Различия в экспрессии генов между двумя линиями Sorghum Bicolor, различающимися по реакции врожденного иммунитета

Абстрактный:

Микробно-ассоциированный молекулярный паттерн (MAMP), запускаемый иммунитетом (MTI), является ключевым компонентом врожденного иммунного ответа растения на распознавание микробов. Тем не менее, большая часть наших текущих знаний о MTI исходит от модельных растений (т. е. Arabidopsis thaliana), а с культурными растениями проделана сравнительно меньшая работа. В этой работе мы изучили запускаемый MAMP окислительный взрыв (ROS) и транскрипционный ответ у двух генотипов Sorghum bicolor, BTx623 и SC155-14E. SC155-14E — это линия, демонстрирующая высокую устойчивость к антракнозу, а линия BTx623 чувствительна к антракнозу. Наши результаты выявили четкие различия в экспрессии генов и АФК в ответ либо на флагеллин (flg22), либо на выработку хитина между двумя линиями. Хотя транскрипционный ответ на каждый MAMP и в каждой линии был уникальным, существовала значительная степень перекрытия, и мы смогли определить основной набор генов, связанных с транскрипционным ответом MAMP сорго. Анализ обогащения термина GO и пути KEGG обнаружил больше DEG, связанных с иммунитетом и устойчивостью к патогенам, в образцах SC155-14E, обработанных MAMP, чем в BTx623 с той же обработкой. Результаты обеспечивают основу для будущих исследований по изучению путей врожденного иммунитета у сорго, включая усилия по повышению устойчивости к болезням.

Нажмите, чтобы купитьпродукт для повышения иммунитета

    For more information:1950477648nn@gmail.com

Ключевые слова:

сорго двухцветное; РОС; врожденный иммунитет; МАМП; РНК-последовательность; экспрессия генов

1. Введение

Растения естественным образом подвергаются различным стрессам, в том числе многочисленным бактериальным, грибковым и вирусным патогенам [1]. Растения защищают себя от патогенов с помощью предварительно сформированных структур и химических веществ, а также реакций иммунной системы, вызванных инфекцией. Иммунная система растений использует двухуровневую систему восприятия с двумя взаимосвязанными слоями рецепторов.

Первый уровень активируется локализованными на поверхности рецепторами распознавания образов (PRR), которые обнаруживают молекулы вне клетки, распознавая вторгшийся патоген посредством обнаружения консервативных структурных мотивов, называемых микробно-ассоциированными молекулярными паттернами (MAMP), которые вызывают умеренное, но широкая, защитная реакция [2]. Примерами хорошо изученных MAMPs являются флагеллин, хитин, липополисахариды, пептидогликаны (PGN) и фактор элонгации Tu [3–5]. Этот защитный ответ называется MAMP-триггерным иммунитетом (MTI) [6]. Второй уровень защиты, известный как эффектор-триггерный иммунитет (ETI), возникает в ответ на специфические эффекторные белки патогенного происхождения, которые распознаются растением посредством действия белков резистентности, что приводит к сильному, но высокоспецифичному иммунному ответу. ETI часто можно распознать по индукции локализованной гибели клеток, называемой гиперчувствительным ответом (HR) [7]. Как системы MTI, так и ETI обнаруживают патогены и реагируют, активируя противомикробную защиту в инфицированной клетке и соседних клетках [3,8]. Растения также несут иммунные рецепторы, которые распознают высоковариабельные эффекторы патогенов, в том числе белки класса NBS-LRR [9].

Кроме того, системная приобретенная устойчивость (SAR) представляет собой реакцию устойчивости «всего растения», которая возникает после более раннего локального воздействия патогена. SAR связан с индукцией широкого спектра генов (генов, связанных с патогенезом), и для активации SAR необходимо накопление эндогенной салициловой кислоты (СК) [10].

Исследования, проведенные в основном с использованием арабидопсиса, показали, что MTI может вызывать различные реакции, включая изменения в продукции активных форм кислорода (АФК), продукции активных форм азота, таких как оксид азота (NO), отложение каллозы, уровни внутриклеточного кальция, поток ионов через плазму. мембраны, индукция или репрессия экспрессии нескольких генов, связанных с защитой растений, изменения в клеточной стенке растений, индукция антимикробных соединений и синтез белков, связанных с патогенезом (PR) [3,11].

Хотя некоторые из этих реакций MTI можно считать общими реакциями растений, их величина может зависеть от вида растения и даже от сорта [12–17]. Были разработаны методы количественной оценки реакции растений на MTI. Эти методы включают измерение продукции АФК или NO, фосфорилирования митоген-активируемой протеинкиназы, специфической экспрессии генов, индуцированной MAMP, ингибирования роста проростков, фенолов, связанных с лигнином и клеточной стенкой, и индуцированной MAMP устойчивости к бактериальным и грибковым патогенам [18–20].

Сорго двухцветное (L.) Moench является ключевой мировой зерновой культурой, адаптированной к различным средам обитания и выведенной для различных целей [21]. Ожидается, что выращивание сорго во всем мире существенно возрастет как одной из основных культур для производства продуктов питания и биомассы [22].

По мере расширения практики и географических площадей выращивания сорго неизбежно будет увеличиваться давление болезней. Сорго отличается от других злаков необычайно широким спектром болезней, что является одним из наиболее важных препятствий для его производства. Во всем мире широко распространенные грибковые заболевания являются наиболее разрушительными болезнями сорго, которые приводят к огромным потерям урожая, как с точки зрения количества, так и качества зерна [23]. Антракноз является одним из наиболее серьезных грибковых заболеваний, влияющих на урожайность зерна сорго и производство биомассы. Потери урожая из-за этого патогена могут составлять от 50 до 70 процентов у восприимчивых сортов [24,25]. Растения разработали различные стратегии защиты для борьбы с вторжением патогенов. У сорго эти стратегии включают активацию PR-белков [26], накопление перекиси водорода [27] и биосинтез флавоноидных фитоалексинов [28]. Различные подходы использовались для изучения реакции устойчивости сорго, определения защитных соединений и определения физических барьеров против антракноза (см. обзор [29,30]). Исследования экспрессии генов широко использовались для идентификации генов-кандидатов устойчивости в растениях на основе дифференциальной экспрессии между устойчивыми и восприимчивыми сортами или растениями, не инокулированными и инокулированными патогенами (например, ссылки [31–37]). Wang et al. [37] выполнили транскриптомный анализ для изучения реакции сорта сорго BTx623 на C. subline-ola. Они сообщили, что гены, участвующие в метаболизме фенилпропаноидов и биосинтезе вторичных метаболитов, были идентифицированы как дифференциально экспрессирующиеся в ответ на заражение патогеном по сравнению с контрольными растениями без прививки.

Однако эти эксперименты проводились с сеянцами восприимчивого сорта BTx623. Дополнительные транскриптомные исследования для сравнения реакции экспрессии генов на патоген в восприимчивых и устойчивых сортах сорго будут иметь ценность. Следовательно, важно понимать генетическую архитектуру, контролирующую базальную устойчивость сорго к болезням, и ее связь с количественной устойчивостью к болезням.

В качестве начального шага в этом направлении мы недавно провели скрининг набора разнообразной зародышевой плазмы сорго на предмет вариабельности их реакции на flg22 и выделение хитина, а также устойчивости к грибковым заболеваниям [38]. В этом случае MTI количественно определяли путем измерения продукции АФК при активации MAMP. Среди результатов этого более раннего исследования была идентификация генотипов сорго, которые демонстрировали либо сильную, либо слабую реакцию на выявление MAMP.

Высокопроизводительное секвенирование следующего поколения и изучение транскриптомов могут помочь прояснить реакцию растений на грибковые инфекции и улучшить понимание реакции хозяина. Транскриптомный анализ широко использовался для изучения реакции растений на грибковую инфекцию у многих видов растений, включая злаковые культуры (например, ссылки [31–37]).

Однако опубликованные данные по сравнительному транскриптомному анализу злаковых культур в основном сосредоточены на реакции на различные патогены. Что касается сорго, в нескольких публикациях основное внимание уделялось сравнению транскриптомов растений, обработанных различными патогенами, включая антракноз [35,37]. В некоторых предыдущих публикациях предполагалось, что нет существенной корреляции между реакцией на MAMP и грибковым заболеванием. Например, Чжан и др. [17] сообщили о сильной корреляции между реакцией на два MAMP flg22 и хитин в популяции картирования кукурузы, но об отсутствии корреляции с реакцией на грибковое заболевание. Кимбалл и др. [38] также сообщили о низкой корреляции между показателями реакции АФК, индуцированными flg22-, и показателями устойчивости к целевой пятнистости листьев в двух популяциях RIL сорго, включая популяцию BTx623/SC155-14E. Поэтому, учитывая нехватку данных, мы сочли важным профилировать транскрипцию ответа сорго на обработку MAMP.

В этом текущем отчете мы расширяем наш предыдущий анализ, измеряя глобальный ответ транскрипции на выявление MAMP. Мы использовали анализ секвенирования РНК на основе Illumina для изучения транскрипционных изменений в ответ на обработку либо flg22, либо хитином у сорго генотипов BTx623 и SC155-14E, которые мы ранее охарактеризовали как слабые и сильные MTI-ответчики соответственно. BTx623 — эталонная линия генома Sorghum bicolor [22], а SC155-14E — линия, проявляющая повышенную устойчивость к антракнозу [39]. Патил и др. [39] сообщили, что SC155-14E продемонстрировал высокий уровень стабильной устойчивости (почти полное отсутствие болезни) к антракнозу во всех протестированных средах, в то время как BTx623 чувствителен к этому грибковому заболеванию. Наш анализ секвенирования РНК выявил 5252 и 8085 дифференциально экспрессируемых генов (DEG) в BTx623, обработанных flg22 и хитином, соответственно, и 3849 и 5786 DEG в SC155-14E, обработанных flg22 и хитином, соответственно, по сравнению с необработанными ложными контролями. из этих двух генотипов.

Кроме того, сравнение DEG, выбранных с использованием двух разных биоинформационных конвейеров, показало очень похожие результаты. Профили экспрессии дифференциально экспрессируемых генов, анализ обогащения онтологии генов (GO) и анализ обогащения пути KEGG показали явную генотипическую вариацию в экспрессии генов, связанных с MTI. Результаты обогащения термина GO и пути KEGG выявили большее количество DEG, связанных с иммунитетом и устойчивостью к патогенам (гены PR, гены ответа на хитин, гены ответа на салициловую кислоту, гены ответа на стресс и т. д.), представленные в обработанных MAMP SC{{4} } Образцы E по сравнению с обработанными MAMP BTx623. Результаты обеспечивают основу для идентификации различных компонентов ответа MTI сорго.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Вариации окислительного взрыва в разных листьях сорго

Наш предыдущий анализ реакции MTI различных генотипов сорго выявил значительную вариацию в запускаемом MAMP окислительном взрыве между генотипами BTx623 и SC155-14E [38]. При этом линия SC155-14E является высокоустойчивой к антракнозу, тогда как линия BTx623 чувствительна к антракнозу [39]. Именно по этим причинам эти два генотипа были выбраны для сравнения с использованием RNA-seq.

При проведении более ранних измерений АФК мы обнаружили значительные различия даже в пределах одного и того же растения, что побудило нас более тщательно изучить источник этих изменений. В частности, мы протестировали выработку АФК с использованием трех наборов листьев, идущих от основания к верхушке пятнадцатидневных растений BTx623 и SC155-14E. Листья были отмечены как № 1, № 2 и № 3, снизу вверх, как показано на рисунке 1А. Результаты анализа АФК (рис. 1В) показали, что: (1) уровень продукции АФК был ниже в более старых листьях (лист № 1), в то время как самые высокие уровни продукции АФК в ответ на действие flg22 или хитина были в самых молодых листьях ( лист №3). (2) Как обработанные MAMP, так и необработанные BTx623 2и самые молодые листья (лист № 2) давали сравнительно низкие уровни продукции АФК.

Напротив, обработанные MAMP вторые самые молодые листья SC155-14E продуцировали значительно (на уровне 0.01) более высокие уровни продукции АФК, чем необработанные образцы, а также обработанные или образцы BTx{ {5}}-й самый молодой лист. (3) Окислительный всплеск, вызванный применением flg22 или хитина, был обнаружен в листовых дисках самых молодых листьев (лист № 3) обоих генотипов, хотя, как наблюдалось ранее, уровни продукции АФК были выше в обработанных MAMP SC. 155-14E относительно BTx623. Динамика продукции АФК, запускаемой flg22-и запускаемой хитином, во втором самом молодом листе SC155-14E показала, что продукция АФК, запускаемая хитином, происходила раньше, чем продукция АФК, запускаемая flg22- (рис. 1C). ). Аналогичные результаты были получены Zhang et al. [17], где продукция АФК, запускаемая хитином, появлялась раньше, чем продукция АФК, запускаемая flg22-, у проростков кукурузы, обработанных flg22 и хитином. Сообщалось [40], что продукция АФК в ответ на flg22 показала самую высокую продукцию АФК около 12 минут и была самой низкой через 30 минут у арабидопсиса. Наши результаты анализа АФК в сорго показали самую высокую продукцию АФК примерно через 13 минут и самую низкую через 30 минут после обработки flg22, что очень похоже на результаты для арабидопсиса. Поскольку нашей целью было найти оптимальные условия для сравнения MTI-ответа двух генотипов, мы выбрали вторые самые молодые листья 15-дневных растений для выделения РНК и последующего транскриптомного анализа. Различия между листьями отдельных растений сорго напоминают о том, что результаты могут различаться между экспериментами в зависимости от источника, времени и других особенностей данного эксперимента и, следовательно, параметры эксперимента необходимо тщательно контролировать.

Окислительный взрыв, быстрое, преходящее производство активных форм кислорода (АФК), является одним из самых ранних наблюдаемых аспектов защитной реакции растения [41]. Учитывая, что всплеск АФК является немедленным ответом, ожидается несколько более поздний ответ транскрипции генов, связанных с MTI. Мы собрали образцы через 60 минут после обработки MAMP для анализа RNA-Seq.

2.2. Дифференциально экспрессируемые гены (DEG) BTx623 и SC155-14E в ответ на лечение MAMP

Для оценки уровня экспрессии аннотированных генов, кодирующих белок Sorghum bicolor, для каждого образца было рассчитано количество чистых прочтений последовательностей РНК, которые сопоставлены с каждым геном, а затем нормализовано в FPKM (фрагментов на модель экзона т.п.н. на миллион картированных фрагментов). Были исследованы изменения экспрессии каждого гена в обработанных MAMP листовых дисках BTx623 и SC155-14E по сравнению с имитацией (водной) обработкой. Общее количество экспрессированных генов было одинаковым при всех обработках обоих генотипов: 27 171, 27 283, 27 161, 27 182, 27 512 и 27 175 генов, экспрессированных в имитации BTx623, flg22-обработанном BTx623, обработанном хитином BTx623, имитации SC{ {22}}E, flg22-обработанный SC155-14E и обработанный хитином SC155-14E соответственно. Мы использовали эталонный геном BTx623 для картирования чтения в обеих линиях, поскольку конкретная ссылка для SC155-14E недоступна. Номера экспрессированных генов, полученные от BTx623 и SC{{30}}E со всеми вышеперечисленными условиями, показали, что обе линии имеют одинаковое количество экспрессируемых генов. Общая частота картирования считывания образцов SC155- 14E mock (3 повтора), SC155-14E, обработанных flg22 (3 повтора), SC155-14E, обработанных хитином (3 повтора). , имитация BTx623 (3 повтора), BTx623, обработанный flg22 (3 повтора), BTx623, обработанный хитином (3 повтора), были: 93,6%, 93,9%, 93,9%, 93,8%, 93,9%, 93,6%, 93,5%, 93,5%. , 93,1 % , 96,9 % , 97,0 % , 97,0 % , 97,2 % , 96,8 % , 97,0 % , 96,9 % , 97,0 процентов, 97,0 процента соответственно. Эти результаты свидетельствуют о том, что различные эффекты обработки MAMP на транскриптомы BTx623 и SC155-14E не были связаны с различиями в геномной последовательности между двумя генотипами.

График PCA экспрессии генов дает представление об ассоциации между образцами. Чтобы изучить сходство наших образцов, мы провели анализ PCA. Образцы графиков на PC1 и PC2 (рис. 2) показали, что четыре экспериментальных условия (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_хитин и SC{ {10}}Е_хитин) были сильно разобщены. Напротив, три биологических повтора каждой линии сорго и каждой обработки MAMP, а также имитация обработки были тесно сгруппированы вместе, соответственно, что указывает на хорошую воспроизводимость между биологическими повторами (рис. 2).

Графики вулканов на рис. 3 показывают экспрессию генов в двух линиях сорго, обработанных flg22 или хитином. Вулканический график — это тип диаграммы рассеяния, который показывает статистическую значимость (p-значение) в зависимости от величины изменения (кратность изменения). Это позволяет быстро визуально идентифицировать гены с крупнократными изменениями, которые также являются статистически значимыми. Это могут быть наиболее биологически значимые гены. На рисунке 3 гены с -log10 (значение p), равным или превышающим 3, считаются DEG. Красные точки обозначают ДЭГ, а черные точки обозначают не-ДЭГ. На каждом графике гены с log2 (кратность _изменения) больше 0 являются генами с повышенной активностью, в противном случае - генами с пониженной регуляцией. Наиболее активные гены расположены справа, наиболее подавленные гены — слева, а наиболее статистически значимые гены — вверху.

Дифференциально экспрессируемые гены (DEG) были выбраны из каждой обработки в соответствии с их значимостью экспрессии (p-значение 0.001). Следует отметить, что мы использовали p-значение 0.001 в качестве нашего порога, но не FDR (значения q) для выбора DEG в этом отчете. FDR (значения q) также были значительными на этом уровне (таблицы S2–S5). При p-значении 0,001 FDR составляли 0,0039, 0,0051, 0,0025 и 0,0035 для BTx623 с обработкой flg22, SC155-14E с обработкой flg22, BTx623 с обработкой хитином и SC{{ 26}}E с обработкой хитином соответственно. Значения p и q генов BTx623 и SC155-14E во всех условиях перечислены в таблицах S2–S5. Анализируя паттерны экспрессии этих генов в обработанных MAMP листьях BTx623 и SC155-14E, мы обнаружили большое количество генов (14–30 процентов от общего числа экспрессируемых генов), которые демонстрировали большие различия после flg22 или хитина. обработки в обеих линиях сорго. Общее количество ДЭГ обработанного хитином BTx623 (8085) было очень близко к количеству, о котором сообщалось в предыдущем исследовании транскриптома BTx623, инфицированного возбудителем антракноза C. subline-ola (8078) [37]. Количество DEG было выше в листьях BTx623, обработанных flg22 (19 процентов) или хитином (30 процентов), по сравнению с SC155-14E (14 процентов и 21 процент соответственно).

Хотя более высокое количество DEG в обработанном MAMP BTx623 по сравнению с SC155-14E было противоположным ответу ROS этих двух генотипов, это, возможно, неудивительно, поскольку ответ ROS и ответ экспрессии генов на обработку MAMP происходят в разное время, в значительной степени независимы и опосредованы разными механизмами [42,43]. Термин GO и обогащение пути KEGG выявили больше DEG, связанных с иммунитетом и устойчивостью к патогенам, представленных в образцах SC155-14E, обработанных MAMP. Более того, тот факт, что количество ДЭГ было выше в образцах, обработанных хитином, по сравнению с образцами, обработанными flg22, хорошо согласовывался с анализом реакции АФК (рис. 1В), где мы наблюдали более сильную реакцию АФК при обработке хитином.

Чтобы выяснить, в какой степени гены и биологические процессы являются общими для обработок flg22 и хитина в BTx623 и SC155-14E, мы более подробно сравнили их DEG. Диаграммы Венна на рисунке 4A показывают перекрытие DEG в целом, наборы генов с повышающей и понижающей регуляцией при p-значении 0,001. Из общего количества 10 535 DEG основной набор из 2272 генов реагировал на обработку как flg22, так и хитином в обеих линиях сорго. Точно так же из общего числа 5410 генов с повышенной экспрессией основной набор из 1778 генов был с повышенной регуляцией в обоих генотипах, в то время как из общего количества 5125 генов с отрицательной регуляцией основной набор из 474 генов был с пониженной регуляцией в обоих генотипах. генотипы.

Представленные здесь данные секвенирования РНК были проанализированы с использованием конвейера биоинформатики с инструментами Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 и Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) с параметрами по умолчанию (конвейер № 1). Для дальнейшего подтверждения результатов анализа мы использовали другой конвейер (конвейер № 2) с HiSat2, HTSeq и edgeR для выполнения анализа. HiSat2 — это следующая разработка TopHat2. Мы сравнили DEG для каждого состояния (т. е. два генотипа, обработанных flg22 или хитином, все DEG с повышающей или понижающей регуляцией), отобранные с использованием обоих каналов. Результаты (рисунок 5) показали, что числа ДЭГ, выбранные с использованием обоих конвейеров, были очень близкими.

Общее количество DEG, выбранных для конвейера №1 и конвейера №2, составило BTx623_flg22: 5241 против 5413; SC155-14E_flg22: 3849 против 3476; BTx623_хитин: 8085 против 8320; SC155-14E_хитин: 5786 по сравнению с 5383. ДЭГ с повышающей регуляцией, выбранные с конвейером №1 по сравнению с конвейером №2, были BTx623_flg22: 3074 по сравнению с 3076; SC155-14E_flg22: 2591 против 2483; BTx623_хитин: 4156 против 4583; SC155-14E_хитин: 3486 по сравнению с 3346. ДЭГ с пониженной регуляцией, выбранные с конвейером №1 по сравнению с конвейером №2, были BTx623_flg22: 2152 по сравнению с 2237; SC155-14E_flg22: 1257 против 993; BTx623_хитин: 3919 против 3757; SC155-14E_хитин: 2296 по сравнению с 2037. Кроме того, результаты на рис. 5 также показали, что высокий процент DEG, выбранных с использованием двух конвейеров, перекрываются во всех условиях. Процент перекрывающихся номеров DEG/номеров DEG, выбранных с использованием конвейера №1, составил 79,6 процента и 73,7 процента. 80,8% и 74,4% от общего количества ДЭГ BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_хитина и SC155-14E{{73} }хитин соответственно; 83 %, 80,6 %, 85,3 % и 81,1 % экспрессированных DEG BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_хитина и SC{{ 88}}E_хитин соответственно; 75,1 %, 59,5 %, 75,8 % и 67,4 % низкорегулируемых DEG BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_хитина и SC{{ 105}}E_хитин соответственно. Таким образом, эти сравнительные результаты доказали, что представленные данные секвенирования РНК верны независимо от того, какой из двух методов используется для анализа.

Тепловая карта кластерных профилей экспрессии DEG BTx623 и SC155-14E, обработанных flg22 или хитином, для трех биологических повторов показана на рисунке 6. Значения экспрессии генов были нормализованы как z-показатели. Цвет меняется с пурпурного на красный по мере увеличения значения, что указывает на экспрессию гена от низкого до высокого. Эта тепловая карта ясно показывает дифференциальную регуляцию генов в BTx623 и SC155-14E в ответ на лечение flg22 или хитином. Кроме того, результаты также показывают, что тепловые карты трех биологических повторов в каждом состоянии были очень близкими, что указывает на хорошую воспроизводимость между биологическими повторами.

Кроме того, попарные сравнения (рис. 7A) между ДЭГ с повышающей и понижающей регуляцией при лечении flg22 и хитином показали, что существует большое перекрытие между BTx623 и SC155-14E. Среди 3074 flg22-индуцированных генов в BTx623 83,8% также индуцировались в BTx623 в ответ на обработку хитином, тогда как из 2591 flg22-индуцированных генов в SC155-14E, {{ 16}},6% также ответили на лечение хитином SC155-14E. Это, возможно, неудивительно, так как предыдущие работы на Arabidopsis thaliana показали значительное перекрытие генов, отвечающих на множество различных MAMP, которые определяют общие пути MTI [44-46].

Более того, Чжан и соавт. [17] также сообщили о значительной корреляции между flg22 и реакцией хитина у кукурузы. Меньшее перекрытие наблюдалось между листовыми дисками BTx623 и SC155-14E, обработанными одним и тем же MAMP (рис. 7A). 64,3% генов, индуцированных flg22- в BTx623, были индуцированы в 22-обработанных flg SC155-14E, а 68,3% генов, индуцированных хитином в BTx623, были индуцированы в SC, обработанных хитином155-14 Э. Точно так же из 2152 генов, подавляемых при обработке flg22 BTx623, высокий процент (75,9%) также подавляется хитином в BTx623. Из 1257 генов, подавляемых flg22 в SC155-14E, 70,8% также подавляются хитином в SC155-14E. Тем не менее, только 29 процентов генов с подавленной регуляцией flg22 в BTx623 также были подавлены в 22-обработанных flg SC155-14E, и 45 процентов генов с подавленной хитином в BTx623 были подавлены. в обработанных хитином SC155-14E (рис. 7A). Следовательно, несмотря на значительную конвергенцию путей MTI к flg22 и хитину у двух сравниваемых генотипов, данные также намекают на интересную сложность того, как эти два генотипа реагируют на разные MAMP.

2.3. Анализ функционального обогащения генов, сравнивающий ответ MTI BTx623 и SC155-14E

Чтобы определить функциональные категории генов, регулируемых в ответ либо на flg22, либо на хитин, и дифференциальный ответ двух протестированных линий сорго, мы использовали платформу PlantRegMap [47,48] для выполнения анализа обогащения набора генов на основе обнаруженных DEG в биологическом категория процесса. На рис. 8A и B показаны верхние термины GO для генов, обогащенных биологическими процессами, с DEG с повышающей и понижающей регуляцией как из BTx623, так и из SC155-14E. Полный список DEG представлен в таблицах S6–S13. Многие из этих генов связаны с процессами, включая реакцию на стресс, защитные реакции растений, реакцию на стимул, реакцию на биотический стимул, реакцию на бактерию, реакцию на другой организм, клеточную коммуникацию, процесс метаболизма фосфора и фосфорилирование белка.

Результаты на фиг. 8А и В показывают четкие различия в экспрессии генов, обычно связанных с врожденным иммунитетом, между двумя генотипами сорго. В этих обогащенных терминах GO некоторые уникальные DEG были обнаружены в каждом состоянии с перекрытием. Например, термин защитный ответ GO (GO 0006952): 91 и 84 экспрессированных DEG были обогащены BTx623 или SC155-14E, обработанными flg22, соответственно. Среди этих DEG 24 DEG были уникальными для BTx623, а 15 DEG были обнаружены только в SC155-14E, а остальные были представлены в обоих генотипах сорго. Точно так же 102 и 93 DEG с повышенной экспрессией были обогащены BTx623 или SC155-14E, обработанными хитином, соответственно. Среди этих DEG 20 DEG были уникальными для BTx623 и 14 DEG были уникальными для SC155-14E, а остальные были представлены в обоих генотипах сорго.

В термине GO «ответ на хитин (GO: 0010200)» мы наблюдали 18 DEG с повышенной экспрессией из общего числа 779 генов в этой категории, обогащенных хитин-обработанными образцами SC155-14E (рис. 8). ), тогда как в образцах BTx623, обработанных хитином, не было обогащено ни одним геном. Кроме того, 16 ДЭГ с повышенной экспрессией были обогащены в образцах SC155-14E, обработанных flg, а 12 ДЭГ с повышенной экспрессией были обогащены в образцах BTx623, 22-обработанных flg (рис. 8). Сравнение списков DEG термина GO «ответ на хитин» в flg22 и обработанных хитином BTX623 и SC155-14E (таблица S9) показало, что DEG, обогащенные flg22, или обработанные хитином SC155- 14 E были такими же, за исключением того, что хитин индуцировал на два DEG больше, чем flg22. В отличие от этого, все 12 DEG, обогащенные flg22-обработанным BTX623, отличались от DEG, индуцированных MAMP в SC155-14E. Эти МАМП-индуцированные ДЭГ могут способствовать резистентности антракноза в SC155-14E, поскольку хитин является типичной молекулой МАМП из клеточных стенок грибов, которая вызывает иммунные ответы растений. Стринглис и др. [49] также сообщили, что набор ДЭГ с повышающей регуляцией был обогащен ГО термином «ответ на хитин» из хитина, flg22, и полезных для растений ризобактерий Pseudomonas simiae WCS417, обработанных растениями арабидопсиса. Матич и др. [33] сообщили, что 21 DEG были обогащены термином GO «ответ на хитин» из анализа РНК листьев риса устойчивого сорта, но не из восприимчивого сорта после заражения грибковым патогеном Fusarium fujikuroi.

Гены PR (Pathogenesis-related) участвуют в иммунном ответе растений [50] и обладают противогрибковой активностью в отношении многих фитопатогенных грибов [51]. Белки PR-10 представляют собой небольшие, преимущественно кислые, внутриклеточные белки с противогрибковыми свойствами, которые связаны с защитными реакциями у видов растений, включая сорго [52]. Члены семейства генов PR-10 индуцировались атаками патогенов у самых разных видов растений [53]. Что касается сорго, Lo et al. [26] сообщили, что экспрессия PR-10 индуцируется как часть активной защиты хозяина сорго от лиственных грибковых патогенов C. heterostrophus и C. sublineolum. Кэти и др. [54] сообщили, что несколько сортов сорго продемонстрировали значительную индукцию нормированных относительных количеств PR-10 после инокуляции грибковыми спорами C. lunata и F. capsicum в полевых испытаниях. В тепличных условиях колосковые чешуи инокулированных растений демонстрировали индукцию мРНК PR-10, и ответ был выше у двух протестированных устойчивых сортов по сравнению с двумя восприимчивыми сортами.

Наши результаты показали, что среди идентифицированных DEG были обнаружены четыре PR-10 гена (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). В SC155-14E все четыре PR-10 DEG активировались при обработке flg22 или хитином, в отличие от BTx623, SORBI_3001G401000 не был обнаружен в DEG, а SORBI{{15} }G401300 (повышенная регуляция) был представлен только в BTx623 с обработкой хитином, но не с обработкой flg22. Это указывало на то, что экспрессия генов PR может использоваться в ответ на более высокие уровни продуктов АФК после обработки MAMP и устойчивости к антракнозу в SC155-14E.

Салициловая кислота (СК) является иммунным сигналом растений, необходимым как для местной защитной реакции, так и для системной приобретенной устойчивости. Он играет важную роль в устойчивости и защите растений от атак патогенов [55]. Что касается сорго, Tugizimana et al. [56] сообщили о количественных изменениях уровней жасмоновой кислоты, конъюгатов салициловой кислоты и абсцизовой кислоты в сорго, инфицированном C. subline-ola. C. subline-ola является возбудителем антракноза. Генотипы сорго с повышенным содержанием аминокислот (триптофана и тирозина), жасмоновой кислоты и салициловых конъюгатов, а также зеатина оказались более устойчивыми к антракнозу. В этом исследовании термин GO «ответ на салициловую кислоту» (GO:0009751), включающий 19 ДЭГ с повышающей регуляцией, был специфически обогащен только в SC155-14E, обработанных хитином (таблица S9). Следовательно, салициловый сигнальный путь может играть важную роль в ответ на более высокие уровни продукции АФК после обработки MAMP и устойчивости к антракнозу у SC155-14E.

Кроме того, 169 ДЭГ с повышенной экспрессией были обогащены в терминальном ответе ГО на стресс исключительно в SC155-14E, обработанных хитином (таблица S9). Другие термины GO, обнаруженные исключительно в SC155-14E, обработанных MAMP, но не в BTx623 при той же обработке, представляют собой вторичные метаболические процессы (GO:0019748), процесс биосинтеза фосфатидилхолина (GO:0006656) и процесс биосинтеза липидов ( GO:0008610).

Кроме того, 169 ДЭГ с повышенной экспрессией были обогащены в терминальном ответе ГО на стресс исключительно в SC155-14E, обработанных хитином (таблица S9). Другие термины GO, обнаруженные исключительно в SC155-14E, обработанных MAMP, но не в BTx623 при той же обработке, представляют собой вторичные метаболические процессы (GO:0019748), процесс биосинтеза фосфатидилхолина (GO:0006656) и процесс биосинтеза липидов ( GO:0008610).

Мы также изучили состав генов, которые совместно регулируются между двумя генотипами после обработки flg22 или хитином, а также основные наборы DEG при всех обработках и двух генотипах с помощью анализа обогащения GO (рис. 4B и 7B). Полный список DEG представлен в таблицах S14 и S15. На рисунке 4B показаны расширенные термины GO для основных наборов общих DEG с повышающей и понижающей регуляцией в BTx623 и SC155-14E со всеми видами лечения. Термины GO, связанные с реакцией MAMP и защитой растений (например, связывание хитина, защитный ответ, активность протеинкиназы, фосфорилирование белка, активность протеинсерин/треонинкиназы), были значительно обогащены DEG с повышающей регуляцией, в то время как термины GO обозначали процесс биосинтеза вторичных метаболитов, связывание ионов железа, активность оксидоредуктазы была увеличена только в DEG со сниженной регуляцией. Этот результат был аналогичен результатам для Arabidopsis, где термины GO, связанные с реакцией на элиситоры (пептиды flg22 из P. simile WCS417 и P. aeruginosa PAO1, хитин и бактериальные клетки P. simile WCS417), были наиболее значительно обогащены активируемыми основной набор ДЭГ [49].

На фигуре 7B показаны значительно обогащенные термины GO совместно регулируемых (т.е. повышающих или понижающих в обоих генотипах) наборов DEG между BTx623 и SC155-14E после обработки flg22 или хитином. Результаты показали, что термины GO, связанные с ответом MAMP и защитой растений (например, защитный ответ, активность протеинкиназы, фосфорилирование белка, активность протеинсерин/треонинкиназы), были обогащены только flg22 или ДЭГ с активацией хитина в обоих генотипах, в то время как термины GO процессов биосинтеза вторичных метаболитов, связывания гема, связывания ионов железа, оксидоредуктазной активности одного атома кислорода и процесса биосинтеза фосфатидилхолина были обогащены исключительно подавляющими наборами ДЭГ.

2.4. Анализ обогащения пути KEGG ответа MTI BTx623 и SC155-14E

На рисунке 9 показан анализ обогащения пути KEGG для ДЭГ с повышающей регуляцией, обнаруженных в образцах BTx623 и SC155-14E, обработанных MAMP, с использованием онлайн-инструмента DAVID [57]. Полный список DEG представлен в таблицах S16–S20. Результаты идентифицируют те специфические верхние пути KEGG, обогащенные в результате активации MTI в двух генотипах сорго. В пути KEGG «взаимодействие растения с патогеном» мы наблюдали, что 24 активированных DEG были обогащены в образцах SC155-14E, обработанных хитином, в то время как ни один из DEG не был обогащен в образцах BTx623, обработанных хитином. Более сильный хитиновый ответ генотипа SC155-14E коррелирует с большей устойчивостью этого генотипа к грибковому заболеванию антракнозом [39]. Кроме того, обогащение пути KEGG выявило 28 генов, участвующих в биосинтезе термина фенилпропаноида в SC155-14E, обработанных flg22. Путь биосинтеза фенилпропаноидов начинается с фенилаланина, который может быть преобразован в ароматические соединения, такие как флавоноиды, бензоиды, кумарин, гидроксициннаматы и лигнин [58,59]. Многие фенилпропаноиды и флавоноиды были вовлечены в реакцию устойчивости к болезням [28,60]. Производство фитоалексинов является основной защитной реакцией сорго против возбудителя антракноза C. subline-ola [28]. 3- дезоксиантоцианидины представляют собой необычную группу флавоноидов, признанных фитоалексинами в сорго. Фитоалексины представляют собой небольшие молекулы с антимикробной активностью, образующиеся после инфицирования патогеном [61]. Ван и др. [37] также обнаружили, что биосинтез фенилпропаноидов в терминах KEGG был значительно обогащен DEG растений, инфицированных C. subline-ola, в их транскриптомном исследовании сорго. Следует отметить, что результаты обогащения пути KEGG (рис. 9) также показали более высокую реакцию BTx623 после обработки MAMP в некоторых путях, которые могут играть роль во взаимодействиях растений и патогенов (например, в путях биосинтеза фенилаланина и триптофана, биосинтеза антибиотиков).

Кроме того, результаты анализа обогащения KEGG-пути DEG с пониженной экспрессией показали, что десять DEG с понижающей регуляцией были аннотированы как «антенные белки фотосинтеза», а 84 DEG были аннотированы как участвующие в «биосинтезе вторичных метаболитов». BTx623. Однако такие исследования экспрессии генов могут идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся в ответ на лечение MAMP или инфицирование патогеном, но это не обязательно демонстрирует, что эти гены имеют решающее значение для устойчивости к конкретному патогену. Таким образом, потребуются дальнейшие исследования, чтобы понять причинно-следственные связи между устойчивостью к грибкам и активацией этих путей KEGG в обоих генотипах, как показано с помощью анализа RNA-Seq.

Мы также провели анализ обогащения пути KEGG для основных наборов DEG во всех условиях (рис. 4C), а также совместно регулируемых DEG между двумя генотипами после обработки flg22 или хитином (рис. 7C). Результаты показали, что шесть важных путей, включая путь взаимодействия растений и патогенов, были обогащены только основными наборами DEG с повышающей регуляцией, но не основными наборами DEG с понижающей регуляцией. Точно так же семь и три пути, включая путь взаимодействия растений и патогенов, были значительно обогащены DEG с активацией хитина и DEG с активацией flg22 в BTx623 и SC155-14E соответственно. Напротив, только биогенез рибосом в пути эукариот был обогащен DEG со сниженной регуляцией хитина в обоих генотипах.

2.5. Проверка данных RNA-Seq с использованием количественной RT-PCR выбранных генов

Чтобы подтвердить данные профилирования экспрессии генов, полученные с помощью RNA-seq, мы провели анализ qRT-PCR для оценки экспрессии девяти выбранных генов-кандидатов. Эти девять генов были отобраны на основе экспрессии, наблюдаемой с помощью секвенирования РНК, в трех категориях: (а) одинаково экспрессируемые в BTx623 и SC155-14E с обработкой flg22 или хитином; (b) экспрессируется только в MAMP, обработанных SC155-14E, но с чрезвычайно низкой экспрессией в обработанных BTx623, и (c) экспрессируется в 2–21-раз выше в MAMP, обработанных SC155-14E, по сравнению с BTx623 . Результаты анализа qRT-PCR (таблица 1) показали полное совпадение с уровнями экспрессии, определенными анализом РНК-seq для каждого из девяти оцениваемых генов. Эти результаты дают нам уверенность в том, что измерения, сделанные с помощью RNA-seq, отражают транскрипционный ответ линий сорго на обработку MAMP.

2.6. Выводы

В этом исследовании мы сначала нашли оптимальные условия для сравнения ответа MTI двух генотипов путем тестирования продукции АФК с использованием трех наборов листьев и выбрали вторые самые молодые листья пятнадцатидневных растений для выделения РНК и последующего транскриптомного анализа. Временная динамика продукции АФК, запускаемой flg22-и запускаемой хитином, у линии сорго SC155-14E (рис. 1C) показала, что продукция АФК, запускаемая хитином, происходила раньше, чем та, которая запускалась обработкой flg22. Мы получили профили экспрессии устойчивого к антракнозу грибкового заболевания Sorghum bicolor генотипа SC155-14E с высокой реакцией на обработку МАМП на продукцию АФК и восприимчивого генотипа BTx623 с низкой реакцией на продукт АФК на обработку МАМП на ранних стадиях. реакции врожденного иммунитета.

Результаты демонстрируют явное изменение экспрессии генов у сорго генотипов BTx623 и SC155-14E в ответ на обработку MAMP. Хотя ответы на два MAMP показали значительное совпадение внутри каждой строки (86,6–70,8 процента), они были разными. Некоторое, хотя и меньшее, перекрытие (68,3–29%) также наблюдалось между ответами двух линий на один и тот же МАМП. Значительное количество DEG, 2272 из 10 535 DEG, было идентифицировано во всех четырех состояниях и ориентировочно определяет основную реакцию MAMP. Этот список генов должен быть полезен тем лабораториям, которые хотят профилировать реакцию экспрессии генов на лечение MAMP. Анализ РНК-секвенции выявил большие наборы дифференциально экспрессируемых генов у BTx623 и SC155-14E, обработанных flg22 или хитином, по сравнению с необработанными ложными контролями этих двух линий. Кроме того, сравнение DEG, выбранных с использованием двух разных конвейеров биоинформатики, показало очень похожие результаты. Детальный анализ профиля экспрессии этих DEG, анализ обогащения GO и анализ путей KEGG выявили четкие различия в реакции экспрессии генов двух генотипов. Термин GO и обогащение пути KEGG обнаружили больше DEG, связанных с иммунитетом и устойчивостью к патогенам (гены PR, гены ответа на хитин, гены ответа на салициловую кислоту, ответ на стресс, биосинтез фенилпропаноида и т. д.) в обработанных MAMP SC{{18} } Образцы E относительно BTx623 с той же обработкой. Эта информация обеспечивает важную исходную информацию о том, как врожденная иммунная система этого ключевого сельскохозяйственного растения реагирует на выявление MAMP. Учитывая общий недостаток информации о врожденном иммунном ответе сельскохозяйственных культур по сравнению с модельным арабидопсисом, описанные списки генов и методы обеспечивают ресурсы для дальнейшего изучения реакции сорго на патогены и должны способствовать усилиям по окончательному повышению устойчивости к болезням у растений. эта важная продовольственная культура и биомасса.

3. Материалы и методы

3.1. Растительные материалы

В этом исследовании использовались две линии сорго, предоставленные доктором Уильямом Руни (Техасский университет A&M, Колледж-Стейшн, США) и доктором Стивеном Кресовичем (Университет Клемсона, Клемсон, США). BTx623 — стандартная линия сорго с доступной полногеномной последовательностью [22], а SC155-14E — линия, разработанная для устойчивости к антракнозу [39].

3.2. Анализы АФК

Семена сорго BTx623 и SC155-14E были подвергнуты поверхностной стерилизации (70-процентным этанолом в течение 1 минуты, а затем 10-процентным отбеливателем в течение 10 минут, промыты автоклавным ddH2O), высажены в автоклавированную горшечную смесь Sunshine и пророщены в ростовых камерах ( 16 ч/8 ч свет/темнота, 28/26 ◦C, влажность 60–70 %). Для опытов использовали 15-дневные растения.

В этом исследовании использовали два MAMP, flg22 (Genscript, номер по каталогу RP19986) и хитин из панциря краба (Sigma-Aldrich, номер по каталогу C3641). Flg22 представляет собой пептид, полученный из N-конца флагеллина фитопатогенных бактерий, и хорошо известно, что он вызывает специфический врожденный иммунный ответ у растений [62]. Хитин представляет собой типичную молекулу MAMP, полученную из клеточных стенок грибов, которая вызывает иммунный ответ растений [3]. Анализы АФК проводили согласно Kimball et al. [38]. Для оценки изменчивости ответа МАМП в пределах отдельных генотипов, а также положения листьев все три полностью развернувшихся листа растений каждого генотипа оценивали индивидуально. Листья снизу вверх пятнадцатидневных растений сорго каждого генотипа были отмечены как лист №1, №2 и №3. Мы использовали только среднюю часть листа для отбора проб для измерения продукции АФК. Сразу после обработки хемилюминесцентный сигнал каждого образца регистрировали в течение 30 мин с помощью камеры Photek CCD (Photek Ltd., Восточный Сассекс, Великобритания). Восемь лунок включали пробную обработку (без МАМП), а восемь лунок - обработку (с МАМП). В каждом случае для каждой обработки сравнивали три биологических повтора с общим количеством образцов 8.

3.3. Обработка образца MAMP

Для опытов использовали 15-дневные растения. Обработку MAMP проводили, как описано в Valdes-Lopez et al. [12] с небольшими изменениями. Вкратце, второй лист (сверху, т.е. второй самый молодой лист) от пяти растений каждой линии сорго отделяли, а затем подвергали вакуумной инфильтрации автоклавированной ddH2O в течение 2 мин. Из пропитанных водой листьев каждого генотипа вырезали около пятидесяти листовых дисков диаметром 1 см и объединяли. Сорок пять листовых дисков от каждого генотипа переносили в три разные чашки Петри (по 15 листовых дисков в каждой чашке Петри) и затем флотировали в течение ночи при комнатной температуре в автоклавированной ddH2O, при этом чашки были покрыты алюминиевой фольгой. На следующий день воду удаляли из всех чашек Петри и заменяли 10 мл ddH2O (ложный), 10 мл 1 мкМ flg22 или 10 мл раствора хитина с концентрацией 20 мг/мл. После обработки в течение 60-минут срезы листьев, обработанные имитацией и MAMP, собирали в разные пробирки и немедленно замораживали в жидком азоте. Образцы срезов листьев (для 101 тушеных "ies ied-11272) иммунитета BTx623 и SC155-14E с имитацией, flg22 или обработкой хитином, три биологических повтора) хранили при -80 ◦C для выделения РНК. Все Описанные выше процедуры проводились в темных условиях, чтобы исключить возможный эффект фотосинтеза.

3.4. Экстракция РНК, секвенирование и создание библиотеки

Экстракцию РНК проводили с использованием набора Direct-zol RNA Miniprep Plus от Zymoresearch (номер по каталогу R2071) в соответствии с инструкциями производителя.

Высокопроизводительное секвенирование было выполнено в Центре ДНК Университета Миссури. Восемнадцать библиотек были сконструированы в соответствии с протоколом производителя с использованием реагентов, поставляемых в наборе Illumina TruSeq для подготовки образцов многоцепочечной мРНК. Концентрацию образца определяли с помощью флуорометра Qubit (Invitrogen) с использованием набора для анализа РНК Qubit HS, а целостность РНК проверяли с помощью автоматизированной системы электрофореза Fragment Analyzer. Вкратце, мРНК, содержащую поли-А, очищали от тотальной РНК (1 мкг), РНК фрагментировали, двухцепочечную кДНК получали из фрагментированной РНК, и к концам лигировали адаптеры, содержащие индекс. Амплифицированные конструкции кДНК очищали добавлением гранул Axyprep Mag PCR Clean-up. Конечную конструкцию каждой очищенной библиотеки оценивали с использованием автоматизированной системы электрофореза Fragment Analyzer, количественно определяли с помощью флуорометра Qubit с использованием набора для анализа двухцепочечной ДНК Qubit HS и разводили в соответствии со стандартным протоколом секвенирования Illumina для секвенирования на NextSeq 500. Длина секвенирования была единичной. читать на 75 базах.

3.5. Картирование и обработка чтений RNA-Seq

Данные о последовательности представляли шесть различных состояний: BTx623 с имитацией, flg22 или обработкой хитином и SC155-14E с имитацией, flg22 или обработкой хитином. Каждое состояние было представлено тремя биологическими повторами, в результате чего было получено 18 образцов. Во-первых, 30 конца прочтений были «обрезаны» для адаптеров Illumina, для неоднозначных нуклеотидов (N) и (из-за технологии NextSeq) для искусственного поли-G (представленного как G{100}) с использованием cutadapt. версия 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, по состоянию на 21 августа 2019 г.) для считываний, 30 концов которых перекрываются с адаптером как минимум для 3 оснований с 90-процентной идентичностью. Если после этой обрезки чтение содержало менее десяти оснований, оно отбрасывалось (вместе с его парным чтением, если применимо). Показатели качества данных секвенирования РНК после обрезки были проверены с использованием FASTQC (версия 0.11.9) [63]. Для всех позиций в ридах средний показатель качества составляет около 34, что указывает на то, что базовая точность вызова превышает 99,9%. Чтения для каждого образца были сопоставлены с эталонным геномом (Sorghum _bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) с помощью Tophat 2.1.1. Полученные файлы выравнивания были предоставлены Cufflinks 2.2.1 для сборки стенограмм для каждого образца. В этом исследовании использовалась версия аннотации Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Образцы из одинаковых условий объединяли с помощью Cuffmerge. Цель состояла в том, чтобы обеспечить единую основу для расчета экспрессии генов и транскриптов в каждом состоянии.

3.6. Биоинформатический анализ данных RNA-Seq

Данные секвенирования РНК анализировали с использованием инструментов биоинформатики Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 и Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) с параметрами по умолчанию. Мы использовали тот же конвейер с этими инструментами, как описано в Trapnell et al. [64]. Для дальнейшего подтверждения результатов анализа мы использовали другой конвейер с HiSat2 (версия 2.1.0), HTSeq (версия 0.12.4) и edgeR (версия 3.26.8) для выполнения анализа. HiSat2 — это следующая разработка TopHat2. Во-первых, мы использовали HiSat2 для выравнивания с использованием эталонного генома Sorghum. Затем мы использовали HTSeq, чтобы подсчитать, сколько прочтений было сопоставлено с каждым геном. Для этого нам понадобились bam-файлы, сгенерированные на предыдущем шаге, и аннотация генома (gif-файл). Обратите внимание, что эталонный геном и файлы аннотаций такие же, как и в исходном пайплайне. Наконец, мы использовали пакет R edgeR для определения дифференциально экспрессируемых генов в каждом состоянии.

3.7. Идентификация дифференциально экспрессируемых генов
Объединенная сборка была передана Cuffdiff, которая вычисляет уровни экспрессии и проверяет статистическую значимость наблюдаемых изменений между двумя состояниями. Мы сравнили условия между имитацией и flg22 и имитацией и хитином для BTx623 и SC155-14E соответственно. Гены с дифференциальной экспрессией были извлечены с использованием 0.001 пороговых значений p. Графики вулканов были сделаны с использованием пакета R (ggplot2 V3.3.0), чтобы показать значимость изменения экспрессии генов в условиях BTx623, обработанных flg22 или хитином, и SC155- 14E, обработанных flg22 или хитином, соответственно. Точки гена с -log10 (значение p), равным или превышающим три, считались DEG. На каждом графике точки гена с log2 (кратность _изменения) больше нуля представляли собой гены с повышающей регуляцией, в противном случае они регулировали бы с пониженной регуляцией гены.

3.8. Сюжет PCA

Чтобы изучить взаимосвязь между значениями экспрессии генов в трех биологических повторах каждой линии сорго и каждой обработке MAMP, графики основных компонентов (PCA) были созданы с использованием пакетов R (ggfortify V{{0}}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Каждая точка представляет состояние после сопоставления исходного пространства признаков (выражения гена) с первыми двумя основными компонентами. Точки, принадлежащие к одному и тому же состоянию, имеют тенденцию группироваться вместе.

3.9. Тепловая карта ДЭГ

1 Отделение науки и технологии растений и биохимии, Центр наук о жизни К.С. Бонда, Университет Миссури, Колумбия, Миссури 65211, США; cuiy@missouri.edu (ЮК); chendq@cau.edu.cn (постоянный ток)

2 Кафедра электротехники и компьютерных наук, Центр естественных наук им. К.С. Бонда, Университет Миссури, Колумбия, Миссури, 65211, США; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Отдел исследований растений, USDA-ARS, Роли, Северная Каролина 27695, США

* Correspondence: staceyg@missouri.edu