Нарушение регуляции РНК мобильных элементов в мутантных сфероидах рака легких KRAS(G12C) 3D
Oct 27, 2023
АБСТРАКТНЫЙ
Мутантный KRAS регулирует экспрессию РНК мобильных элементов (TE) и интерферон-стимулируемого гена (ISG), но остается неясным, влияют ли разнообразные мутации в KRAS на различные TE РНК по всему геному. Мы проанализировали транскриптомы 3D сфероидов рака легких человека, которые содержат мутации KRAS(G12C), чтобы определить ландшафт TE РНК, регулируемый мутантным KRAS(G12C). Мы обнаружили, что передача сигналов KRAS(G12C) необходима для экспрессии TE РНК, происходящих из LINE и LTR, которые отличаются от TE РНК, которые, как ранее было показано, регулируются мутантными KRAS(G12D) или KRAS(G12V). Более того, ингибирование KRAS(G12C) специфически усиливает TE-РНК, происходящие из SINE, из самого молодого подсемейства Alu AluY. Наши результаты показывают, что нарушение регуляции TE РНК в клетках рака легких, управляемых KRAS, является мутационно-зависимым, а также выдвигает на первый план подмножество молодых TE РНК, полученных из Alu, которые координировано активируются генами врожденного иммунитета при ингибировании KRAS (G12C).
Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой
ВВЕДЕНИЕ
РНК мобильных элементов (TE) периодически подвергаются дисрегуляции в контексте рака. Элементы LTR 2,3. В дополнение к TE РНК, длинные некодирующие РНК (днРНК) также координировано регулируются сигнальными генами RAS 4, и их паттерны экспрессии аналогичным образом изменяются при многих видах рака 5-8. Что касается TE-РНК, их активация при раке вызывает состояние вирусной мимикрии, что приводит к внутренней активации генов врожденного иммунитета, таких как интерферон-стимулированные гены (ISG) 3,9,10. В частности, семейство SINE Alu является преобладающим источником иммуногенных TE РНК 11, которые индуцируются эпигенетическими изменениями, вызванными ингибиторами ДНК-метилтрансферазы (DNMTi) или мутантным KRAS-опосредованным ингибированием KZNF 3,9,10.
Чтобы исследовать, как распространенная мутация в KRAS влияет на ландшафт TE РНК в клетках рака легких, мы охарактеризовали транскриптомы трехмерных сфероидов рака легких, которые содержат мутации KRAS(G12C) в присутствии или в отсутствие мутантного ингибитора KRAS(G12C) 12. Мы показываем что передача сигналов KRAS(G12C) необходима для экспрессии TE РНК, происходящих из LINE и LTR, тогда как ингибирование KRAS(G12C) специфически усиливает как TE РНК, происходящие из SINE, так и подмножество генов, связанных с интерфероном (IFN). Наши результаты показывают сложное взаимодействие между мутантной передачей сигналов KRAS и дисрегуляцией TE в клетках рака легких, где определенный набор молодых элементов AluY активируется мутационно-зависимым образом.
Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
Ингибирование KRAS(G12C) изменяет кодирующий и некодирующий транскриптом.
Чтобы определить, как онкогенная передача сигналов KRAS(G12C) регулирует кодирующий и некодирующий транскриптом, мы выполнили секвенирование РНК (RNA-seq) на 3D-мутантных сфероидах рака легких KRAS(G12C). Для секвенирования РНК мы использовали полноразмерный протокол с 5'-уникальными молекулярными идентификаторами (UMI), чтобы обеспечить точный подсчет РНК и одновременно уменьшить ошибки амплификации ПЦР 13 (рис. 1А). Мы сравнили транскриптомы сфероидов рака легких H358, обработанных ингибитором KRAS(G12C) ARS-1620 (ARS) с контрольными сфероидами (обработанными ДМСО) (рис. S1A), и увидели, что лечение ARS существенно снижает уровни фосфорилированной ERK. (p-ERK) (рисунок S1B), что указывает на то, что лечение ARS ингибирует нижестоящую передачу сигналов KRAS (G12C). О подавлении передачи сигналов KRAS(G12C) при лечении ARS также свидетельствует уменьшение размера сфероидов и жизнеспособности клеток (рис. S1C и S1D).
На уровне РНК мы оценили относительное содержание различных биотипов и суперсемейств TE в сфероидах 3D рака легких, обработанных ARS или DMSO, что выявило динамические изменения в составе TE РНК при ингибировании KRAS (G12C) (рис. 1B). Хотя мы обнаружили только 32% генов, кодирующих белок, аннотированных GENCODE, и 15% генов днРНК, 92-96% суперсемейств TE (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) были представлены в наших UMI-тегах. Данные РНК-секвенирования, показывающие широкую дисрегуляцию TE РНК в транскриптоме, управляемом KRAS(G12C). До четверти всех обнаруженных молекул РНК в сфероидах рака легких, обработанных ARS, были получены из TE, что указывает на то, что TE РНК представляют собой значительную часть транскрипционного выхода мутантных клеток рака легких KRAS (G12C).
Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы
Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity
【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Затем мы определили значительно дифференциально экспрессируемые гены между сфероидами 3D рака легких, обработанными ARS и DMSO, чтобы идентифицировать биологические процессы, которые регулируются онкогенной передачей сигналов KRAS (G12C). Сфероиды рака легких с интактной передачей сигналов KRAS (G12C) были значительно обогащены генами, участвующими в контрольной точке G2M, мишенях E2F, мишенях MYC и митотическом веретене (рис. 1C). Однако при ингибировании KRAS(G12C) сфероиды рака легких экспрессировали значительно более высокие уровни генов, участвующих в окислительном фосфорилировании, комплементе и реакциях альфа- и гамма-интерферона (рис. 1C), что дает дополнительные подтверждающие доказательства участия передачи сигналов KRAS в регуляции. генов, связанных с ИФН 2,3.
Ингибирование KRAS(G12C) координально индуцирует ISG и молодые элементы AluY.
Чтобы дополнительно выяснить внутреннюю активацию ISG при ингибировании KRAS(G12C), мы определили, какие гены и TE значительно дифференциально экспрессируются в каждом наборе генов и суперсемействе TE соответственно. Среди генов ответа на IFN-альфа и IFN-гамма наиболее сильно индуцируемым геном при ингибировании KRAS(G12C) в сфероидах рака легких был RTP4 (рис. 2A), белок-переносчик рецептора, который отрицательно регулирует передачу сигналов TBK1 14. Кроме того, комплекс MHC класса I ген бета-2-микроглобулина (B2M), который периодически инактивируется при раке легких 15, также значительно активировался в обоих наборах генов, связанных с IFN, в сфероидах рака легких, обработанных ARS (рис. 2A).
Учитывая прямую роль онкогенной передачи сигналов KRAS в регуляции 3 TE РНК, мы исследовали, какие подсемейства TE РНК зависят от мутантного KRAS(G12C). В сфероидах рака легких с интактной передачей сигналов KRAS(G12C) мы обнаружили, что подсемейства LINE L1M6B и L1PA12 высоко экспрессируются и зависят от KRAS(G12C), о чем свидетельствует их подавление в сфероидах рака легких, обработанных ARS (рис. 2B). Более того, хотя только одно подсемейство ДНК MER44D зависело от передачи сигналов KRAS(G12C), более дюжины подсемейств LTR регулировались мутантным KRAS(G12C), включая MLT1A0-int, LTR51, MER50B. и LTR1B0 (рис. 2B). Напротив, все подсемейства SINE значительно активировались при ингибировании KRAS(G12C) и координировано индуцировались специфическими генами ISG (рис. 2A) в сфероидах рака легких. Все эти РНК SINE TE были получены из подсемейства AluY (рис. 2B), что указывает на то, что ингибирование KRAS(G12C) нарушает регуляцию определенного подмножества молодых элементов AluY.
Ингибирование KRAS(G12C) подавляет длинные некодирующие РНК
Чтобы дополнительно выяснить влияние ингибирования KRAS(G12C) на транскриптом, мы исследовали все значительно дифференциально экспрессируемые днРНК в сфероидах рака легких, обработанных контрольным ARS или ДМСО. Мы обнаружили, что экспрессия большого количества днРНК зависит от передачи сигналов KRAS(G12C), поскольку многие из этих днРНК подвергаются значительному снижению экспрессии при ингибировании KRAS(G12C) (рис. 3А). Три из этих днРНК с пониженной регуляцией, AC114546.3, NCMAP-DT и AC073575.2, не имеют известных функций, но перекрываются в антисмысловой ориентации с кодирующими генами ZNF770, RCAN3 и ERP29 соответственно. Как класс некодирующих РНК, мы наблюдали широкое снижение активности lncRNAs при лечении ARS в сфероидах рака легких (рис. 3B), что указывает на то, что многие lncRNAs зависят от передачи сигналов KRAS(G12C) для своей экспрессии.
Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы
ОБСУЖДЕНИЕ
Здесь мы показываем, что онкогенная передача сигналов KRAS(G12C) необходима для экспрессии специфических суперсемейств TE, а именно элементов LINE и LTR, а также подмножества lncRNAs, дополнительно демонстрируя, как передача сигналов RAS регулирует некодирующий транскриптом 2-4. Мы также использовали 3D-модель сфероида рака легких для наших экспериментов с ингибитором KRAS(G12C), поскольку было показано, что 3D-модели более точно воспроизводят реакцию на лекарство in vivo по сравнению с 2D-моделями культуры 16. Кроме того, наше применение полной модели на основе UMI Метод секвенирования РНК длинной длины 13 позволил нам более точно определить состав и динамику TE-РНК в наших сфероидах рака легких путем удаления дубликатов ПЦР в наших данных секвенирования РНК.
Наши результаты согласуются с предыдущими исследованиями ингибирования KRAS(G12C), в которых гены ответа на IFN-альфа и гамма активировались в обработанных ARS клетках рака легких H358 17. Основываясь на известных иммуногенных свойствах РНК, полученных из Alu 11, наши результаты показывают, что специфическая активация молодых элементов AluY при ингибировании KRAS(G12C), по крайней мере частично, ответственна за сильную активацию ISG в сфероидах рака легких, обработанных ARS. Примечательно, что значительное обогащение генов, связанных с интерфероном, в ответ на лечение ингибитором KRAS(G12C) не включает дальнейшую активацию сенсорных ISG РНК, таких как MDA-5, RIG-I или PKR, которые первоначально активируются при клетки легких в ответ на онкогенную передачу сигналов KRAS 2,3.
Ранее мы показали, что одной только передачи сигналов мутантного KRAS достаточно, чтобы вызвать активацию TE-РНК в клетках легких человека, которые были трансформированы in vitro 2,3, и наши результаты, описанные здесь, распространяют эти наблюдения на клетки рака легких с другой активирующей мутацией KRAS. Мутации KRAS(G12D) или KRAS(G12V) вызывают значительную активацию подсемейства LTR12C в трансформированных клетках легких 3, но мы не наблюдали значительного обогащения TE-РНК, происходящих из LTR12C, в наших сфероидах рака легких KRAS(G12C). Вместо этого мы наблюдали активацию LTR51, LTR1B0, LTR14B и LTR28B, что позволяет предположить, что различные мутации усиления функции в KRAS регулируют различные аспекты транскриптома TE РНК.
Наша работа дает всестороннюю оценку того, как транскриптом некодирующей/TE РНК динамически реагирует на ингибирование KRAS(G12C). Будущие исследования могут дать новое понимание потенциальной роли некодирующих/TE РНК в механизмах устойчивости к ингибитору KRAS(G12C). Кроме того, TE РНК, которые секретируются раковыми клетками при ингибировании KRAS, могут служить биомаркерами внеклеточных РНК 2,3,5,18,19 ответа и/или устойчивости к терапии ингибиторами KRAS 20.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сотовые линии
Клеточные линии рака легких H358, содержащие мутацию KRAS(G12C), культивировали в среде RPMI 1640 (Invitrogen), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Sigma), при 37 градусах и 5% CO2 во влажном инкубаторе. Все клеточные линии дали отрицательный результат на микоплазму. Клеточные линии были приобретены из Американской коллекции типовых культур (ATCC).
Анализы жизнеспособности клеток
Для анализа жизнеспособности сфероидов 10000 клеток на лунку высевали в планшеты с круглым дном 96-лунок с низкой адгезией и инкубировали при 37 градусах, 5% CO2 в течение 24 часов. Затем к клеткам добавляли серийно разведенные ARS- 1620 или ДМСО и планшеты инкубировали в стандартных условиях культивирования в течение 72 часов, при этом ежедневно заменяли свежие среды ARS и ДМСО. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием набора для анализа люминесцентной жизнеспособности клеток Cell Titer-Glo® (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Сигнал люминесценции образцов, обработанных АРС, нормировали к контролю ДМСО. Люминесценцию измеряли на молекулярном приборе SpectraMax iD3.
Выделение РНК
Тотальную массу РНК выделяли примерно из 100 сфероидов H358 (в каждом состоянии) с использованием набора Quick-RNA Mini-Prep (Zymogen) в соответствии с протоколом производителя. РНК определяли количественно с помощью спектрофотометра NanoDrop-8000.
Подготовка библиотеки RNA-seq
Адаптированный протокол Smart-seq3 13 использовался для создания библиотек RNA-seq из тотальной РНК для подсчета и оценки полноразмерных молекул РНК. Вкратце, 10 нг тотальной РНК подвергали обратной транскрипции с использованием праймера oligoDT со штрих-кодом (125 нМ) с последующим переключением матрицы с помощью олигонуклеотида для переключения матрицы со штрих-кодом (125 нМ). Эти олигопоследовательности служили праймерами для ПЦР-амплификации. Набор Nextera HT (Illumina) использовался для преобразования библиотек кДНК в библиотеки секвенирования с добавлением UMI-специфического праймера для амплификации концов кДНК, содержащих молекулярные штрих-коды, как описано в протоколе Smart-seq3. Качество кДНК и библиотеки оценивали с использованием высокочувствительного чипа биоанализатора ДНК Agilent и количественно определяли с помощью высокочувствительного анализа ДНК на Qubit 3.0.
Вестерн-блоттинг
После обработки ARS или ДМСО было выделено примерно 100 сфероидов H358 (в каждом состоянии). Затем сфероиды инкубировали на льду в буфере RIPA, дополненном ингибитором протеазы, в течение 15 минут. Затем лизаты центрифугировали при 10,000 RCF в течение 10 минут. Затем супернатант переносили в новую пробирку для последующей подготовки проб с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в буфере Лэммли, кипятили в течение 5 минут при 95°С до конечной концентрации 1 мг/мл. Для разделения белков по размеру проводили SDS-ПААГ с последующим переносом на мембрану из ПВДФ. Мембраны инкубировали с первичными антителами p-ERK (CST) и HSP90 (CST) в течение ночи при 4°С. Затем вторичные антитела (Abcam) инкубировали на 3-кратно промытых TBST мембранах в блокирующем буфере для последующей визуализации.
Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы
Дедупликация UMI
Считывания парных концевых освещенностей были обрезаны адаптером с использованием FastP 21 с настройками по умолчанию. UMI были извлечены из чтения и перемещены в имя чтения с помощью umi_tools_extract из пакета UMI-tools 22 с шаблоном штрих-кода, установленным на «NNNNNNNN». Удаленные чтения UMI были сопоставлены с HG38 с использованием выравнивателя STAR с набором аннотаций GENCODE v38. Выровненные чтения были дедуплицированы с помощью «UMI-tools dedup» с настройками по умолчанию.
РНК-секвенирующий анализ
Все файлы fastq были обрезаны с помощью Trimmomatic 2 (0.38) 23, а полученные обрезанные файлы были оценены с помощью FastQC 24, а затем обработаны с помощью следующего аналитического конвейера: Salmon (1.3.0): псевдовыравнивание РНК Чтения -seq выполняются с помощью Salmon 25 с использованием следующих аргументов: индекс, созданный из фаст-файла транскриптома GENCODE версии 35 с использованием ложных последовательностей для обеспечения выборочного выравнивания. Дополнительный индекс с поддержкой TE был создан аналогичным образом, но дополнен последовательностями, сгенерированными из трека UCSC Repeat Masker. DESeq2 (1.32.0): выходные данные Salmon были импортированы в объект DESeq с помощью tximport 26, а анализ дифференциальных выражений был выполнен со стандартными аргументами 27. Все результаты были отфильтрованы так, чтобы иметь Padj < 0,05. Там, где использовались данные подсчета, они были нормализованы по образцам с помощью DESeq.
Анализ обогащения генного набора
Дифференциально экспрессируемые гены ранжировались по уменьшенным значениям log2FoldChange, генерируемым DESeq2. Наборы генов были получены с использованием пакета R msigdbr (7.4.1) и отфильтрованы так, чтобы содержать только наборы генов со статусом «Hallmark». Пакет R fgsea (1.18.0) использовался для создания оценок обогащения набора генов, которые были отфильтрованы для получения результатов со скорректированными значениями p < 0.05.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Бернс, К.Х. (2017). Мобильные элементы при раке. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/нрк.2017.35.
2. Реджардо, Р.Э., Мароли, С.В., Халас, Х., Озен, М., Каррильо, Д., Ламонтань, Э., Уайтхед, Л., Ким, Э., Малик, С., Фернандес, Дж., и другие. (2020). Эпигеномное репрограммирование повторяющихся некодирующих РНК и генов, стимулируемых ИФН, с помощью мутантного KRAS. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Реджардо, Р.Э., Мароли, С.В., Халас, Х., Озен, М., Грабета-Робинсон, Э., Бехера, А., Педду, В., Каррильо, Д., Ламонтань, Э., Уайтхед, Л. ., и другие. (2022). Мутантный KRAS регулирует РНК мобильных элементов и врожденный иммунитет посредством генов цинковых пальцев KRAB. Отчеты о ячейках 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Ким Д.Х., Маринов Г.К., Пепке С., Сингер З.С., Хе П., Уильямс Б., Шрот Г.П., Еловиц М.Б. и Уолд Б.Дж. (2015). Анализ транскриптома отдельных клеток выявляет динамические изменения экспрессии днРНК во время репрограммирования. Клеточная стволовая клетка 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Реджардо, Р.Э., Мароли, С.В. и Ким, Д.Х. (2022). LncRNA-биомаркеры воспаления и рака. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Шмитт А.М. и Чанг Х.Ю. (2016). Длинные некодирующие РНК в путях рака. Раковая клетка 29, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
7. Ринн, Дж.Л. и Чанг, Хай (2020). Длинные некодирующие РНК: молекулярные модальности функций организма. Анну Рев Биохим 89, 283-308. 10.1146/аннурев-биохим- 062917-012708.
8. Слэк, Ф.Дж. и Чиннайян, А.М. (2019). Роль некодирующих РНК в онкологии. Ячейка 179, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.
9. Кьяппинелли, Кэтрин Б., Стриссель, Памела Л., Десришар, А., Ли, Х., Хенке, К., Акман, Б., Хейн, А., Роте, Нил С., Коуп, Лесли М. , Снайдер А. и др. (2015). Ингибирование метилирования ДНК вызывает интерфероновый ответ при раке через дцРНК, включая эндогенные ретровирусы. Ячейка 162, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.
10. Рулуа, Д., Лу Яу, Х., Сингхания, Р., Ван, Ю., Данеш, А., Шен, Шу Ю., Хан, Х., Лян, Г., Джонс, Питер А., Пью, Тревор Дж. и др. (2015). Агенты, деметилирующие ДНК, нацелены на клетки колоректального рака, индуцируя вирусную мимикрию с помощью эндогенных транскриптов. Ячейка 162, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.
11. Мехдипур, П., Мархон, С.А., Эттаеби, И., Чакраварти, А., Хоссейни, А., Ван, Ю., де Кастро, Ф.А., Лу Яу, Х., Ишак, К., Абельсон, С. ., и другие. (2020). Эпигенетическая терапия индуцирует транскрипцию инвертированных SINE и зависимость от ADAR1. Природа 588, 169-173. 10,1038/с41586-020-2844-1.
12. Острем Дж. М., Питерс У., Сос М. Л., Уэллс Дж. А. и Шокат К. М. (2013). Ингибиторы K-Ras(G12C) аллостерически контролируют сродство GTP и эффекторные взаимодействия. Природа 503, 548- 551. 10.1038/nature12796.
13. Хагеманн-Йенсен М., Цигенхайн К., Чен П., Рамскольд Д., Хендрикс Г.Дж., Ларссон А.Дж.М., Фаридани О.Р. и Сандберг Р. (2020). Подсчет одноклеточной РНК при разрешении аллелей и изоформ с использованием Smart-seq3. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10,1038/с41587-020- 0497-0.
14. Хе, Х., Эшбрук, А.В., Ду, Ю., Ву, Дж., Хоффманн, Х.Х., Чжан, К., Ся, Л., Пэн, Ю.К., Тумас, К.С., Сингх, Б.К. и др. (2020). RTP4 ингибирует реакцию IFN-I и усиливает экспериментальную церебральную малярию и невропатологию. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/пнас.2006492117.
15. Перейра, К., Хименес-Ксавьер, П., Прос, Э., Пахарес, М.Дж., Моро, М., Гомес, А., Наварро, А., Кондом, Э., Моран, С., Гомес- Лопес Г. и др. (2017). Геномное профилирование ксенотрансплантатов, полученных от пациентов при раке легких, выявило инактивацию B2M, ухудшающую иммунораспознавание. Клин Рак Рез 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Сен К., Фройнд Д. и Гомпертс Б.Н. (2022). Трехмерные модели легких: прошлое, настоящее и будущее: мини-обзор. Биохим Сок Транс 50, 1045-1056. 10.1042/БСТ20190569. 17. Мугарса, Э., ван Мальдегем, Ф., Бумелья, Дж., Мур, К., Рана, С., Ллориан Сопена, М., Ист, П., Эмблер, Р., Анастасиу, П., Ромеро. -Клавихо П. и др. (2022). Терапевтическое ингибирование KRAS(G12C) обеспечивает эффективный интерферон-опосредованный противоопухолевый иммунитет при иммуногенном раке легких. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Ходжа Р., Реджардо Р.Э., Озен М., Мароли С.В., Каррильо Д., Демирчи У. и Ким Д.Х. (2022). Признаки внеклеточной РНК мутантных клеток аденокарциномы легких KRAS(G12C). bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Ван Дж., Ма П., Ким Д.Х., Лю Б.Ф. и Демирчи У. (2021). На пути к выделению и обнаружению экзосом на основе микрофлюидики для терапии опухолей. Нано Сегодня 37.10.1016/j.nantod.2020.101066.
20. Мур А.Р., Розенберг С.С., Маккормик Ф. и Малек С. (2021). Терапия, нацеленная на РАС. Nat Rev Drug Discov. 10,1038/с41573-021-00220-6.
21. Чен С., Чжоу Ю., Чен Ю. и Гу Дж. (2018). fastp: сверхбыстрый универсальный препроцессор FASTQ. Биоинформатика 34, i884-i890. 10.1093/биоинформатика/bty560.
22. Смит Т., Хегер А. и Садбери И. (2017). Инструменты UMI: моделирование ошибок секвенирования с использованием уникальных молекулярных идентификаторов для повышения точности количественного определения. Геном Res 27, 491- 499. 10.1101/гр.209601.116.
23. Болджер А.М., Лозе М. и Усадел Б. (2014). Trimmomatic: гибкий триммер для данных последовательности Illumina. Биоинформатика 30, 2114-2120. 10.1093/биоинформатика/btu170.
24. Браун Дж., Пиррунг М. и МакКью Л.А. (2017). Панель управления FQC: объединяет результаты FastQC в интерактивный и расширяемый веб-инструмент контроля качества FASTQ. Биоинформатика. 10.1093/биоинформатика/btx373.
25. Патро Р., Дуггал Г., Лав М.И., Иризарри Р.А. и Кингсфорд К. (2017). Salmon обеспечивает быструю количественную оценку экспрессии транскриптов с учетом предвзятости. Методы Nat 14, 417-419. 10.1038/нмет.4197.
26. Сонесон К., Лав М.И. и Робинсон, доктор медицинских наук (2015). Дифференциальный анализ секвенирования РНК: оценки на уровне транскриптов улучшают выводы на уровне генов. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.
27. Лав М.И., Хубер В. и Андерс С. (2014). Умеренная оценка кратности изменения и дисперсии данных секвенирования РНК с помощью DESeq2. Геном Биол 15, 550. 10.1186/с13059-014- 0550-8.
БЛАГОДАРНОСТИ
Мы благодарим членов лаборатории Кима за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана средствами Инженерной школы Баскина (DHK). DC был поддержан Премией докторантуры в рамках Программы исследования заболеваний, связанных с табаком (T30DT0997), RER получил поддержку F99/K00 NIDDK KUH Премии за переход от докторской степени к постдокторанту от Национальных институтов здравоохранения (1F99DK{) {7}}), а VP получил поддержку в виде стипендии для докторантов от Программы исследования заболеваний, связанных с табаком (T32DT4904).
АВТОРСКИЕ ВЗНОСЫ
DHK разработал концепцию исследования, DC и DHK разработали исследование, DC, JL и GM провели эксперименты, RER и VP проанализировали данные, а DC и DHK написали статью с участием авторов.
ЦИФРЫ
Рисунок 1. Ингибирование KRAS(G12C) изменяет кодирующий и некодирующий транскриптом A. Экспериментальная схема. B. Распределение счетчиков, присвоенных кодированию GENCODE, lncRNA и суперсемействам TE/repeat в обработанных ARS (ars) или обработанных DMSO (dmso) библиотеках сфероидных РНК-seq рака легких, где каждый столбец представляет собой биологический повтор. C. Результаты анализа значительного обогащения набора генов, наблюдаемые в сфероидах рака легких, обработанных ДМСО (справа, положительный NES) или обработанных ARS (слева, отрицательный NES), с использованием дифференциально экспрессируемых генов, ранжированных по нормализованному показателю обогащения (NES).
Рисунок 2. Ингибирование KRAS(G12C) координально индуцирует ISG и молодые элементы AluY.
А. Графики вулкана, показывающие значительную разницу в экспрессии, наблюдаемую в наборах ключевых генов между обработанными ДМСО (справа, положительное изменение кратности) или обработанными ARS (слева, отрицательное изменение кратности) сфероидами рака легких. B. Графики вулкана, показывающие значительную дифференциальную экспрессию, наблюдаемую в суперсемействах TE между обработанными ДМСО (справа, положительное изменение кратности) или обработанными ARS (слева, отрицательное изменение кратности) сфероидами рака легких.
Рисунок 3. Ингибирование KRAS(G12C) подавляет длинные некодирующие РНК.
А. График вулкана значительной дифференциальной экспрессии РНК, кодирующих белок GENCODE, и днРНК между обработанными ДМСО (справа, положительное изменение складки) или обработанными ARS (слева, отрицательное изменение складки) сфероидами рака легких. B. Рамочная диаграмма значимой дифференциальной экспрессии РНК, кодирующих белок GENCODE, и днРНК между обработанными ДМСО (вверху, положительное изменение складки) или обработанными ARS (внизу, отрицательное изменение складки) сфероидами рака легких (Wilcoxon).
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ РИСУНОК
Рисунок S1.
A. Сфероиды рака легких H358 3D, обработанные ARS или ДМСО. B. Вестерн-блоттинг p-ERK и HSP90 с использованием сфероидов рака легких H358 3D, обработанных ARS или ДМСО. C. Измерения диаметра (в микрометрах) (левый график) и жизнеспособности клеток (жизнеспособность люминесцентных клеток Cell Titer-Glo® в относительных единицах флуоресценции) (правый график) сфероидов рака легких H358 3D, обработанных ARS или ДМСО после 3 или 5 дней лечения (500 нМ АРС-1620 или ДМСО). D. Измерения диаметра (в микрометрах) сфероидов рака легких H358 3D, обработанных различными концентрациями ARS-1620 (нМ) в течение 7 дней.
