Однозначное структурное определение ЯМР (плюс)-катехин-лакказных димерных продуктов реакции как потенциальных маркеров окисления винограда и вина

Для получения более подробной информации обращайтесь:tina.xiang@wecistanche.com

Абстрактный:(плюс)-катехин-лакказаокислениедимерные стандарты были полусинтезированы с использованием лакказы от Trametes Versicolor в водно-этанольном растворе при рН 3,6. Было обнаружено восемь фракций, соответствующих восьми потенциальным димерным продуктам окисления. Профили фракций сравнивали с профилями, полученными с двумя другими оксидоредуктазами:полифенолоксидазаэкстрагируется из винограда и лакказы из Botrytis cinerea. Профили были очень похожи, хотя некоторые незначительные различия свидетельствовали о возможных различиях в реакционной способности этих ферментов. Затем выделяли пять фракций и анализировали с помощью 1D- и 2D-ЯМР-спектроскопии. Добавление следов нитрата кадмия в образцы, солюбилизированные в ацетоне, привело к полному разрешению сигналов ЯМР фенольных протонов, что позволило однозначно определить структуру шести продуктов реакции, одна из фракций которых содержала два энантиомера. Эти продукты можно также использовать в качестве маркеров окисления для изучения их присутствия и эволюции в вине в процессе виноделия и выдержки вина.

Ключевые слова: маркер окисления;(плюс)-катехин; сигналы фенольного ЯМР; лакказа; нитрат кадмия; полифенолоксидаза

Нажмите, чтобы получить дополнительную информацию

1. Введение

Полифенолыпредставляют собой семейство химических соединений, широко распространенных в природе. Они содержатся в значительных количествах в чае [1], какао [2,3], чернике [4], винограде [5л] и ферментированных продуктах, таких как вино [6]. Будучи первичными мишенями окисления J7,8], химическая структура полифенолов постоянно развивается. Эти изменения влияют на органолептические свойства многих видов пищевых продуктов; они ответственны за такие явления, как потемнение пищи [9] и модификации сенсорных характеристик вина [10,11. В энологии это явление окисления имеет место в винограде или вине. Что касается ферментативного окисления, то основными ферментами, ответственными за потемнение, являются оксидоредуктазы, точнее,полифенолоксидазаприсутствует в винограде и лакказе, продуцируемой Botrytis cinerea [12].

ферментативныйокислениев основном происходит в виноградном сусле, но дальнейшее потемнение вина может быть связано с химическими реакциями окисления |7,13] или с лакказой Botrytis cinerea, которая может быть очень стабильной во время выдержки вина14. На фенольных субстратах могут проявляться две окислительные ферментативные активности: активность монофенолоксидазы, характеризующаяся гидроксилированием соседнего положения существующей гидроксильной группы, и активность дифенолоксидазы, соответствующая окислению орто-дигидроксибензолов в орто-бензохиноны.

По данным Номенклатурного комитета Международного союза биохимии и молекулярной биологии (NC-IUBMB), эта ферментативная активность катализируется ферментами класса EC1-, соответствующими оксидоредуктазам. Среди них три основных класса оксидоредуктаз, катализирующих окисление полифенолов, представляют собой EC1.14.18.1 (монофенолмонооксигеназа), EC1.11.1 (пероксидаза/POD) и EC1.10.3 (оксидоредуктазы, действующие на дифенолы).

Этот последний класс разделен на различные подклассы, и два из них представляются особенно интересными для этого исследования: EC1.10.3.1 (полифенолоксидаза/ПФО) и EC1.10.3.2 (лакказа) (см. дополнительные материалы на рисунке S1).

ПФО, лакказа и пероксидаза являются оксидоредуктазами, в основном ответственными за потемнение во время обработки винограда [13]. Потемнение, вызванное POD, незначительно во фруктах, но может усилить разложение фенолов в сочетании с PPO[15]. ПФО естественным образом присутствует в винограде и способен катализировать окисление монофенолов до катехинов и катехинов до коричневых пигментов [8,13,16]. Лакказы, встречающиеся в винограде, зараженном Botrytis, обладают более широким спектром действия|17|, так как они могут катализировать окисление многих различных субстратов. Основными мишенями окисления лакказ остаются 1-2 и 1-4 дигидроксибензол.

В вине бензохинон, полученный путем окисления (ПФО или лакказы), может легко вступать в дальнейшие реакции в зависимости от их окислительно-восстановительных свойств и электронного сродства [15]. Они могут действовать либо как электрофилы и реагировать с аминопроизводными [18], либо как окислители и реагировать в том числе с фенольными субстратами. В зависимости от их химической конформации (хинон или семихинон) бензохинон может давать различные продукты реакции окисления. При нейтральном pH (плюс)-катехин будет окисляться до хинона в положении C5 или C7 кольца A, что приведет к образованию шести возможных димерных изомеров, что подразумевает наличие связи между положением кольца B C2', C5' или C6' верхнего катехинового звена и положение А-кольца C6 или C8 нижнего звена [19,20]. Дегидродикатехин является хорошо известным продуктом этого сочетания [21]. Положения маркировки структур показаны на рисунке 1. В кислых условиях семихиноновые формы также могут присутствовать в кольце B (положение OH3' или OH4') и приводить к четырем возможным димерным изомерам [20,22] с верхнее катехиновое звено и А-кольцо нижнего звена (положение С6 или С8). Ферментативное окисление катехина изучалось в предыдущих исследованиях [22, 23], а ассоциированные продукты окисления были охарактеризованы с помощью ВЭЖХ [24], хотя их выделяли реже и никогда полностью не характеризовали с помощью ЯМР.

Целью данной работы было сначала сравнить с помощью УВЭЖХ-МС профили продуктов окисления димерного (плюс)-катехина в присутствии трех экстрактов оксидоредуктазы, т. е. ПФО, экстрагированного из винограда, лакказы из гриба Botrytis cinerea, присутствующего в ботритизированных сладких винах. [14] и лакказа из Trametes Versicolor.

Вторая цель состояла в том, чтобы полусинтезировать и охарактеризовать структуры некоторых димерных продуктов окисления с помощью ЯМР-спектроскопии, полученных с лакказой от Trametes Versicolor.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Сравнение профилей димерных продуктов реакции с тремя различными оксидоредуктазами и (плюс)-катехином

( плюс )-Катехин сначала окисляли в присутствии лакказы из Trametes Versicolor при рН 3,6 в модельном винном растворе. После отделения димерной фракции от остаточного (плюс)-катехина и других полимерных фракций восемь основных фракций собирали и анализировали с помощью УВЭЖХ-УФ-МС, отмеченных от N1 до N8 в порядке возрастания времени удерживания (таблица 1). Масс-спектры электрораспыления в положительном режиме показали ионные пики [M плюс H] плюс при m/z 579 для N1-N6, гипотетически соответствующие димеру, образованному одинарной связью между двумя катехиновыми звеньями, и [M плюс H] плюс при m/z 579 для N1-N6. m/577 для N7 и N8, что предположительно свидетельствует об образовании дополнительной связи.

Эти восемьокислениефракции потенциально наблюдались после химической деполимеризации танниновой фракции в предыдущих работах [25, 26] и, возможно, могли быть такими же, как те, которые уже были описаны Guyot et al. [20], даже если условия эксперимента были немного другими. Действительно, в этом предыдущем исследовании использовали неочищенный экстракт ПФО при рН 3 и 6 для получения восьми фракций. В настоящем исследовании сравнивали три различных фермента при pH 3,6 в модельном винном растворе. Сравнительный анализ ЖХ-МС основных фракций окисления, полученных с тремя различными ферментами (лакказой из Trametes Versicolor, лакказой из Botrytis cinerea и полифенолоксидазой, экстрагированной из винограда), представлен в таблице 2. Для каждой из восьми фракций время удерживания было почти одинаковым для разных ферментов, и подобные значения m/z были определены с помощью МС-анализа. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что для каждого фермента были получены одни и те же фракции, содержащие продукты со структурой, аналогичной той, которую предположили Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano и Ros Barcel6 [27] также провели сравнительное исследование продуктов окисления (плюс)-катехина двумя разными ферментами: пероксидазой и полифенолоксидазой, оба экстрагированы из клубники. Они пришли к выводу, что продукты, полученные с использованием двух ферментов, были качественно одинаковыми. Дополнительное соединение N4' с m/z=578 Th и Rt=15.66 мин наблюдалось в экспериментах с лакказой из Botrytis cinerea и экстрагированным PPO, но не с лакказой из Trametes Versicolor, что предполагает возможные различия по реакционной способности этих ферментов.

2.2. Исследование и оптимизация физико-химических параметров 1Н-ЯМР фенольных и алифатических сигналов ОН

Структурную характеристику димеров процианидинов можно получить с помощью ЯМР-анализа. В частности, точное положение связи между единицами можно определить с помощью корреляционных спектров HMBC и/или ROESY [28, 29] (рис. S2 и S3). В случае связи эфирного типа (COC) необходимо отнесение сигнальных протонов гидроксила. Это также может иметь решающее значение в случае связей CC, если некоторые алифатические или ароматические протоны перекрываются или если некоторые ключевые корреляции отсутствуют. Однако даже в апротонном растворителе гидроксильные протоны полифенолов часто проявляются в виде широких сигналов, из которых невозможно получить структурную информацию [30]. Эта проблема была предварительно решена путем добавления следов

Cd(NO3)2 в растворах образцов. Действительно, широкие сигналы групп ОН обусловлены межмолекулярным обменом между этими протонами ОН и другими протонами в растворителе или растворенном веществе. За счет уменьшения межмолекулярных связей присутствие нитрата кадмия в образцах может уменьшить эти обмены, тем самым улучшив четкость сигналов протонов ОН.

2.2.1. Эффект добавления кадмия

После сушки вымораживанием пять фракций N2, N3, N4, N6 и N8 солюбилизировали в ацетоне-dg. Затем были получены 1D-спектры протонного ЯМР при 25 градусах до (рис. 2А) и после добавления небольшого количества кадмия (рис. 2В). В чистом ацетоне-д фенольные протоны ОН всех фракций проявлялись в виде широких пиков. После добавления кадмия эти протоны показали высокое разрешение сигналов в случае фракций N6 и N8, тогда как для фракций N2, N3 и N4 сигналы были лишь немного более резкими. Следует также отметить, что увеличение содержания Cd не повлияло на разрешение сигнала ОН, так как при последовательном добавлении небольших количеств Cd к образцам не наблюдалось резкости или уширения ширины линии пика (данные не показаны).

Сигналы фенольных ОН с высоким разрешением от продуктов N2, N3 и N4 были достигнуты благодаря дополнительной сушке и повторному растворению (рис. 2C, D).

Различие в поведении фракций при добавлении Cd можно объяснить силой молекулярных взаимодействий: сильнее в случае N2, N3 и N4 по сравнению с N6 и N8, причем для разрыва этих связей необходим дополнительный шаг.

Этот дополнительный шаг может быть ключевым при использовании Cd для получения сигналов фенольных ОН с высоким разрешением в любой ситуации, независимо от происхождения образцов, реакции синтеза или природных полифенольных продуктов.

Предыдущая работа, посвященная однозначной структурной характеристикеполифенолдимеров с использованием сигналов ЯМР фенолов ОН с высоким разрешением благодаря добавлению нитрата кадмия, была опубликована в 1996 г. [30]. Насколько нам известно, с тех пор не было опубликовано ни одной исследовательской работы с использованием этой методологии. Впоследствии для достижения этой цели были предприняты другие исследования либо путем дозированного добавления пикриновой кислоты [31], либо с использованием низкой температуры сбора данных [32]. Это можно объяснить дополнительным этапом, необходимым для получения решающего эффекта на остроту пика ОН при добавлении Cd, как описано выше. Однако кадмий, по-видимому, имеет большое значение, поскольку сигналы с высоким разрешением могут быть получены без необходимости добавления точных количеств, в отличие от пикриновой кислоты или получения спектров ЯМР при низких температурах.

2.2.2. Влияние температуры

Снижение температуры с 25°С до 15°С не повлияло на резкость сигналов фенольных или алифатических ОН. Тем не менее сдвиги пиков обменных протонов в слабое поле позволили нам разделить некоторые перекрывающиеся сигналы фенольных и алифатических ОН, что сделало их идентификацию более очевидной (рис. 3). При понижении температуры скорость протонного обмена снижалась, и можно было ожидать более резких пиков алифатических ОН [31]. Температура 15 градусов явно недостаточно низкая для получения хорошо разрешенных сигналов алифатических ОН. Однако это позволило четко выделить резонанс двух алифатических протонов ОН в образцах N3 и N6 и одного в образце N8. В спектре образца N2 также были обнаружены два сигнала алифатических протонов ОН, которые были более различимы при 25°C, чем при 15° (рис. 2E). В случае образца N4 сигналы, возникающие от алифатических OH, были лишь частично видны в спектры, независимо от того, была ли температура установлена ​​на 25 градусов или на 15 градусов C, из-за постоянного перекрытия (рис. 2E).

2.3. Структурная характеристика димерных стандартов — анализ спектра ЯМР.

Спектры ЯМР фракций N2, N3, N4, N6 и N8 показали, что продукты окисления имеют высокую чистоту, так как интенсивность сигналов других обнаруженных соединений составляет менее 10% по сравнению с сигналами этих продуктов.

Во всех спектрах можно выделить четыре области химического сдвига lH, типичные для катехиновых звеньев (рис. 2C): сигналы алифатических протонов пирановых колец (C-колец) обнаруживаются в области от 2,3 до 5,0 м.д., и ароматических сигнальных протонов резорциновых колец (кольца А) и катехиновых колец (приносит) от 5,5 до 6,3 м.д. и от 6,3 до 7,1 м.д. соответственно. Сигналы фенола OH колец A и B появляются в диапазоне от 7,1 до 10 м.д. Спектры ЯМР обеих фракций показали наличие отчетливых наборов сигналов катехиновых звеньев в постоянном соотношении интенсивностей: в спектрах фракций N2, N3, N6 и N8 наблюдались два набора сигналов в соответствии с наличием димеров и четыре набора в спектрах N4, которые могут соответствовать одному тетрамеру, двум димерам или смеси разных олигомеров, т. е. одному тримеру плюс один мономер. Для определения степени олигомеризации продуктов, присутствующих во фракции N4, был проведен эксперимент 'H DOSY с использованием смеси, содержащей аликвоты обеих фракций N4 и N2. Коэффициенты диффузии всех сигналов имели близкие значения (рис. 4), что указывает на присутствие двух димеров катехина во фракции N4.

Благодаря полностью разрешенным сигналам фенола ОН, которые обеспечивают надежные количественные результаты, тип связи между единицами катехина может быть непосредственно выведен из интеграции пиковой площади поверхности. Таким образом, для обеих фракций, N3 и N6, отсутствие одного ОНфенола (принадлежащего либо резорциновому, либо катехиновому кольцу) и отсутствие одного ароматического протона резорцина указывает на межфлавановую связь (МФС) эфирного типа, подразумевающую оппозицию в А или кольцо B и положение C6 или C8 в кольце A. В случае образца N2 отсутствовали два ароматических протона, один в кольце B и один в кольце A, что указывает на CA-CB IFL. 1D 'Н-спектр фракции N4 показал отсутствие двух протонов кольца В, а также двух протонов кольца А. Таким образом, связи между димерными звеньями фракции N4 относятся к обоим типам СС. Спектры фракции N8 сильно отличались от четырех других. Некоторые сигналы были типичны для катехиновых звеньев, в которых отсутствовали три протона ОН-фенолов, один ароматический А-кольцо и один В-кольцо, а также один алифатический ОН. С другой стороны, некоторые другие сигналы ЯМР нетипичны для катехинового звена: метилен с неслепыми химическими сдвигами 13С (~40 м.д.) и кетоновая группа (~192 м.д.).

Спиновые системы протонов колец C, A и B были определены с использованием спектров 'H 1D и 1H 2D TOCSY (не показаны). В спектрах фракций N2, N3, N6 и N8 наблюдались две системы спинов С-кольца ABMX (типичные для катехина), а для фракции N4 - четыре. В спектрах фракций N2, N3, N6 и N8 два метасопряженных дублета (J~2Hz) и один в области ароматического кольца А отнесены соответственно к протонам кольца А несвязанного катехинового звена. и к остаточному протону кольца A C6-или C8-связанного звена катехина. В спектрах N4 из-за присутствия двух димеров были обнаружены четыре метасопряженных дублета и два синглета, которые были отнесены, как описано выше. Протонные системы колец B также легко определялись по этим спектрам и позволяли идентифицировать две протонно-спиновые системы АВМ для димеров фракций N3 и N6, тогда как одна АВМ и одна протонно-спиновая системы АВ были обнаружены для димера N2 и одна АВМ и системы спина одного протона AM для димера N4. Димер N8 имеет только одну систему спинов В-кольца АВМ, типичную для мономера катехина.

2.3.1. Определение положения кольца А ИФЛ димеров фракций N2, N3, N4 и N6.

Установление мостика, расположенного в кольце А димеров (т. е. в положении С6А или С8А), требует отнесения остаточного протона НА КА-связанного катехинового звена. Благодаря высокому разрешению сигналов фенольных ОН легкой отправной точкой стала идентификация двух фенольных протонов ОН звеньев, связанных с кольцом А, т. е. кольца А, которое

had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 частей на миллион), которые легко отнести к C7A и C8A соответственно. Как только C6A и C8A назначены, остаточный протон HA может быть непосредственно связан со спектрами HSQC. Таким образом, было обнаружено, что этот остаточный протон HA представлял собой H6A для всех фракций N2, N3, N4, N6. Таким образом, IFL между единицами катехина подразумевает положение C8A для всех димеров.

2.3.2. Определение положения кольца B IFL

Димеры фракций N2 и N4. Спектры фракции N2 показали два разных типа протонно-спиновых систем кольца B: один AMX, соответствующий кольцу B несвязанного звена, и один AM с константой связи около 8 Гц, характерной для H6'B и H5'. B C2'B-сцепленной единицы. Таким образом, связь между единицами димера N2 представляет собой C2'B-C8A. Спектры ЯМР фракции N4 также показали различные системы спинов B: две системы AMX, соответствующие несвязанному B-кольцу, и две системы AXspin, обе из которых демонстрируют константы связи около 2 Гц, которые характерны для H2'B и H6'. B-протоны C5'B-связанных звеньев. Наличие дальних корреляций 'H/13C между полосами H6' и C8A, которые наблюдались в спектрах HMBC двух димеров, согласуется со связью C5/'B-C8A (рис. 5).

Димеры фракций N3 и N6. Спектры фракций N3 и N6 показали наличие двух протонных систем В-кольца АМХ и отсутствие одного фенольного сигнала ОН. Поскольку все фенольные протоны ОНА димерных звеньев были идентифицированы (как описано выше), отсутствующий фенольный сигнал ОН может быть сигналом ОН3'В или ОН4'В.

Положение OH (3'B или 4'B) можно легко определить с помощью корреляций ROE с H2'Bor H5'B соответственно или с использованием корреляций HMBC дальнего действия, как показано на рисунке 5.

Атрибуцию остаточного OH колец B легко выполнить с использованием корреляций дальнего действия HMBC или ROESY, как показано на рисунке 5. В случае димера N3 корреляция ROE наблюдалась между H5'B и остаточным OH. 'B катехинового звена связано через кольцо B. Таким образом, этот OH был идентифицирован как OH4'B. В случае фракции N6 остаточный OH'B был отнесен к OH3'B, поскольку между этим OH и H2'B наблюдалась корреляция ROE. Корреляции дальнего действия HMBC согласуются с этими атрибуциями. Затем определяли положения сцепления этих двух димеров следующим образом: CO3'B-C8A и CO4'B-C8A для N3 и N6. соответственно.

Фракция N8. Спектральный анализ димера N8 показал, что одной единицей этого димера является катехин с двумя позициями связи: одна в кольце A, одна в положении C8A, а другая в положении C-O7A, поскольку протоны H8A и OH7A отсутствующий. Другая единица этого димера демонстрировала особые спектральные характеристики, указывающие на потерю ароматичности кольца В и наличие нескольких положений связи как на кольцах В, так и на кольцах С.

Сигналы ЯМР 1Н, исходящие от кольца В, представляли собой два дублета при 2,49 и 2,71 м.д., демонстрирующие геминальную связь ~15 Гц (12,03 м.д.), типичную для метиленовой группы, и синглет при 6,38 м.д., возникающий от этиленового протона. Поскольку эти метиленовые и этиленовые протоны не связаны, они, вероятно, находятся в положениях 2'B и 5'B. Спектр HIMBC показал все корреляции, что позволило точно определить эти атомы углерода в кольце B, как показано на рисунке 5. H2C этой единицы дал три корреляции с атомами углерода в кольце B: одна — это метиленовый углерод при ~45 ppm, который, таким образом, был отнесен к C2'B и оставшиеся два, с атомами углерода, резонирующими при ~90 ppm и ~162 ppm, которые можно отнести к C1'B и C6'B. H5'B дали только сильные корреляции 3J с двумя четвертичными атомами углерода этого кольца B. : один - это углерод, ранее отнесенный к C3'B (~ 95 частей на миллион), а другой, который резонировал с частотой ~ 90 частей на миллион, таким образом, может быть отнесен к C1'B. Затем было установлено, что углерод при ~ 162 м.д. представляет собой C6'B.

Присутствие алифатического ОН (~5,8 м.д.) в положении C3'B (~95 м.д.) определяли по его корреляции ROE с обоими протонами H2'B. Кроме того, OH3/B дает корреляцию HMBC с четвертичным атомом углерода при ~192,5 м.д., что характерно для кетоновой группы в положении C4'B.

Экранирование этого C1'B около 40 частей на миллион соответствует потере ароматичности кольца B. Кроме того, отсутствие ОН в положении С7А другого звена согласуется с эфирной связью С1'ВО-С7А.

Данные ЯМР показали, что кольцо С ​​этого звена не содержит ОН3С. Наличие связи C3C-O-C3'B соответствует экранированию C3C около 1,5 м.д., а также химическому сдвигу C3'B, типичному для полукетального углерода (95 м.д.).

В целом данные спектров ЯМР позволяют сделать вывод, что этот димер соответствует дегидрокатехину А, описанному ранее Winges et al. [33]. а затем Гайо и др. [20].

Структуры шести димерных соединений, определенные с помощью этих анализов ЯМР, показаны на фиг. 6, где N2, N3, N6 и N8 представляют собой чистые продукты, а N4 представляет собой смесь двух изомеров.

3. Материалы и методы

3.1.Химикаты

(плюс)-гидрат катехина Больше или равно 98 процентам; лакказа из Trametes Versicolor (0,94 ед.·мг-1); дигидрат двухосновного фосфата натрия Больше или равно 98 процентам; лимонная кислота (реагент ACS, тетрагидрат нитрата кадмия 99,997%; муравьиная кислота и амберлит XAD7HP были получены от Sigma-Aldrich) (Сент-Луис, Миссури, США). кислота (ТФУ) от Roth Labo (Карлсруэ, Германия). ЖХ-МС воды, ЖХ-МС ацетонитрила (ACN) и ЖХ-МС метанола (MeOH) были получены от VWR (Раднор, Пенсильвания, США).

3.2. Приготовление модельного винного раствора

Модельный винный раствор представлял собой раствор этанол/вода (12/88; о/о) с ​​0,033 М винной кислоты, pH которого доводили до 3,6 с помощью 1 М NaOH [34].

3.3. Экстракты сырого винограда PPO

Экстракт ПФО готовили, как описано ранее Синглтоном и др. [35]. Замороженный виноград сначала смешивали с ацетатным буфером (1,5 М, рН 5; 10 г л-1 аскорбиновой кислоты). Затем смесь фильтровали и центрифугировали (3000 g, 10 мин). Наконец остаток промывали ацетоном (80%) и сушили на воздухе.

3.4. Лакказа из Botrytis Cinerea

Лакказу из Botrytis cinerea получали, как описано Quijada-Morin et al. [36]. Он был получен из штамма VA612 (собранного в 2005 на винограднике в Отвилле, Шампань, Франция, из сорта Пино Нуар). Вкратце, культуры на твердой солодовой дрожжевой среде оставляли на одну неделю при 24 градусах под синим светом. Затем споры соскребали и инокулировали в колбу Эрленмейера на 500 мл, содержащую 125 мл культуральной среды (4{{30}} г/л-1глюкозы, 7 gL{{10}}глицерин, 0,5 г·л-1L-гистидин,0,1 г:л-1 CuSO,1,8гл-1 NaNO3,0,5г:л -1 KCl, 0,5 г л-1 CaCl2·H2O, 0,05 г:л-1 FeSO4.7H2O, 1,0 г L-1KH2PO4 и 0,7 г л-1 MgSO 4-7H2O). После 3 дней инкубации и 2 дней роста в той же предыдущей среде к прекультурам добавляли галловую кислоту (2 г/л-1). Через 5 дней жидкую среду фильтровали и супернатант подвергали тангенциальной фильтрации в системе фильтрации Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England), снабженной мембраной с отсечкой по молекулярной массе 30 кДа. Наконец, концентрат подвергали диафильтрации против дистиллированной воды, при этом сохраняли только фракции, обладающие окислительной активностью в отношении ABTS (степень -80).

3.5.Процедура окисления

Раствор лакказы (1 г л -1) в фосфатно-цитратном буфере был предварительно приготовлен и добавлен к 6 г л -1 (плюс) раствора катехина (образцовое вино) для получения конечной концентрации лакказы { {6}}.3 гл-1. Затем полученный раствор медленно перемешивали (180 об/мин) при комнатной температуре в течение 2 часов. Концентрации были предварительно оптимизированы, и эксперимент был проведен в трех экземплярах.

3.6. Остановка реакции на смоле Amberlite XAD7HP

Колонку с амберлитом кондиционировали этанолом (абсолютным) и промывали двумя объемами колонки милли-О воды. Предыдущую реакционную среду лакказа/(плюс)-катехин накапывали на колонку и сначала элюировали двумя объемами колонки с милли-Qводой [37]. Затем колонку элюировали этанолом до тех пор, пока собранная фракция не обесцвечивалась. Оставляли только этанольные фракции, упаривали и лиофилизировали. Порошок хранился при температуре -80 градусов до использования.

3.7. Процедура очистки димерной фракции с использованием флэш-хроматографии.

Лиофилизированный порошок сначала очищали с использованием системы флэш-хроматографии puriflash430, оснащенной УФ-детектором, настроенным на 280 нм, и колонкой Puriflash diol 50 мкм f0025. Бинарная подвижная фаза состояла из ацетонитрила (растворитель А) и метанола (растворитель В), оба подкисленных 0,1% ТФУ. Серию инъекций выполняли при постоянной скорости потока 20 мл·мин-1, используя следующий градиент: 100% А в течение 4,4 мин; 0-10 процентов B за 10 минут; 10 процентов B за 5 минут; 10-90 процентов B за 5 минут; 90 процентов B за 3 минуты; 90-10 процентов B за 2 минуты; 10 процентов B за 10 минут. Объем инъекции составлял 1 мл (300 мг лиофилизированного порошка, растворенного в 1 мл растворителя А). Каждый раз собирали три отдельные фракции. Первый соответствовал остаточному (плюс)-катехину, а третий представлял собой смесь высокомолекулярных полифенолов. Вторую элюированную фракцию, содержащую смесь димерных продуктов окисления, выпаривали и лиофилизировали перед второй стадией очистки.

3.8. Методика очистки продуктов окисления от димерной фракции с использованием полупрепаративной хроматографической системы

Фракцию, содержащую димерные продукты окисления, очищали с использованием полупрепаративной хроматографической системы среднего давления Bio-Rad NGC 10, оснащенной обращенно-фазовой колонкой Varian Dynamax C18 Microsorb (250 × 21,2 мм; 3 мкм). Бинарная подвижная фаза состояла из воды Milli-O (растворитель A) и 80% ацетонитрила, 20% воды Milli-Q (растворитель B), обе подкислены 0,05% TFA. Серию инъекций (300 мкл) лиофилизированного порошка (20 мг, растворенных в 200 мкл растворителя А и 100 мкл ацетонитрила) выполняли при следующих условиях элюирования: 100% А в течение 4 мин; 0-35 процентов B за 46 минут; 35-100 процентов B за 2 минуты; 100 процентов B за 5 минут. Каждый раз собирали восемь отдельных фракций, соответствующих чистым сигналам UPLC при 280 нм. Каждую фракцию выпаривали и лиофилизировали перед ЯМР-анализом.

3.9. Подготовка проб для ЯМР-анализа

Около 1 мг каждого лиофилизированного порошка, взвешенного в пробирках Эппендорфа, растворяли в 500 мкл ацетона-dg. Затем к образцам добавляли ~10 мкл концентрированного раствора нитрата кадмия в ацетоне-d и полученные растворы переносили в 5-мм ЯМР-пробирки для ЯМР-анализа. Для некоторых образцов проводили дополнительную стадию: после солюбилизации лиофилизированных порошков в ацетоне-dg в присутствии следов кадмия образцы выпаривали досуха, а затем повторно растворяли в ацетоне-d без дальнейшего добавления Cd.

3.10. Технические характеристики прибора

УЭЖХ-МС анализ. Реакции контролировали с использованием двух систем UPLC-MS. Первый использовался для точного определения времени удерживания продуктов с использованием метода длинного градиента. т.е. обращенно-фазовая сверхвысокоэффективная жидкостная хроматография Waters в сочетании с масс-спектрометрией (UHPLC-MS). Система жидкостной хроматографии представляла собой Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA), оснащенную матричным фотодиодным детектором. Мы использовали колонку Acquity UPLC HSS T3 (1,8 мкм, 2,1 × 150 мм). Температура колонки была 25 градусов. Бинарная подвижная фаза состояла из 0,1% муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В). Разделение проводили при постоянной скорости потока 0,25 мл·мин-1, используя следующий градиент: 8-11 процент В за 2 мин; 11 процентов В за 8 мин; 11-25 процентов B за 15 минут; 25-55 процентов Bin 5 мин; 55-99 процентов Bin 1 мин; 99 процентов B за 4 минуты; 99-8 процентов Bin1 мин; 8 процентов B в течение 4 мин. Объем инъекции составлял 5 мкл. Масс-спектрометр представлял собой простой квадрупольный электрораспылительный ионизатор (ESI) Waters Acquity QDa (Waters, Milford, MA, USA). Капиллярное напряжение устанавливалось равным 0,8 кВ. Масс-спектры были получены в диапазоне масс 200-900 Thin в моде положительных ионов.

Вторая система УВЭЖХ-МС, используемая для быстрой проверки на этапах очистки, была такой же, как описано ранее, с колонкой Acquity UHPLC HSS T3 (1,8 мкм, 2,1×100 мм) с подогревом. при 38 град. Разделение проводили при постоянной скорости потока 0,55 мл·мин-1, используя следующий быстрый градиент: 0,1-40% В за 5 мин; 40-99 процентов B за 2 мин; 99 процентов B в течение 1 мин; 99-0.1% B за 1 мин. Объем инъекции составлял 2 мкл. Масс-спектрометр представлял собой ионную ловушку Bruker Amazon X с ионизацией электрораспылением (ESI) (Bruker Daltonics, Бремен, Германия). Капиллярное напряжение было установлено на уровне -5,5 кВ. Масс-спектры были получены в диапазоне масс 50-2000 Thin в моде положительных ионов.

Все анализы УЭЖХ-МС были выполнены в трех повторностях.

Аппаратура ЯМР. Все спектры ЯМР были записаны на спектрометре Agilent DD{{0}} МГц (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), работающем на частотах 500,05 и 125,74 МГц для ядер протона и углерода-13, соответственно, с использованием 5-мм зонда непрямого обнаружения, снабженного градиентной катушкой. 1D'H и 13C, 2Dгомоноядерные1H TOCSY и ROESY, а также гетероядерные lH/13C HSQC и HMBC. Эксперименты проводились с использованием классических последовательностей импульсов и анализировались с использованием как VNMRJ4.2, так и MestReNova 14.2. .1 (Mestrelab Research, Испания). Измерения DOSY были получены и обработаны, как описано ранее 38]. Параметры сбора последовательности импульсов DgcsteSL были следующими: время задержки диффузии и ширина градиентного импульса были установлены на 50 мс и 2 мс соответственно, сила градиента (g) увеличивалась за 16 шагов с одинаковым интервалом g2 от 0,3 до 32G·см-I. После фазовой коррекции спектры 2D DOSY были построены на основе измерения высоты пика с использованием программного обеспечения VNMRJ4.2.

Все спектры относились к сигналам растворителя ацетон-dg (остаточный сигнал 'Н при 2,05 м.д. и сигнал 13С при 29,92 м.д.).

4. Выводы

Было исследовано действие трех различных оксидоредуктаз (полифенолоксидазы, экстрагированной из винограда, лакказы из Botrytis cinerea и лакказы из Trametes Versicolor) на (плюс)-катехин, и результирующие профили ЖХ-УФ-МС были очень похожими, хотя и с некоторыми незначительными различиями. предположил возможные различия в реакционной способности этих ферментов.

Структуры шести продуктов катехин-лакказного окисления (с использованием лакказы Trametes Versicolor) были получены на основе специфических сигнатур ЯМР (четыре чистых продукта, т.е. N2, N3, N6 и N8, и N4, соответствующие смеси два изомера). Полная атрибуция фенольных сигналов ОН стала возможной благодаря добавлению нитрата кадмия с процедурой пробоподготовки, которая позволила однозначно определить связи между катехиновыми звеньями для некоторых представляющих интерес соединений. Эта процедура значительно упростит ЯМР-анализ смесей полифенолов, как синтезированных, так и экстрагированных из природных продуктов.

Стандарты, полученные в этой работе, могут быть использованы в будущем в качестве маркеров окисления для изучения их присутствия и эволюции в процессе созревания винограда и выдержки вина. Помимо катехина, другие полифенольные соединения, включая флавоноиды и нефлавоноиды, также могут быть использованы в качестве субстратов лакказы для получения дополнительных новых стандартов.

Сокращения

ЯМР: ядерный магнитный резонанс,

Cd: кадмий,

TOCSY: полная корреляционная спектроскопия,

ROESY: Ядерная спектроскопия с эффектом Оверхаузера с вращающейся системой отсчета,

HSQC: гетероядерный одноквантовый корреляционный эксперимент,

HMBC: гетероядерная многодиапазонная связь,

DOSY: диффузионно-упорядоченная спектроскопия.

использованная литература

1. Хан, Н.; Мухтар, Х. Полифенолы чая для укрепления здоровья. Жизнь наук. 2007, 81, 519–533. [Перекрестная ссылка]

2. Файель, Н.; Вальверду-Керальт, А.; Медек, Э.; Хюэ, К.; Буланже, Р .; Ченье, В.; Соммерер, Н. Характеристика новых производных Flavan-3-Ol в ферментированных какао-бобах. Пищевая хим. 2018, 259, 207–212. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

3. Римбах Г.; Мельчин, М .; Мёринг, Дж.; Вагнер, А. Е. Полифенолы из какао и здоровье сосудов — критический обзор. Междунар. Дж. Мол. науч. 2009, 10, 4290–4309. [Перекрестная ссылка]

4. Аврам А.М.; Морин, П.; Браунмиллер, К.; Ховард, LR; Сенгупта, А .; Викрамасингх, С.Р. Концентрация полифенолов в экстракте черничного жмыха с использованием нанофильтрации. Пищевые продукты Биопрод. Процесс. 2017, 106, 91–101. [Перекрестная ссылка]

5. Антониолли, А.; Фонтана, Арканзас; Пикколи, П.; Боттини, Р. Характеристика полифенолов и оценка антиоксидантной способности виноградных выжимок сорта Cv. Мальбек. Пищевая хим. 2015, 178, 172–178. [Перекрестная ссылка]

6. Saucier, C. Как полифенолы вина эволюционируют во время выдержки вина? Церевизия 2010, 35, 11–15. [Перекрестная ссылка]

7. Оливейра, CM; Феррейра, ACS; Де Фрейтас, В.; Сильва, Механизмы окисления AMS, происходящие в винах. Еда Рез. Междунар. 2011, 44, 1115–1126. [Перекрестная ссылка]

8. Синглтон В.Л. Кислород с фенолами и родственными реакциями в суслах, винах и модельных системах: наблюдения и практические выводы. Являюсь. Дж. Энол. Витик. 1987, 38, 69–77.

9. Мэтью, А.Г.; Парпия, HAB Food Browning как реакция полифенолов. В достижениях в области пищевых исследований; Чичестер, Колорадо, Мрак, Э.М., Стюарт, Г.Ф., ред.; Academic Press: Кембридж, Массачусетс, США, 1971; Том 19, стр. 75–145. [Перекрестная ссылка]

10. Гамбути, А.; Ринальди, А .; Ульяно, М .; Мойо, Л. Эволюция фенольных соединений и терпкости при выдержке красного вина: влияние воздействия кислорода до и после розлива в бутылки. Дж. Агрик. Пищевая хим. 2013, 61, 1618–1627. [Перекрестная ссылка] [PubMed]