="" в="" группах="" fst,="" cte="" и="" tg="" проявлялись="" наиболее="" очевидные="" эффекты,="" а="" время="" иммобилизации="" достигло="" 103,3%="" и="" 93,4%="" от="" такового="" в="" контрольной="" группе="" соответственно,="" в="" то="" время="" как="" время="" иммобилизации="" в="" группах="" tg-phg,="" tg-irg="" и="" ht="" только="" что="" достигли="" 62,1%,="" 73,2%="" и="" 69,9%="" контрольной="" группы.="" аналогичное="" значительное="" увеличение="" (p="">< 0,05)="" наблюдалось="" в="" общем="" пройденном="" расстоянии="" и="" числе="" стоянок="" в="" oft="" после="" введения="" cte,="" tg="" и="" ht,="" а="" лечение="" tg-phg="" и="" tg-irg="" имело="" тенденцию="" к="" пересмотру="" числа="" стоянок="" у="" крыс="" cums.="" результаты="" показали,="" что="" тг="" является="" доминирующей="" биоактивной="" антидепрессантной="" фракцией,="" отделенной="" от="" хтэ,="" а="" фенилэтаноидные="" и="" иридоидные="" гликозиды="" незаменимы="" в="" проявлении="" его="" антидепрессивного="" эффекта.="" более="" того,="" показано,="" что="" гт="" является="" одним="" из="" активных="" метаболитов="" тг="" in="">

Соответственно, страдающие CUMS значительно повышали уровни CORT, CRF, ACTH, TNF-, IL-1 и IFN- в сыворотке и TNF- в гиппокампе крыс по сравнению с таковыми в контрольной группе (p< 0.05),="" resulting="" in="" significant="" reductions="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" (fig.="" 3).="" except="" for="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" level="" of="" hippocampal="" bdnf="" between="" flx="" and="" cums="" groups,="" the="" above-mentioned="" alterations="" in="" cums="" rats="" could="" be="" significantly="" reversed="" (p="" <="" 0.05)="" after="" administration="" of="" fluoxetine,="" cte,="" tg,="" and="" ht,="" indicating="" that="" cte,="" tg,="" and="" ht="" showed="" ameliorative="" effects="" on="" the="" hyperactivation="" of="" hpa="" axis,="" severe="" peripheral="" and="" neural="" inflammation,="" and="" deficiencies="" in="" 5-ht="" and="" bdnf.="" likewise,="" tg-irg="" and="" tgphg="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" levels="" of="" serum="" cort,="" tnf-α,="" ifn-γ,="" and="" hippocampal="" tnf-α,="" and="" increased="" the="" level="" of="" hippocampal="" 5-ht="" in="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05).="" significant="" decreases="" (p="" <="" 0.05)="" in="" the="" levels="" of="" serum="" crf="" and="" acth="" were="" also="" observed="" in="" the="" tg-irg="" group="" compared="" with="" cums="" group.="" interestingly,="" the="" levels="" of="" serum="" cort,="" tnf-α,="" acth,="" and="" crf="" in="" tg-phg="" and="" tg-irg="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" those="" in="" the="" tg="" group="" (p="" <="" 0.05),="" and="" the="" levels="" of="" hippocampal="" 5-ht="" and="" bdnf="" exhibited="" the="" opposite="" expression="" pattern="" (p="" <="" 0.05).="" these="" results="" showed="" that="" the="" effects="" of="" tg-phg="" and="" tg-irg="" on="" the="" hyperactivity="" of="" the="" hpa="" axis,="" peripheral="" and="" neural="" inflammation="" and="" shortage="" of="" 5-ht="" were="" clearly="" inferior="" to="" tg,="" indicating="" that="" phenylethanoid="" and="" iridoid="" glycosides="" might="" exert="" synergistic="" effects="" on="" the="" above-mentioned="" multiple="">

TG и HT регулируют ось HPG и метаболизм циклических нуклеотидов у крыс CUMS.

Были измерены уровни Т, ГнРГ, цАМФ и цГМФ, а также соотношение цАМФ и цГМФ (цАМФ/цГМФ) в сыворотке, подвергнутой CUMS, и результаты показаны в таблице 4. Концентрации Т, ГнРГ, цАМФ, и цАМФ/цГМФ в сыворотке были значительно снижены, а уровень цГМФ значительно повышен (p < 0.05)="" в="" группе="" cums="" по="" сравнению="" с="" контролем,="" что="" указывает="" на="" то,="" что="" воздействие="" cums="" привело="" к="" подавление="" оси="" hpg="" и="" дисфункция="" метаболизма="" циклических="" нуклеотидов.="" по="" сравнению="" с="" группой="" cums="" в="" группе="" flx="" не="" было="" значительных="" изменений.="" удивительно,="" но="" после="" лечения="" тг="" и="" гт="" наблюдалось="" значительное="" повышение=""><{5}}.05) уровней="" сывороточного="" т,="" гнрг,="" цамф="" и="" цамф/цгмф,="" в="" то="" время="" как="" уровень="" сывороточного="" цгмф="" значительно="" снижался="" (p="">< 0,05).="" эти="" результаты="" показали,="" что="" tg="" и="" ht="" регулируют="" ось="" hpg="" и="" метаболизм="" циклических="" нуклеотидов,="" что="" явно="" превосходит="" флуоксетин="" в="" положительном="">

Рис. 3. Влияние различных обогащенных гликозидами фракций и ГТ на уровни КОРТ, АКТГ, КРФ, ФНО-, ИЛ-1, ИФН- в сыворотке крови и 5-ГТ, BDNF, ФНО- в гиппокампе крыс CUMS.

ТГ и ГТ облегчают незначительное воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера у крыс CUMS.

Окрашивание гематоксилином и эозином использовалось для оценки морфологического повреждения толстой кишки, и между экспериментальными группами не наблюдалось существенных различий в толстой кишке (рис. 4а). Кроме того, также были проанализированы эффекты ТГ и ГТ на воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера (рис. 4b-d). По сравнению с контрольной группой количество бокаловидных клеток и толщина слизистого слоя были уменьшены в группе CUMS. Соответственно, экспрессия белка ZO-1 и уровни IFN- и TNF- в толстой кишке были значительно снижены (p < 0.05)="" и="" повышены="" (p="">< {="" {13}}.05),="" соответственно,="" предполагая,="" что,="" хотя="" явных="" гистологических="" повреждений="" не="" было,="" воздействие="" cums="" приводило="" к="" вялотекущему="" воспалению="" в="" толстой="" кишке="" и="" нарушению="" кишечного="" барьера.="" после="" лечения="" флуоксетином,="" тг="" и="" гт="" количество="" бокаловидных="" клеток="" и="" толщина="" слизистого="" слоя="" увеличивались,="" а="" уровни="" ifn-="" и="" tnf-="" в="" толстой="" кишке="" достоверно="" снижались="" (p="">< 0,05).="" кроме="" того,="" тг="" и="" гт="" значительно="" повышали="" (p="">< 0,05)="" экспрессию="" белка="" zo-1="" до="" уровня,="" аналогичного="" таковому="" в="" контрольной="" группе.="" эти="" результаты="" показали,="" что="" tg="" и="" ht="" могут="" облегчить="" слабое="" воспаление="" в="" толстой="" кишке="" и="" нарушение="" кишечного="" барьера="" у="" крыс="">

Таблица 4 Влияние TG, HT или флуоксетина на гормоны, связанные с осью HPG, и показатели, связанные с метаболизмом нуклеотидов, в сыворотке крыс CUMS.

Влияние ТГ и ГТ на состав микробиоты кишечника

После удаления неквалифицированных последовательностей было получено в общей сложности 1 874 721 эффективное чтение. Результаты альфа-разнообразия (рис. 5а) и бета-разнообразия (рис. 5б) показали, что, хотя богатство (Чао) и разнообразие (Шеннон) кишечной микробиоты в содержимом слепой кишки не различались, общая структура кишечной микробиоты в график анализа основных координат (PCoA) показал поразительную разницу между контрольной группой и группой CUMS. Более того, лечение ТГ и ГТ значительно увеличило бактериальное богатство крыс CUMS и вызвало заметные различия на графике PCoA по сравнению с таковыми у крыс CUMS, демонстрируя явное сходство с контролем, особенно при анализе ТГ.

Таксономические изменения в микробиоте также подтвердили, что ТГ оказывает существенное регулирующее влияние на состав микробиоты кишечника. После введения ТГ количество большинства измененных таксонов у крыс CUMS возвращалось на уровень, близкий к таковому в контрольной группе. Значительное снижение (14,2 %, p < 0,05)="" и="" обогащение="" (53,6="" %,="">< 0.05)="" in="" the="" abundances="" of="" the="" phylum="" firmicutes="" and="" bacteroidetes="" were="" observed="" in="" the="" tg="" group="" compared="" with="" cums="" group="" (fig.="" 5c),="" respectively.="" consistently,="" at="" the="" family="" level="" (supplementary="" table="" s4),="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae="" (phylum="" firmicutes)="" and="" peptococcaceae="" (phylum="" firmicutes)="" by="" 33.9%="" and="" 82.9%,="" respectively,="" compared="" with="" cums="" group="" (p="" <="" 0.05).="" conversely,="" significant="" enrichments="" in="" the="" abundances="" of="" family="" erysipelotrichaceae="" (phylum="" firmicutes,="" 78.4%,="" p="" <="" 0.05)="" and="" muribaculaceae="" (phylum="" bacteroidetes,="" 77.3%,="" p="" <="" 0.05)="" existed="" in="" tg="" group.="" consistently="" at="" the="" genus="" level="" (fig.="" 5d),="" the="" abundances="" of="" anaerotruncus,="" harryflintia,="" ruminiclostridium_9,="" unclassified_f_ruminococcaceae="" (members="" of="" the="" family="" ruminococcaceae),="" and="" peptococcus="" (a="" member="" of="" the="" family="" peptococcaceae)="" were="" significantly="" decreased="" while="" norank_f_erysipelotrichaceae,="" allobaculum,="" dubosiella="" (members="" of="" the="" family="" erysipelotrichaceae)="" and="" norank_f_muribaculaceae="" (a="" member="" of="" the="" family="" muribaculaceae)="" displayed="" higher="" abundances="" in="" tg="" group="" than="" those="" of="" cums="" group="" (p="">< 0.05).="" in="" addition,="" tg="" decreased="" the="" abundances="" of="" tyzzerella_3,="" acetatifactor,="" and="" norank_f_lachnospiraceae="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae="" (p="" <="" 0.05),="" although="" the="" abundance="" of="" the="" family="" lachnospiraceae="" was="" similar="" across="" all="" experimental="" groups.="" unlike="" tg,="" ht="" decreased="" the="" abundances="" of="" partially="" altered="" taxa="" induced="" by="" cums,="" including="" the="" family="" ruminococcaceae,="" 3="" genera="" (anaerotruncus,="" harryflintia,="" and="" ruminiclostridium_9)="" assigned="" to="" the="" family="" ruminococcaceae="" and="" 2="" genera="" (tyzzerella_3,="" acetatifactor)="" assigned="" to="" the="" family="" lachnospiraceae.="" additionally,="" converse="" variations="" were="" observed="" in="" the="" abundances="" of="" ruminococcaceae_ucg_013="" and="" streptococcus="" in="" the="" ht="" group.="" these="" results="" indicated="" that="" tg="" and="" ht="" exerted="" clear="" differences="" in="" the="" regulation="" of="" gut="" microbiota="" composition,="" and="" the="" effect="" of="" tg="" was="" superior="" to="" that="" of="" tg="" especially="" in="" altering="" the="" genera="" assigned="" to="" the="" family="" erysipelotrichaceae,="" peptococcaceae,="" and="">

Рис. 4. Влияние ТГ, ГТ или флуоксетина на морфологические изменения, экспрессию белка ZO-1, концентрацию IFN- и TNF- в толстой кишке крыс CUMS.

Корреляционный анализ измененных микробных родов, затронутых TG и HT, гормонами, связанными с осью HPA, провоспалительными цитокинами, 5- HT и BDNF

Для выяснения связи между изменениями в составе микробиоты кишечника под влиянием ТГ и ГТ и соответствующими признаками, связанными с депрессией, был проведен корреляционный анализ Спирмена. Как показано на рис. 6, уровни 5-HT и BDNF в гиппокампе значимо положительно коррелировали только с норангом_f_Muribaculaceae. В противном случае можно было бы выявить четкие корреляции между измененными микробными родами и гормонами, связанными с оси HPA. В частности, Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae, norank_f_ Erysipelotrichacea и Peptococcus были тесно связаны с функцией оси HPA. CORT, CRF и АКТГ в сыворотке имели отрицательную корреляцию с Dubosiella, norank_f_Muribaculaceae и norank_f_Erysipelotrichacea и положительную связь с Peptococcus. Кроме того, Dubosiella и norank_f_ Erysipelotrichacea демонстрировали отрицательную связь с IFN- и гиппокампальным TNF- в толстой кишке, в то время как аналогичные отношения существовали у Allobaculum, Harryfinita, сывороточного и гиппокампального TNF-, а также у norank. _f_Lachnospiracea и сывороточные IFN- и TNF-. Напротив, Peptococcus был положительно связан с TNF- и TNF- в толстой кишке. Аналогично, norank_f_Muribaculaceae был положительно связан с сывороточными IFN- и TNF-. Эти результаты показали, что измененные микробные роды, особенно некоторые роды, принадлежащие к семействам Erysipelotrichaceae, Peptococceae и Muribaculaceae, которые были специфически затронуты ТГ, показали сильные ассоциации с гормонами, связанными с осью HPA, и провоспалительными цитокинами одновременно, демонстрируя критическую роль микробиоты кишечника в регуляции функции оси HPA и воспаления.

цистанхе пропиадады

ТГ и ГТ ингибируют метаболизм триптофана-кинуренина у крыс CUMS.

Определено влияние ТГ и ГТ на уровни триптофана и кинуренина в сыворотке крови крыс, а также на экспрессию IDO1 в толстой кишке и гиппокампе. Как показано на рис. 7 и рис. 8, по сравнению с контрольной группой уровень триптофана в сыворотке был значительно снижен в группе CUMS, в отличие от повышенного уровня кинуренина и отношения кинуренина к триптофану (Kyn /Trp) и экспрессия белка IDO1 в толстой кишке и гиппокампе. По сравнению с группой CUMS сывороточный Kyn/Trp в группе FLX был значительно снижен (p< 0.05).="" tg="" and="" ht="" treatment="" resulted="" in="" a="" significant="" increase="" in="" the="" serum="" tryptophan="" level="" in="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05),="" and="" a="" decrease="" in="" the="" levels="" of="" serum="" kynurenine="" and="" kyn/trp="" (p="" <="" 0.05).="" in="" addition,="" tg="" significantly="" inhibited="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" colon="" of="" cums="" rats="" (p="" <="" 0.05),="" while="" a="" non-significant="" difference="" in="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" hippocampus="" was="" observed="" between="" cums="" and="" tg="" groups.="" however,="" the="" effect="" of="" ht="" on="" the="" expression="" of="" ido1="" protein="" in="" the="" colon="" and="" hippocampus="" was="" contrary="" to="" that="" of="" tg,="" indicating="" that="" tg="" and="" ht="" inhibited="" tryptophan-kynurenine="" metabolism="" by="" decreasing="" the="" expression="" of="" ido1="" in="" the="" colon="" and="" hippocampus="" of="" cums="" rats,="">

Рис. 5. Анализ разнообразия, состава и различий микробиоты кишечника в образцах слепой кишки.

Обсуждение

В этом исследовании две разные модели животных использовались для скрининга биоактивных соединений в CT, которые впервые облегчают депрессивное поведение. TP и TO, скорее всего, были неэффективными ингредиентами при CTE, в то время как TG продемонстрировал наибольший потенциал в лечении депрессии. Предыдущие исследования CT, а также растений Cistanche в основном были сосредоточены на биологической активности фенилэтаноидных гликозидов с самым высоким содержанием и игнорировали важность иридоидных гликозидов и других менее распространенных ингредиентов. Интересно, что наше исследование показало, что фенилэтаноидные и иридоидные гликозиды продемонстрировали синергетическое действие на гиперактивность оси HPA, тяжелое периферическое и нервное воспаление и дефицит 5-HT и BDNF в гиппокампе, что может быть важной причиной преимуществ антидепрессантов. эффект ТГ. Эти результаты также свидетельствуют о многокомпонентных и многоцелевых характеристиках фитотерапии и напоминают нам о том, что компоненты с более низким содержанием, даже микроэлементы, также могут играть ключевую роль в фармакологическом эффекте.

Хронический стресс вызывает гиперактивность оси HPA, которая способствует возникновению депрессии, а также подавление оси HPG за счет снижения высвобождения GnRH и/или чувствительности гипофиза к GnRH (Kirby et al., 2009). Между тем, цАМФ и цГМФ являются важными промежуточными узлами, которые зависят от многих нейротрансмиттеров и гормонов для проявления своих физиологических эффектов (Siawrys et al., 2002). Недавние исследования последовательно показали, что возникновение дефицита почек-ян тесно связано с дисфункцией оси гипоталамус-гипофиз-мишень (Zhang et al., 2019). При синдроме почечной недостаточности также наблюдалось заметное снижение уровней цАМФ и цАМФ/цГМФ в сыворотке. В этом исследовании мы обнаружили, что TG может ингибировать уровни CORT, CRF и ACTH в сыворотке, а также повышать содержание T и GnRH в сыворотке у крыс CUMS, что указывает на восстановление дисфункции оси HPA и HPG после введения TG. Кроме того, ТГ обратил вспять значительное снижение уровня цАМФ/цГМФ в сыворотке у крыс, подвергшихся CUMS. Таким образом, потенциальный механизм, лежащий в основе КТ при лечении депрессии и недостаточности почечной Ян, может быть частично схожим и заслуживает дальнейшего изучения. Кроме того, производство сексуального желания и поведения представляет собой сложный нервный рефлекторный процесс. Половые гормоны являются основными источниками центрального сексуального возбуждения, а недостаток половых гормонов может вызывать снижение полового влечения или сексуальную дисфункцию (Holloway and Wylie, 2015). В частности, чрезмерная 5-ГТ ингибирует высвобождение ГнРГ, что является основной причиной возникновения хронической сексуальной дисфункции после длительного лечения СИОЗС (Prasad et al., 2015). В нашем исследовании флуоксетин (представитель СИОЗС) был неэффективен при дисфункции оси HPG. Однако, хотя ТГ значительно улучшал уровень 5-HT в гиппокампе, также наблюдались аналогичные изменения уровней Т и ГнРГ в сыворотке, что улучшало подавление оси ГГГ. Эти результаты демонстрируют явное преимущество КТ в лечении депрессии, и внутренний механизм, ответственный за эти эффекты, нуждается в дальнейшем изучении.

Все больше данных свидетельствует о том, что кишечник является потенциальной мишенью для лечения хронических заболеваний с использованием природных соединений с низкой биодоступностью (Zhou et al., 2020). Недавние исследования (Wei et al., 2019) показали, что лечение CUMS вызывает изменения фекального микробиома и дефекты кишечного барьера, которые облегчают бактериальную инвазию в слизистую оболочку толстой кишки и усугубляют воспалительные реакции в толстой кишке. В соответствии с этим отчетом наши результаты показали, что 4 недели воздействия CUMS вызывали обширное истощение количества бокаловидных клеток и толщины слоя слизи в толстой кишке крыс, а также начало нарушения кишечного барьера, представленного повышенной проницаемостью кишечника, что определялось измерение белка ZO-1. Кроме того, в толстой кишке наблюдали повышенную экспрессию провоспалительных факторов (таких как TNF- и IFN-). Соответственно, эти результаты показали, что, хотя явных гистологических повреждений не было, лечение CUMS инициировало воспаление толстой кишки и нарушение кишечного барьера. Предыдущие исследования показали, что КТ повышает эффективность профилактики колита, вызванного DSS, у мышей (Jia et al., 2014). Непоследовательно, было также показано, что ТГ облегчает слабое воспаление в толстой кишке и нарушение кишечного барьера у крыс CUMS, что подчеркивает его потенциал для клинического лечения заболеваний, связанных с воспалением толстой кишки.

Обширные исследования также показали, что взаимосвязь, связывающая комменсальную микробиоту кишечника, ось HPA и воспаление, является сложной и играет решающую роль в развитии депрессии (Misiak et al., 2020). Изменения в составе микробиоты кишечника могут способствовать усиленному высвобождению цитокинов и синтезу малых биоактивных молекул (Du et al., 2020). Некоторые цитокины (такие как TNF-) могут проходить через гематоэнцефалический барьер и являются мощными активаторами оси HPA (Misiak et al., 2020). В свою очередь, гиперактивация оси HPA может способствовать дисбиозу микробиоты кишечника, хроническому воспалению в толстой кишке и изменению проницаемости кишечника (Misiak et al., 2020). В соответствии с предыдущими исследованиями, модификация кишечной микробиоты с помощью ТГ, вероятно, отвечает за ее облегчающее действие на депрессию. Мы заметили, что TG изменяет обилие микробных таксонов на разных уровнях у крыс, подвергшихся CUMS, до уровня, аналогичного контрольной группе. В частности, было обнаружено, что основные измененные роды, принадлежащие к семействам Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae и Muribaculaceae, сильно коррелируют с осью HPA и воспалением. В соответствии с нашими результатами сообщается, что семейства Peptococcaceae, Erysipelotrichaceae и Muribaculaceae играют важную роль в поддержании целостности слизистого барьера и возникновении воспаления (Kankoush, 2015; Borton et al., 2017; Zhang et al., 2020). Поэтому мы предположили, что ТГ может сдерживать обилие некоторых родов, отнесенных к семействам Erysipelotrichacea, Peptococceae и Muribaculaceae, впоследствии облегчая слабовыраженное воспаление в толстой кишке, гиперактивность оси HPA и нарушение целостности слизистого барьера. Интересно, что в нашем исследовании только один род, названный nor ank_f_Muribaculaceae, коррелировал с 5-HT и BDNF в гиппокампе. Конкретный механизм связи остается неясным и требует дальнейшего изучения. В противном случае результаты также предполагают, что большинству измененных родов, вызванных TG, чрезвычайно трудно напрямую влиять на уровни 5-HT в гиппокампе. Чтобы объяснить, как изменения в составе кишечной микробиоты влияют на уровень 5-HT гиппокампа после лечения TG, наше внимание привлекла сложная взаимосвязь, связывающая метаболизм триптофана, ось HPA, воспалительные цитокины и 5-HT. Триптофан является незаменимой аминокислотой для человека, и менее 1 процента используется в синтезе белка, при этом большая часть (более 90 процентов) преобразуется IDO1 и триптофаном 2,3-диоксигеназой 2 (TDO2) в кинуренин, и примерно 5 процентов управляются триптофангидроксилазой по пути серотонина (Duan, et al., 2018). Уровень 5-HT в мозге в значительной степени зависит от периферической доступности триптофана, учитывая, что триптофан транспортируется в мозг через транспортеры нейтральных аминокислот (Duan et al., 2018). IDO1, скорость-лимитирующий фермент на первом этапе кинуренинового пути, в основном индуцируется IFN- и другими провоспалительными цитокинами, такими как IL-1 и TNF- (Kennedy et al., 2017). которые, как было показано, связаны с микробиотой кишечника в нашем исследовании. Как сообщалось, большее количество триптофана метаболизируется через кинурениновый путь, тем самым конкурентно снижая превращение триптофана в 5-HT и связывая это со снижением 5-HT, обычно наблюдаемым при депрессии (O'Mahony et al., 2015). Таким образом, более низкие уровни триптофана и более высокие Kyn/Trp являются общими и совпадают с повышенным риском депрессивного настроения. После введения ТГ сверхэкспрессия IDO1 в толстой кишке ингибировалась, что приводило к повышению уровня триптофана в сыворотке и снижению сывороточного Kyn/Trp, что выявило потенциальную связь между кишечной микробиотой и уровнем 5-HT в гиппокампе, на которые воздействовал ТГ. Между тем, BDNF, член семейства нейротрофинов, необходим для дифференцировки клеток, выживания нейронов, образования синапсов и процессов нейропластичности при депрессии (Greenberg et al., 2009). Недавние исследования показали, что BDNF тесно связан с барьерной функцией слизистой оболочки кишечника и кишечной микробиотой (Maqsood and Stone, 2016). Кроме того, сообщалось, что изменения в микробиоте кишечника могут повышать уровень экспрессии BDNF и, таким образом, влиять на развитие депрессивного поведения (Du et al., 2020). Однако, подобно вариациям 5-HT, для большинства измененных родов, вызванных TG в нашем исследовании, было крайне невозможно непосредственно влиять на уровни BDNF в гиппокампе, и внутренняя молекулярная связь и механизм нуждаются в дальнейшем изучении.

Напротив, HT, метаболит TG в кишечной микробиоте, также проявлял антидепрессивный эффект в настоящем исследовании, что согласуется с его преимущественным нейропротекторным действием (Hu et al., 2014). Вызывает обеспокоенность, что ГТ может также снижать уровень провоспалительных цитокинов, гормонов, связанных с осью ГГН и ГГГ, и концентрации 5-ГТ в гиппокампе до уровня, сходного с контрольным уровнем у крыс CUMS, в то время как большинство измененных микробных родов затрагивали при ГТ имел слабую корреляцию с вышеуказанными физиологическими показателями, что свидетельствует о том, что кишечная микробиота не может быть мишенью антидепрессивной активности ГТ. Кроме того, ГТ подавляла сверхэкспрессию IDO1 в гиппокампе, но не в толстой кишке, что сопровождалось повышением уровня триптофана в сыворотке. Возникновение очевидных различий между ТГ и ГТ может быть связано с отличным всасыванием ГТ в кровоток и способностью ГТ преодолевать гематоэнцефалический барьер (Robles-Almazan et al., 2018), что также указывает на то, что сильная метаболическая способность кишечной микробиоты особенно важна для антидепрессивной активности ТГ, помимо его физиологических функций. Следовательно, мы предварительно доказали, что двунаправленное взаимодействие фитохимических веществ и кишечной микробиоты играет решающую роль в лечении депрессии введением ТГ (как показано на рис. 9).

Цистанхе Пищевые добавкиигратьрешающую роль в лечении депрессии.

Для получения дополнительной информации, пожалуйста, нажмите

Вывод

Таким образом, ТГ в основном отвечает за антидепрессивную активность ХТ, что отражается в синергическом действии фенилэтаноидных и иридоидных гликозидов на гиперактивацию ГГН, тяжелое периферическое и нервное воспаление, а также дефицит 5-ГТ и BDNF в организме. гиппокамп. Кроме того, потенциальный молекулярный механизм антидепрессивного действия ТГ был достигнут за счет двунаправленного взаимодействия фитохимических веществ и кишечной микробиоты. Кроме того, улучшение подавленной оси HPG и аномалии циклических нуклеотидов с помощью TG и HT, которые не регулировались лечением СИОЗС, представленным флуоксетином, указывало на явное преимущество CT в лечении депрессии. Такие модуляции представляют собой многообещающую стратегию лечения депрессии с использованием КТ и аналогичных традиционных растительных лекарственных средств.