Тубулозид B из Cistanche Salsa спасает нейрональные клетки PC12 от апоптоза и окислительного стресса, индуцированного ионами 1-метил-4-фенилпиридиния

Введение

Патологически спорадическая болезнь Паркинсона (БП) обычно характеризуется потерей катехоламинергических нейронов, особенно дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции (SNc), и наличием характерных интранейронов. включения, называемые тельцами Леви, в пораженных участках мозга. Несмотря на то, что в патогенез БП вовлечено множество факторов, механизмы, участвующие в инициировании и прогрессировании БП, остаются неопределенными. к гибели нейронов или апоптозу из-за чрезмерного образования свободных радикалов. Тот факт, что нигральная дофаминергическая система может продуцировать высокие уровни свободных радикалов и имеет относительно низкий уровень окислительной защитной системы, еще раз подтверждает эту гипотезу. Исследования как in vivo, так и in vitro показали опосредованную окислительным стрессом нейротоксичность MPP ＋, активного метаболита l-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MPTP) на дофаминергических нейронах. Участие свободных радикалов, избыточно образующихся в результате окислительного стресса, как непосредственной причины нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, предполагает ключевую роль антиоксидантов. Тубулозид Б (рис. 1) – одно из фенилэтаноидов, выделенных из стеблей Cistanche salsa. Предыдущие исследования показали, что многие фенилэтаноиды, включая тубулозид B, обладают сильной активностью по удалению свободных радикалов.

Принимая во внимание эти результаты, в настоящем исследовании мы исследовали влияние тубунцида B на нейротоксичность, индуцированную MPP+-, in vitro, используя клеточную линию феохромоцитомы симпатического нерва PC12, которая на протяжении многих лет успешно использовалась для изучения функции нейронов.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Материалы и методы

Материалы

Тубулозид B из Cistanche Salsa был любезно предоставлен доктором Ли Леем (Отдел натуральных продуктов, Школа фармацевтических наук, Пекинский университет, Пекин, Китай). Чистота соединения составила более 98% по данным ВЭЖХ-анализа. Среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), лошадиную сыворотку и эмбриональную телячью сыворотку закупили у GIBCO BRL, ион 1-метил-фенилпиридиония (MPP+), поли-L-лизин, 3-(4,{ {8}}диметилтиазол-2 -ил)-2,5- дифенилтетразолия бромид (МТТ), йодид пропидия (PI), РНКаза А, протеиназа К и 2; 7'-дихлорфлуоресцеиндиацетат (DCFH-DA) был приобретен у Sigma.

Культура клеток

Клетки PCI2 содержали в среде DMEM с добавлением 10% лошадиной сыворотки, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивировали во влажном инкубаторе с аэрацией 95% воздуха и 5% CO2 при температуре 37 градусов. Все эксперименты проводились 24-48 ч после посева клеток. Клетки собирали обычным способом путем трипсинизации 0,25%, когда клетки приближались к стадии субконфлюэнтности, и помещали в 25-сантиметровые культуральные колбы, разделенные в соотношении 1:8.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли с использованием модифицированного анализа МТТ, как описано ранее [10]. Короче говоря, клетки PC12 высевали в планшеты с 96-лунками с плотностью 1 × 104 клеток на лунку. Культуры выращивали в течение 48 ч, а затем среду меняли на среду, содержащую различные концентрации ожогового вещества B или MPP＋. После инкубации в течение 48 и 72 часов раствор MTr (5 мг/мл в DMEM) добавляли в планшеты с лунками 96- и клеткам давали инкубироваться в течение 4 часов при 37 градусах. После удаления среды кристаллы клеток и красителя растворяли путем добавления 200 мкл ДМСО и измеряли поглощение при длине волны 570 нм (540 нм в качестве стандарта) с помощью устройства для считывания микропланшетов модели 550 (Bio-Rad). Жизнеспособность клеток также анализировали с использованием метода исключения трипанового синего. Клетки собирали, осторожно осаждали и окрашивали 0,6% раствором трипанового синего в течение 3 дождей. Процент неокрашенных клеток впоследствии оценивали в десяти случайно выбранных полях микроскопа. В качестве положительного препарата использовали 100 нг/мл эпидермального фактора роста (ЭФР).

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНХ TUBULOSA ДЛЯ АКТИВНОСТИ ПО УДАЛЕНИЮ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обнаружение апоптоза методом проточной цитометрии

Апоптозные клетки выявляли методом проточной цитометрии с использованием йодида пропидия (PI) [11]. Вкратце, около 1×106 клеток, инкубированных с тестируемыми веществами, собирали центрифугированием и один раз промывали PBS. Клетки фиксировали 70 % этанолом в течение 24 ч при - 20 степени и один раз промывали PBS. Затем клетки ресуспендировали в 300 мкл PBS, содержащего 0,5 мг/мл РНКазы А и 0,5 мг/мл PI. После дальнейшей инкубации в течение 30 минут в темноте проводили проточную цитометрию с помощью FACScan (Becton Dickinson, Гейдельберг, Германия).

Анализ фрагментации ДНК методом электрофореза

Мы применили протокол Мура [12], который выделял только фрагментированную ДНК, и эксперименты были нормализованы с использованием равного количества культур из каждой тестовой группы. Вкратце, 3 × 106 нейронов из каждого из обработанных образцов промывали сбалансированным солевым раствором Хэнка (1000г в течение 10 минут), а осадки, образовавшиеся на дне пробирки, гомогенизировали. с 1 мл лизирующего буфера (10 мМ Трис при pH 7,4. 5 мМ ЭДТА, 1% Тритон X-100) в течение 20 мин на льду. После центрифугирования при 11,000 g в течение 20 градусов при 4 градусах супернатанты, содержащие фрагментированную ДНК, удаляли и расщепляли 20 мг/мл РНКазы А при 37 градусах в течение 1 часа и 0,1 мг/мл протеиназы К при 56 градусах. еще за 1 час. Фрагментированную ДНК экстрагировали с помощью фенола и хлороформа и центрифугировали при 10,000g в течение 1 дождя при 4°С. Водную фазу переносили в новую пробирку Эппендорфа, смешивали с 2 объемами ледяного этанола и затем помещают при 20 градусах минимум на 1 час для осаждения ДНК. После центрифугирования при 15,000g в течение 20 минут при 4 градусах супернатанты удаляли, осадки ДНК один раз промывали 80% этанолом (15 000 g в течение 15 минут при 4 градусах), сушили на воздухе и растворяли в 20 мкл. ТЕ-буфер с pH 7,6. Затем весь образец подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле в течение 1 часа при 85 В. Гель исследовали и фотографировали с помощью системы документации гелей для ультрафиолетовых продуктов (GELDOC-2000, Bio-Rad, США).

Измерение образования внутриклеточных АФК

Образование внутриклеточных пероксидов детектировали с помощью конфокального сканирующего лазерного микроскопа с использованием нефлуоресцентного соединения 2,7"-дихлорфлуоресцеиндиацетата (DCFH-DA) [13], которое деэтерифицируется внутри клеток эндогенными эстеразами до ионизированного свободного кислота, 2;7"-дихлорфлуоресцеин. 2",7-Дихлорфлуоресцеин способен окисляться до флуоресцентного 2"7"-дихлорфлуоресцеина (DCF) под действием гидроантиоксидантов. Клетки инкубировали с 10 мкМ DCFH-DA в течение 30 минут при 37 градусах. Культуры дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хэнка и визуализировали в той же среде. Визуализация выполнялась с использованием конфокального сканирующего лазерного микроскопа, DCF возбуждался при длине волны 488 нм, а эмиссионный фильтр представлял собой барьерный фильтр 510 нм. Чтобы обеспечить достоверное сравнение, для всех наблюдений использовались одни и те же параметры сбора данных. Устанавливали оптимальное вертикальное положение в середине ячеек, а затем быстро сканировали поле. Поскольку освещение с длиной волны возбуждения 488 нм вызывало усиление флуоресценции из-за окисления этого красителя, каждое поле подвергалось воздействию света в течение одинакового времени. Исходные значения для нестимулированных клеток использовали в качестве контрольных значений для сравнения с обработанными MPP+ клетками в присутствии или в отсутствиетубулозид Б. После сканирования средняя относительная интенсивность флуоресценции в 15-20 телах нейрональных клеток на поле микроскопа была количественно определена в четырех отдельных культурах для каждого условия лечения.

статистический анализ

Все полученные значения выражали как средние ±SD. Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента; Рассчитанные значения p менее 0,05 считались статистически значимыми.

Полученные результаты

Как показано на рис. 2, MPP+ вызывал дозозависимое снижение жизнеспособности клеток PCI2. Напротив, EGF, хорошо известный нейротрофический фактор, обеспечивал значительную защиту жизнеспособности клеток при концентрации 100 нг/мл. Цитотоксические эффекты, вызванные МПФ, также ослаблялись в присутствии тубулозида B (5, 10, 50 или 100 мкг-мл{{12} }), хотя и с меньшей эффективностью, чем эталонный

препарат (рис.3)． Тубулозид B в этих концентрациях проявлял цитопротекторное действие дозозависимым образом, и соединение само по себе не вызывало какой-либо явной цитотоксичности (данные не показаны). Гель-электрофорез экстракта ДНК из клеток PCI 2, обработанных 200 мкМ MPP+, в течение 48 часов показал лестничное распределение ДНК. классический признак апоптоза, тубулозид B, в дозах 10 и 100 мкг·мл-1 вызывал образование лестницы ДНК (рис. 4). На рис. 5 показаны типичные гистограммы проточно-цитометрического анализа апоптотической гибели клеток, индуцированной MPP＋ в клетках PC12 в присутствии или в отсутствие тубулозида B. Количественное определение профиля клеточного цикла с помощью PI выявило количество клеток с субдиплоидными характеристиками (область M1). свидетельствует об апоптотической фрагментации ДНК. В необработанных клетках апоптотическая субдиплоидная фракция была минимальной и составляла до 5,94% от общего числа 10000 клеток (рис. 5А). После 48-часового воздействия MPP＋ процент апоптоза увеличился до 43．02;j;(рис.．5 B)． При добавлении к клеточной культуре тубулозид Bингибировал апоптоз, вызванный MPP+-дозозависимым образом. При концентрации 10 мкг·мл-1 защита тубулозида B не была статистически значимой, но при концентрации 50 и 1 00мкг·мл-1 наблюдалось снижение на 45 ％ и 63 ％ соответственно. наблюдалось. увеличение процента выживших клеток (рис. 5D, E).

Накопление внутриклеточных АФК можно обнаружить с помощью клеток DCFH-DA．PC12, обработанных 200 мкМ MPP＋ в течение 48 часов, проявляющих интенсивную флуоресценцию внутри клетки после окрашивания красителем DCFH-DA (рис. 6). Одновременное лечение тубулозидом B (в дозах 10 и 100 мкг·мл) ингибировало MPP＋一 индуцированное производство АФК (процент снижения составил 24．52％ и 55．63%) соответственно).

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНХА ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обсуждение

Патогенез БП включает сильный окислительный стресс, снижение уровня антиоксидантов и митохондриальные дефекты. известно, что все они вызывают апоптоз в нескольких клеточных системах. В частности, было показано, что свободные радикалы вызывают активную гибель клеток в нейронах[14]． МФТП вызывает необратимый и тяжелый паркинсоноподобный синдром, вызывающий избирательную дегенерацию нигростриатных дофаминергических нейронов у людей. Этот нейротоксин был использован для создания. модели PD на животных[15]．MPTP преобразуется моноаминоксидазой B в Mpp＋, который накапливается в митохондриях． где он ингибирует митохондриальный комплекс I и митохондриальную дисфункцию. функция вызывает апоптоз[16]． Таким образом, нейротоксичность, индуцированная MPP+ в дофаминергических нейронах, широко используется в качестве этиологической модели БП для скрининга нейропротекторных агентов.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что тубулозид B снижает гибель клеток, вызванную MPP+- в результате окислительного стресса в клетках PC12. Кроме того, мы продемонстрировали, что тубулозид B также дозозависимо защищает от MPP{{ 3}}индуцирует лестничную структуру ДНК и апоптоз, что измерено с помощью гель-электрофореза ДНК и проточного цитометрического анализа. Более того, одновременное лечение более высокими концентрациями тубулозида B ингибировало выработку АФК, индуцированную MPP. Таким образом, тубулозид B продемонстрировал многофункциональное нейропротекторное действие. В действии тубулозида B могут участвовать несколько механизмов, отдельно или в сочетании. Антиоксидантный эффект является возможным механизмом нейропротекции, опосредованной тубулозидом B. Сюн Q обнаружил, что тубулозид B проявляет сильную активность по улавливанию свободных радикалов в отношении 1,1-дифенил-2-пикрилгидразильного радикала и ксантин]ксантиноксидазы, генерирующей супероксидный анион-радикал.

Недавно сообщалось, что некоторые фенилэтаноиды обладают свойствами улавливания свободных радикалов и защищают от токсических повреждений, вызванных окислительным стрессом. АФК, продуцируемые MPP+, такие как перекись водорода, супероксид-анион и гидроксильный радикал, легко повреждают биологические молекулы, что в конечном итоге может привести к апоптотической или некротической гибели клеток. Таким образом, тубулозид B может оказывать прямое очищающее действие на АФК. Хотя наши данные не устанавливают точное место, в котором тубулозид B подавляет накопление АФК, они позволяют предположить, что нейропротекторный механизм включает стимуляцию антиоксидантных путей. Исследование молекулярной структуры тубулозида B также показывает, что он обладает мощной способностью кудаление свободных радикалов(личное общение).

Другие механизмы также могут быть уместны. Например, тубулозид B может обладать способностью противодействовать токсичности MPP＋ путем ингибирования открытия пор и нарушения проницаемости митохондрий. Кроме того, следует также учитывать, оказывает ли тубулозид B прямое влияние на рост нейронов. Точный механизм нейропротекторного действия тубулозида B остается неясным. Для выяснения полной картины его нейропротекторного эффекта необходимы дополнительные исследования.

Наконец, тубулозид B изЭкстракт цистанхе сальсыоказывает очевидное защитное действие на апоптоз, вызванный MPP+-, и окислительный стресс. Его нейропротективное действие против токсичности МПП + может быть важным и позволяет предположить, что он может иметь терапевтический потенциал в профилактике и лечении БП.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНХА ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА PHGS75% ECH 30% ACT 12%