Абстрактный:С использованиемCistanche DeserticolaПаразитируя два растения-хозяина (Haloxylon Ammodendron и Atriplex Canescens) в качестве испытательных материалов, это исследование определило содержание полисахарида у C. deserticola от разных хозяев с использованием метода феноло-серых кислоты. Секвенирование транскриптома и анализ галоксилон-ираниш иAtriplex-Cistanche ассоциациибыли проведены с использованием платформы секвенирования Illumina Novaseq 6000. Исследование было сосредоточено на изучении различий в транскриптоме в C. deserticola от разных хозяев, скрининга ключевых ферментативных генов, участвующих в метаболизме полисахаридов, и проверка выбранных генов посредством проверки QRT-PCR. Это исследование направлено на то, чтобы обеспечить теоретическую основу для изучения новых растений -хозяев и генетического улучшения C. deserticola. Результат показал, что содержание полисахарида, обнаруженное в атриплексной Quadriptera-C.Deserticola, превосходило то, что присутствует в галоксилоне Ammodendron-C. Десертикола. Благодаря сравнительному анализу транскриптома 14089 дифференциально экспрессированных генов (DEG) были проверены из мясистых стеблей атриплекса Quadriptera-C. Deserticola и Haloxylon Ammodendron-c. Десертикола. Результаты анализа обогащения KEGG показали, что эти DEG наиболее заметно обогащены путями, связанными с метаболизмом углеводов, метаболизмом галактозы, метаболизмом аминокислоты и метаболизмом жирных кислот. Кроме того, в общей сложности 26 DEG были получены из четырех путей, связанных с метаболизмом полисахарида, среди которых уровни экспрессии гена фруктозидазы и гена -галактозидазы в галоксилоне аммодендрон -C. Deserticola были значительно выше, чем у Atriplex Quadriptera-C. Десертикола. Уровни экспрессии гена UDP-глюкозы дегидрогеназы и маннозы -1- гена фосфата гуанилаттрансферазы в атриплексной Quadriptera-C. Deserticola были значительно выше, чем в Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola, который может быть ключевыми ферментными генами для регуляции разности полисахаридного метаболизма у C. deserticola.

Ключевые слова Cistanche Deserticola; Секвенирование транскриптома; хозяева; разница полисахарида метаболизма

Cistanche Deserticola

 

Cistanche Deserticola YC MA, в первую очередь распространяется вГансу, Синьцзян, Нинсия и Внутренняя Монголия, традиционная китайская лекарственная трава, недавно включенная в«Лекарственные и пищевые гомологично»каталог. Он имеет различные преимущества для здоровья, напримерТонифицирующая почка ян, питательская сущность и кровь, а также способствуя движениям кишечника, делая его широко примененным вмедицина, здравоохранение и пищевая промышленность[1]. Из -за егоГетеротрофная природа, Cistanche Deserticolaпаразитирует разные растения -хозяина, сHaloxylon Ammodendronи недавно представленныеПолуверженные кустарникиAtriplex Canescens(Pursh) Nutt.быть его основными хозяевами.

Полисахариды являются ключевыми активными веществами при оценкеCistanche Deserticolaкачество. В разных условиях хозяина,накопление и метаболический составизCistancheПолисахариды значительно различаются [2]. Медицинские исследования показали, чтоCistancheПолисахариды обладаютантиоксидантный, нейропротекторный, иммунорегулирующий и улучшающий памятьфармакологические последствия, эффективно облегчениеБолезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и дефицит селезенки, вызванной депрессией печени[3]. С достижениями в современномМетоды экстракции и технологии анализа мультибетра,содержание, композиция и структурные характеристикиизCistancheПолисахариды постепенно выясняются, расширяя свои приложения.

С точки зренияИсследование молекулярной биологиинаCistancheвиды, исследования секвенирования транскриптома в основном были сосредоточены наCistanche TubulosaиГалоксилон-Cistancheсложные системы.Например,Hou et al.[4] выполнилПолноразмерное секвенирование транскриптома и профилирование экспрессии геновизCistanche Tubulosaс использованиемPacbio и Bgiseq -500 технологии RNA-seq, идентифицируя237 772 уникальных транскриптови скрининг генов ключевых ферментов, вовлеченных вФенилетаноидный гликозидный биосинтезПолем Сходным образом,Feng et al.[5] проводитсятранскриптомный и метаболический анализхаустории и прилегающих тканейГалоксилоновые корни иCistancheмясистые стебли, раскрывая роль хозяина в накопленииCistancheМетаболиты. Их исследование подчеркнуло, чторастение хозяина не только влияет на выходCistancheно и его качествоПолем Тем не менее, исследованияCistancheПаразитизация разных растений -хозяев остается ограниченной.

Atriplex Canescens, a глубоко устойчивое и устойчивое к стрессу растение, отличается от традиционногоHaloxylon Hostи происходит изполузасушливые плато в центральных Соединенных ШтатахПолем В последние годы он был введен и продвигается какновый хост дляCistanche DeserticolaкультивированиевСеверо -западный Китай. Цин и соавт.[6] проанализировали и сравнилиПолисахаридное накоплениеCistancheпаразитизация галоксилона и атриплекса canescensВ той же производственной зоне, поискЗначительные различия в содержании полисахаридовмежду двумя условиями хозяина.

Таким образом, это исследование направлено напоследовательность мясистых стеблейCistanche Deserticolaпаразитизация галоксилона и атриплекса canescens, анализируяДифференциальная экспрессия ключевых ферментных генов, участвующих в биосинтезе полисахаридаПолем Результаты предоставяттеоретическая основа для дальнейших исследований наCistancheМеханизмы биосинтеза полисахаридов, обогащение транскриптомных исследований атриплекса-Cistancheсистемы и продвигать инновации в высококачественномCistancheРесурсы зародышевой плазмы.

 

Материалы и методы

1.1 Экспериментальные материалы

Cistanche Deserticolaобразцы паразитируютHaloxylon AmmodendronиAtriplex Canescensбыли собраны изCistancheБаза культивирования вСикьян Таун, округ Цзинтай, провинция Гансу(широта36 градусов 5 'n, долгота103 градуса 42 'e) ОбаГалоксилониAtriplex Canescensбыли культивированы в той же среде. Образцы были классифицированы какГалоксилон-Cistanche(Образец а)иАтриплекс-Cistanche(Образец H),с тремя повторностями для каждой категории (пять растений на репликат). Выборка проводилась вАпрель 2024 г.и образцы были идентифицированы какCistanche Deserticolaмясистые луковицыПрофессор Го ЙехонгизСельскохозяйственный колледж, Сельскохозяйственный университет Гансу.

ПослеРуководящие принципы Shanghai OE Biotech Co., Ltd.,CistancheМясистые стебли были промыты ультрапирной водой, а избыточная влага удаляли с использованием фильтровальной бумаги. Тонкие ломтики были взяты изверх, середина и днакаждого стебля, тщательно смешанный и помещен в криогенные флаконы. Образцы былибыстро заморожен в жидком азотедля2 часаПеред тем, как быть переведенным в-80 морозильник степениДля хранения [7].

1.2 Экспериментальные методы

1.2.1 Создание стандартной кривой и определения содержания полисахаридов

A 10 мгобразецСтандарт D-Glucoseбыл точно взвешен и растворен в100 мл объемной колбыс дистиллированной водой для приготовления100 мкг · мл⁻Полем Калибровочные решения{{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0. 8 и 0,9 млакционного решения перенесли в10 мл стопорных пробирков пробирки, разбавлено водой до1. 0 ml, а затем смешанный с1. 0 мл 6% фенола раствораи5 мл концентрированной серной кислотыПолем После вихря растворы нагревали в ванне с кипящей водой для20 минут, затем охлажденный в ванне с водой для10 минут. A пустой контрольбыл подготовлен с помощью1. 0 мл дистиллированной водывместо раствора глюкозы. Поглощение измеряли в482 нмИспользованиеУФ-вис-спектрофотометри аСтандартная криваябыл сгенерирован сКонцентрация (x) в качестве горизонтальной осиипоглощение (y) в качестве вертикальной оси.

После измененного подхода изLi Jie et al. [8], 0. 2 г сушеногоCistancheпудрабыл точно взвешен и помещен в20 мл стоплевой пробирки. 10 мл 80% этанолабыл добавлен, и смесь подвергалиУльтразвуковая экстракция при 80 градусов (100 Вт, 40 кГц) в течение 30 минутПолем Экстракт отфильтровали в горячем виде, а процедура повторялась один раз. После сушки остатка,10 мл дистиллированной водыбыл добавлен, и ультразвуковая экстракция повторялась дважды. Фильтраты объединяли и разбавляли до20 млс дистиллированной водой.1. 0 ML этого решениябыл еще более разбавлен до10 млс дистиллированной водой.

A 1. 0 ml aliquotподготовленногоCistancheРаствор образца анализировали с использованием той же процедуры, что и стандарт глюкозы. Поглощение в482 нмбыл измерен, и содержание полисахаридов вCistancheИз разных растений -хозяев рассчитывались.

1.2.2 Экстракция РНК, конструкция библиотеки кДНК и секвенирование

Общая РНК была извлечена изCistanche Deserticolaобразцы паразитируютHaloxylon AmmodendronиAtriplex CanescensиспользуяРНК набор Tiangen DP441 (Китай), послеПротокол реагента ТризолаПолем Чистота РНК оценивалась с помощьюСпектрофотометр Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, США), в то время как концентрация РНК и целостность оценивались с использованиемAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США).

Библиотеки транскриптома были построены с использованиемVahts Universal V6 RNA-Seq Library Prep KitПолем После контроля качества сAgilent 2100 Bioanalyzer, библиотеки были секвенированы наПлатформа Illumina novaseq 6000, генерируя150 п.н..

1.3 Анализ данных

1.3.1 Сборка транскриптома и функциональная аннотация

Сырой читает вФормат FASTQбыли обработаны с помощьюТриммиматчтобы удалитьПлай-н чтения и низкокачественные чтения, в результате чегоЧистые чтенияПолем Адаптерные последовательности и низкокачественные области были удалены, и чистые чтения были собраны вконтиги(экспрессированные теги последовательности) с использованиемTrinity SoftwareПолем Самая длинная стенограмма из каждого кластера была выбрана в качествеUnigeneДля дальнейшего анализа.

Функциональная аннотация Unigenes была выполнена путем сравнения их сNCBI не восстановленная (NR) база данных белков, швейцарская проекта и эволюционная генеалогия генов: база данных, не связанных с ортологичными группами (Eggnog)с использованиемDiamond Software (E-значение <1e -5). Аннотация эукариотических ортологичных групп (KOG)был выполнен для выявления гомологичных генов. Кроме того, Unigenes были нанесены на карту наКиотская энциклопедия генов и геномов (KEGG)Для метаболического пути аннотации.Классификация гена онтология (GO) и функциональная аннотациябыли проведены с использованием сопоставлений из базы данных швейцарского проекта.

1.3.2 Анализ экспрессии генов и идентификация дифференциально экспрессируемых Unigenes (DEGS)

Уровни экспрессии генов были определены количественно с использованиемBowtie2чтобы выровнять чистое чтение с Unigenes. Значения выражения были рассчитаны какФрагменты на килобазу транскрипта на миллион отображенных чтений (FPKM)с использованиемэкспресс -программное обеспечениеПолем Дифференциальный анализ экспрессии был выполнен с использованиемDESEQ2 Программное обеспечение, сОтрицательные тесты на биномиальное распределение (NB)используется для тестирования значимости. Дифференциально экспрессируемые гены (DEGS) были определены как гены сq-значение <0. 05иFOLL изменение (FC)> 2.

1.3.3 Validation QRT-PCR дифференциально экспрессируемых генов

Ключевые гены фермента, вовлеченные вПолисахаридный биосинтезсЗначительная дифференциальная экспрессиябыли выбраны дляКоличественная проверка ПЦР в реальном времени (QRT-PCR)Полем Образцы РНК были проверены качеством, а значения OD измерялись до обратной транскрипции. Синтез кДНК был выполнен с использованиемTransscript All-In-One First-Strand Supermix для кДНКПолем Синтезированную кДНК разбавляли10- foldи QRT-PCR проводили с использованиемФлуоресцентная система КПЦРв различных условиях езды на велосипеде.ACTB (бета-актин) был использован в качестве внутреннего эталонного генаи относительные уровни экспрессии генов были рассчитаны с использованиемМетод 2⁻ΔTC.

 

Таблица 1 последовательности праймеров

Ген идентификатор	Имя гена	Первый праймер (5 '-3')	Обратный праймер (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	Gmpp	Gatagtggctacaacatccactt	CCTCCTCTTCGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	ПФП	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	Угр	Aaagatcttccagttcgtaagc	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	лак	Gtctccttgttattcgtgaggatt	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	сака	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatggaagatgaggaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	лак	Ggcacatcaaggagtacgatg	CACTGGCATCGACGAGGAAAG
-	Акт	Caatggatgatgatatcgccgcgt	CACTGGCATCGACGAGGAAAG

 

 

1.4 Анализ данных

Иерархический кластеризационный анализдифференциально экспрессируемые гены (DEGS)был выполнен с помощьюR (v3.2.0)Визуализировать паттерны экспрессии генов между группами и образцами. Go (Gene Ontology) Анализ обогащения иКегг (Киото энциклопедия генов и геномов) Анализ обогащениябыли проведены с использованиемR, на основегипергеометрическое распределениеПолем Значительно обогащенные функциональные термины отображались с использованиемБар -карты, пузырьковые сюжеты и графики круга обогащения.

2 результаты и анализ

2.1 Результаты определения содержания полисахаридов

Уравнение линейной регрессии, полученное из измерений поглощения, было:

y {{0}}. 0 154x --0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0. 1636 \ Quad. (R^2=0. 9963) y =0. 0154x --0.1636 (r 2=0. 9963)

с линейным диапазоном20–90 мкг · млПолем Точность, повторяемость, стабильность и скорость восстановления выборки были{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%и 99,67%, соответственно.

ИзмеренныйСодержание полисахаридоввCistanche DeserticolaОбразцы из разных растений -хозяев были:

Галоксилон-Cistanche: 6.51%

Атриплекс-Cistanche: 11.83%

2.2 Секвенирование транскриптома и сборка данных

Секвенирование транскриптомашесть образцовсгенерировал в общей сложности41,77 г чистых данныхПолем Допустимые данные на выборку варьировались от6,89 г до 7,04 г, сБазовый процент Q30 между 95,38% и 95,91%иСреднее содержание GC 45,13%.

Всего61 423 Unigenesбыли собраны с общей длиной65 962 858 п.н.исредняя длина 1 073,91 п.н..

2.3 Функциональная аннотация гена

Всего61 423 Unigenesбыли получены из секвенированияCistanche DeserticolaОбразцы паразитируют два разных растения -хозяев. Результаты аннотации следующие:

30 689 Unigenes (49,96%)были аннотированы вNR (не избыточная) база данных белков.

18 698 Unigenes (30,44%)были аннотированы вБаза данных швейцарской просты.

3998 Unigenes (6,51%)были аннотированы вБаза данных KEGG.

17 188 Unigenes (27,98%)были аннотированы вKOG (эукариотические ортологичные группы) база данных.

25 280 Unigenes (41,16%)были аннотированы вEggnog (эволюционная генеалогия генов: база данных, не связанных с супервизированными ортологическими группами).

16 210 Unigenes (26,39%)были аннотированы вGo (Gene Ontology) База данных.

16 153 Unigenes (26,30%)были аннотированы вБаза данных PFAM (семейства белков).

Среди них,21 650 Unigenesбыли длиннее1 кб.

Гомологический анализ на основеБаза данных NRпоказал, что тремя лучшими наиболее близкими видами были:

Paulownia fortunei (30,23%)

PhtheIrospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium Quinoa (7,1%)

 

 

Таблица 2 Информация о аннотацииCistanche DeserticolaГен функция

База данных	Аннотация гена номер	Пропорция (%)
Нр	30,689	49.96
Швейцарский проток	18,698	30.44
Кегг	3,998	6.51
Ког	17,188	27.98
Эггног	25,280	41.16
ИДТИ	16,210	26.39

 

 

2.4 Go и KEGG Функциональная аннотация и классификация

АGo (Gene Ontology) База данныхиспользовался для дальнейшей аннотирования Unigenes, идентифицированных вБаза данных NR, в результате чего16 210 UnigenesПолем Эти Unigenes были классифицированы наТри основные функциональные группы:

Биологический процесс (BP)

Молекулярная функция (MF)

Клеточный компонент (CC)

ВКатегория биологического процесса (BP), самыми обильными кластерами Unigene были:

"Cellular Process" (11 023 Unigenes)

"Метаболический процесс" (9,117 Unigenes)

Длякатегория сотовой компоненты (CC), 17 подкатегориибыли идентифицированы с каждой подкатегорией, содержащей по крайней мере30 UnigenesПолем Самыми большими кластерами были:

"Клетка" (13 947 Unigenes)

"Часть ячейки" (13 918 Unigenes)

ВКатегория молекулярной функции (MF), наиболее обогащенными функциональными группами были:

"Переплет" (10 039 Unigenes)

"Каталитическая активность" (8 490 Unigenes)

Рис.2 Go Функциональная аннотация и классификация Unigenes

 

Функциональная аннотация и классификация KEGG

В течениеСеквенирование транскриптома, в общей сложности3998 Unigenesбыли аннотированы вКегг (Киотская энциклопедия генов и геномов) База данныхПолем Эти унигены были классифицированы наШесть основных категорий, с их соответствующими количествами и пропорциями Unigene следующим образом:

Клеточные процессы: 326 Unigenes (8.15%)

Обработка экологической информации: 299 Unigenes (7.47%)

Генетическая информация обработка: 1771 Unigenes (44.30%)

Человеческие заболевания: 14 Unigenes (0.35%)

Метаболизм: 1465 Unigenes (36.64%)

Организмальные системы: 123 Unigenes (3.07%)

Эти шесть основных категорий были дополнительно разделены на20 вторичных уровней классификацииПолем Среди них,Генетическая информация обработкабыла самая высокая доля, за которой последовалМетаболизмПолем ВнутриМетаболизмКатегория, наиболее распространенными путями были:

Углеводный метаболизм

Метаболизм жирных кислот

Флавоноидный метаболизм

Рис.3 Аннотация метаболического пути Kegg Unigenes

 

2.5 Дифференциальная экспрессия генов и анализ обогащенияCistanche Deserticolaот разных хозяев

Данные секвенирования транскриптома фильтровали с использованиемКритерии выбора дифференциального выражения по умолчанию, в результате чего идентификация14 089 дифференциально экспрессируемых генов (DEGS):

6576 генов были активированы

7513 генов были подавлены

A График вулканабыл сгенерирован для визуализации общего распределения DEGS.

ВTop 30 Go Enrichment Функциональные классификацииDEGS наблюдалось, что:

По сравнению сБиологический процесс (BP)иКлеточный компонент (CC)категории,Молекулярная функция (MF)показал более значительное обогащение DEG.

Наиболее заметно обогащенные DEG были связаны сМетаболизм нуклеиновых кислот, метаболизм белка и ключевые ферменты в метаболизме галактозы.

Кроме того, DEG были значительно обогащены вУсловия GO, связанные с полисахаридным метаболизмом, включая:

Метаболический процесс крахмала

Биосинтетический процесс гликогена

Катаболический процесс сахарозы

Активность глюкозидазы

UDP-L-Rhhamnose Synthase Activity

Полисахаридная гидролаза активность

Рис.4 Вулканическая карта дифференциально экспрессируемых генов

 

Анализ обогащения путей KEGG в DEG вCistanche Deserticolaот разных хозяев

Для дальнейшего изучениядифференциально экспрессируемые гены (DEGS)вCistanche Deserticolaот разных растений -хозяев,Анализ обогащения пути KEGGбыл выполнен. Анализ показал, что:

DEG были нанесены на карту с 117 метаболическими путями.

АТоп -20 путипоказаноЗначительное обогащение, с самыми обогащенными путями, включая:

Метаболизм жирных кислот

-Линоленевая кислота метаболизм

Галактозный метаболизм

Деградация лизина

Дальнейший анализ обогащения20 лучших метаболических категорий с самыми маленькими значениями Qуказал, что DEG были значительно обогащены:

Организмальные системы

Метаболизм

Генетическая информация обработка

Среди этих категорий,"Метаболизм"имел наибольшее количество обогащенных DEG и показало наиболее значительное обогащение. Кроме того, в обогащенных метаболических путяхдоля повышенных и подавленных Unigenes была почти равной.

Эти выводы показывают, чтоМетаболические пути играют решающую рольв дифференциальной экспрессии генаCistanche Deserticolaот разных растений -хозяев, особенно влипид, углеводы и аминокислотный метаболизм.