Влияние китайской травяной медицины Cistanche на раннее развитие эмбриона и плода
Mar 08, 2022
Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com
Ли Юфан 1, Сюй Циньвэй 2, Чжан Ли 2, Чжан Вэньчан 2, Фэн Шутан 3*
[Абстрактный]Использовать свиньюэмбрионыот экстракорпорального оплодотворения для исследований и сравнения. Эффект от добавлениякитайский языклекарственное средствоингредиентыЦистанхеи астрагал к развитиюранние эмбрионыв среде NCSU{{0}} было доказано. Эксперимент показал, что: (1) Объемное соотношение 0,10 процентаЦистанхеи 0.10 процентов астрагала добавляли в культуральный бульон, аЦистанхеГруппа добавления. Частота бластоцист (15,76%) была значительно выше, чем в контрольной группе (9,26%) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), указывающее, чтоЦистанхепустыняможет значительно способствоватьранний эмбриональныйразработка. (2) Когда концентрация (об./об.)Цистанхесоставляет {{0}}.05 процентов и 0,10 процента, частота бластоцист (17,02 процента и 16,75 процента) значительно выше, чем в контрольной группе (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">китайский языклекарственное средствоЦистанхев культуральной среде на стадии 2-клеток скорость развития бластоцисты (13,81%) была значительно выше, чем на стадии 4-клеток (7,53%) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Цистанхеbefore cleavage (13.67%) ) Is slightly higher, but the difference is not obvious (P>0.05).
Из-за различий в условиях развития in vivo и in vitro,эмбрионыбудут повреждены свободными радикалами во время культивирования in vitro ранних свинейэмбрионы, вызывая нарушение клеточного метаболизма или повреждение ДНК, РНК и белков [1]. Чтобы еще больше повысить скорость оплодотворения in vitro с помощью замороженной спермы, в этом эксперименте изучалось добавление определенной концентрацииЦистанхеи астрагал для улучшениязародышсреда разработки in vitro.
1. Материал и методы
1. 1 Условия культивирования:
Созревание свиных ооцитов in vitro, оплодотворение in vitro и культивирование ранних эмбрионов in vitro проводились в инкубаторе с 5% CO2 и максимальной насыщенной влажностью 39 градусов.
1.2 Реагенты и питательная среда:
Базальная жидкость для созревания ооцитов представляет собой NCSU{{0}}, жидкость для промывки ооцитов представляет собой жидкость PVA-TL-HEPES, жидкость для оплодотворения представляет собой трис-буфер (mTBM), содержащий 0,1% BSA, и жидкость для промывания спермы - это жидкость Dubecco с 0,1% BSA. Забуференный фосфатом физиологический раствор (DPBS), жидкость для размораживания сперматозоидов представляет собой BTS, жидкость кумулюса представляет собой 1 мг/мл гиалуронидазы PBS, рабочая жидкость для ооцитов представляет собой забуференный HEPES NCSU-23, а базовая культуральная жидкость для ранних эмбрионов дополнена 0 0,4 процента BSA NCSU-23, добавьте (V/V) 0,05 процента ~0,15 процента Cistanche по мере необходимости, используйте BTS для размораживания спермы. Перед использованием предварительно нагрейте и уравновешивайте в течение более 4 часов в инкубаторе, содержащем 5% СО2 в воздухе и максимальную насыщенную влажность 39 градусов [2].
1.3 Метод кипячения китайского лекарства Цистанхе:
Раствор цистанхе: возьмите 5 г и поместите его в химический стакан на 100 мл, добавьте сверхчистую воду и погрузите его в сверхчистую воду, кипятите на сильном огне и кипятите в течение 20 минут, затем соберите суп; повторите вышеуказанный процесс, соберите 3 раза подряд, постоянный объем до 100 мл, запасной фильтр 0,22 мкм. Раствор астрагала: взять 5 г и поместить в стакан на 100 мл, залить сверхчистой водой и погрузить, кипятить на сильном огне и кипятить 20 минут, затем собрать лекарственный отвар; повторите описанный выше процесс, соберите 3 раза подряд, установите объем на 100 мл, запасной фильтр 0,22 мкм.
Китайская медицинаТравяной:Цистанхе
1.4 Созревание свиных ооцитов in vitro:
Яичники свиноматок были собраны на пекинской скотобойне Pengcheng, помещены в 0,9-процентный физиологический раствор, содержащий антибиотики, при температуре около 38 градусов, доставлены обратно в лабораторию в течение 4 часов и трижды промыты физиологическим раствором. Используйте шприц на 10 мл с иглой калибра 12- для извлечения ооцитов с фолликулами диаметром 2-6 мм на поверхности яичника. Промойте 3–4 раза раствором TL-HEPES и 3–4 раза раствором NCSU-23, который уравновешивали в инкубаторе с углекислым газом в течение более 4 часов. Перенесите 20–30 ооцитов в виде группы в 100 мкл, добавьте капли 10% PFF, 10 МЕ/мл HCG, 10 МЕ/мл PMSG, 10 нг/мл EGF NCSU-23 и культивируйте в течение примерно 22 часов. среду в капли NCSU-23 с 10 процентами PFF, 10 нг/мл EGF и продолжают культивирование в течение 44~46 часов[3].
1.5 Капацитация сперматозоидов и экстракорпоральное оплодотворение:
Приготовьте раствор mTBM без кофеина и БСА и уравновешивайте его в течение 48 часов в инкубаторе с 5% CO2 и максимальной насыщенной влажностью 39 градусов, регулируя значение pH в диапазоне 7,2~7,8; добавьте кофеин и БСА за 44 часа до использования и продолжайте уравновешивать. Сперму проверяли на качество, 1 мл центрифугировали при 9{29}}0 об/мин в течение 3 мин, добавляли 10 мл раствора DPBS, содержащего 0,1% БСА, для суспензии и центрифугировали при 900 об/мин в течение 3 мин [3]; после того, как 1 мл раствора TBM был суспендирован, он был наклонен на 60 градусов. Обработка сбора энергии вверх по течению проводится в инкубаторе с 5-процентным содержанием CO2 в воздухе и максимальной насыщенной влажностью 39 градусов в течение 1 часа [3-5]. Комплекс ооцит-кумулюс, который созревает до 44~46, помещают в раствор для промывки ооцитов, содержащий 0,1% гиалуронидазы, клетки кумулюса удаляют пипетированием, а затем ооциты подвергают воздействию. Промойте 3 раза в сбалансированном TBM и, наконец, поместите каждую 10-15 штук в группу по 50 мкл TBM и дождитесь спермы [6, 7]. Введите 50 мкл восходящей спермы из капацитации в каплю ооцитов, содержащих ТБМ, и выполните оплодотворение в течение 6 часов в инкубаторе с 5% CO2 и максимальной насыщенной влажностью 39 градусов.
1.6 Раннее развитие и обнаружение оплодотворенных яиц:
Через 6 часов после оплодотворения ооциты обрабатывали NCSU-23, забуференным рабочей жидкостью HEPES, или NCSU- 23 с 0,4% BSA в жидкости для культивирования эмбрионов. 23 Промойте 3 раза, замените среду на сбалансированную каплю 0.4% BSA NCSU-23 и инкубируйте более 8 дней. Проверьте скорость разделения гипотетических оплодотворенных яиц на 2-й день, проверьте скорость морулы (плюс скорость бластоцисты) на 6-й день и проверьте скорость бластоцисты на 8-й день [8]. Все были осмотрены и записаны под зеркалом тела.
1.7 Экспериментальный план:
1.7.1 Влияние ингредиентов традиционной китайской медицины Цистанхе на раннее развитие эмбриона.
Учжишаньская свинья [8] После капацитации, экстракорпорального оплодотворения, оплодотворение завершается, и после дробления происходит обмен эмбрионов до тех пор, пока они не будут добавлены к 0,1 процента (об./об.). Цистанхе, 0,1% астрагала и NCSU-23 (0,4% BSA) без важных ингредиентов (пустая группа) выращивали для наблюдения за развитием оплодотворенных яиц и ранних эмбрионов. , и судить о влиянии двух компонентов традиционной китайской медицины на раннее развитие эмбриона in vitro Влияние.
1.7.2 Влияние концентрации Цистанхе на раннее развитие эмбрионов.
Сперма свиней Wuzhishan капацитируется и подвергается экстракорпоральному оплодотворению. После завершения оплодотворения жидкость меняется на {{0}} процентов (пустая группа), 0.05 процентов, 0.1 процентов и 0,1 процента соответственно. В 15% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA) наблюдайте за развитием оплодотворенных яйцеклеток и оценивайте влияние различных концентраций компонента китайской медицины Cistanche на раннее развитие эмбриона in vitro.
1.7.3 Влияние периода добавления цистанхе на раннее развитие эмбриона.
Сперма свиней Wuzhishan капацитируется и подвергается экстракорпоральному оплодотворению. После окончания оплодотворения оплодотворенная яйцеклетка расщепляется до {{0}}клеточной стадии, а оплодотворенная яйцеклетка расщепляется до 4-клеточной стадии, жидкость обменивается и добавляется отдельно. 0.1% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), наблюдайте за развитием оплодотворенных яйцеклеток и оценивайте влияние добавления цистанхе на раннее развитие эмбриона in vitro на разных стадиях.
1.8 Статистический анализ:
Используйте тест SPSS13.0 хи-квадрат (χ2) и однофакторный дисперсионный анализ.
2. Результат анализа
2. 1 Влияние ингредиентов традиционной китайской медицины на раннее эмбриональное развитие
As shown in Table 1, in the Cistanche and Astragalus group, the morula rate was not significantly different from that of the blank group (P>0.05). Частота бластоцист в двух группах была выше, чем в контрольной группе, а частота бластоцист в группе Cistanche отличалась от таковой в контрольной группе. Значительный (П<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">
2.2 Влияние концентрации ингредиента китайской медицины Цистанхе на раннее эмбриональное развитие
Как показано в Таблице 2, добавление цистанхе в объемной концентрации от 0.05 процентов до 0,10 процентов в культуральную жидкость эмбриона оказывает лучший стимулирующий эффект на замороженную жидкость спермы WZSP для эмбрионов, оплодотворенных in vitro. , а скорость развития бластоцист значительно отличается от контрольной группы (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">
2.3 Влияние периодического добавления ингредиента китайской медицины Цистанхе на раннее эмбриональное развитие
As shown in Table 3, after testing and analysis, the addition of Cistanche at a volume concentration of 0.10% at the 2-cell stage has a better-promoting effect on the WZSP frozen sperm liquid in vitro fertilization-embryo, and there is no significant difference from the addition before the cleavage (P>0.05). Однако была значительная разница по сравнению с добавлением 4 клеток (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">
3. Обсуждение
По сравнению с нормально развивающимсяэмбрионыin vivo, среда развития ЭКО оплодотвореннаяэмбрионысущественно отличается. В процессезародышросте и делении образуется большое количество No., свободных радикалов и некоторых токсических веществ, что неблагоприятно для роста зародыша. Нормально развивающиеся в организме зародыши могут устранять эти неблагоприятные факторы за счет метаболизма внутренней среды; эти неблагоприятные факторы всегда будут накапливаться в среде роста эмбриона при экстракорпоральном оплодотворении. Традиционныйкитайский языклекарственное средствоингредиентЦистанхеможет иметь функцию снижения концентрации и устранения некоторых свободных радикалов, чтобы еще больше повысить скорость развития экстракорпорального оплодотворения с помощью замороженной спермы. В эксперименте изучалось добавление определенной концентрацииЦистанхеи Астрагал. Результаты подтвердили, что астрагал не оказывает эффективного влияния на улучшение среды культивирования in vitro. Надлежащая концентрацияЦистанхеоказывает определенное стимулирующее действие наранний эмбрионразвития, но при концентрацииЦистанхепревышает определенную концентрацию, он также оказывает ингибирующее действие назародышразработка.
Далее мы исследовали различные эффектыЦистанхе, традиционныйкитайский языклекарственное средствокомпонент на разных этапах, и эксперимент показал, чторанние эмбрионыимеют более высокую скорость развития на более поздних стадиях, когдацистанхедобавляется на этапе 2-ячейки. Возможная причина связана с внешней средой рецептора. Оксид азота (NO) является сигнальной молекулой и цитотоксическим фактором с широким спектром биологической активности. Влияние NO наранний эмбрионразвитие следует проследить доранний эмбриональныйстадии развития, которая может быть вызвана одной из причин 2-клеточной блокады (2-клеточной блокады) в культуре эмбрионов млекопитающих, а in vitro блокада свиней происходит на 4-клеточной стадии [ 9]. Добавление традиционныхкитайский языклекарственное средствоингредиенты могут устранить свободный радикал NO в определенной степени и смягчить неблагоприятные факторызародышроста [10].
Цистанхе
использованная литература
[1] Компорт М. Три модели клеточной ярости, вызванной свободными радикалами [J]. Chem Biol Interact, 1989, 72(1/2):1- 56.
[2] Пан Денгке. Изучение факторов, влияющих на развитие клонированных соматических клеток свинейэмбрионы[Д]. Пекин: Китайский сельскохозяйственный университет, 2005.
[3] Чжан Юньхай. Исследования по производству клонированных свинейэмбрионыс использованием технологии переноса ядер соматических клеток [D]. Пекин: Китайский сельскохозяйственный университет, 2005.
[4] Лу Шэншэн, Чжан Яньлин, Ши Дэшун и др. Влияние добавления бычьей сыворотки и свиной фолликулярной жидкости во время созревания на ядерное созревание ооцитов свиньи иранний эмбриональныйразвитие после экстракорпорального оплодотворения [J]. Животноводство и ветеринария провинции Хэйлунцзян, 2002 г., (8):1- 3.