Каковы преимущества полисахарида Cistanche для иммунной функции

Контактное лицо: emily.li@wecistanche.com

Иммунологическая активность и механизм полисахарида Cistanche

Цзэн Цюньли, Чжэн Ифань, Лу Чжилян

[Абстрактный]Цель: изучитьиммунныйдеятельностьЦистанхеполисахарид(CDPS) и механизм егоиммунныйРегуляция in vitro. Методы. Колориметрический метод с тиазоловым синим (MTT) использовали для наблюдения за регулирующим эффектом CDPS (Цистанхе Полисахарид) на IQS DEX TNF ингибирует пролиферацию лимфоцитов тимуса мыши in vitro; CDPS (Цистанхе Полисахарид) использовали для выполнения клеточного цикла и анализа клеточного цикла с помощью проточной цитометрии. Определение внутриклеточного Ca2. Результаты: CDPS (Цистанхе Полисахарид) в более высокой концентрации может противодействовать ингибирующему эффекту ISQDEX на пролиферацию лимфоцитов и ингибирующему эффекту высокой концентрации TNF на пролиферацию лимфоцитов, а также усиливать эффект стимуляции пролиферации низкой концентрации TN F на лимфоциты; 100 мкг/мл 200 мкг/мл CDPS (Цистанхе Полисахарид) может значительно увеличить клетки в фазе деления; более высокая концентрация (100 мкг/мл) CDPS (Цистанхе Полисахарид) может значительно повышать концентрацию ионов Са в тимоцитах мыши. Заключение: ЦДПС (Цистанхе Полисахарид) может способствовать вступлению клеток в фазу деления, и предполагается, что его стимулирующее действие на пролиферацию лимфоцитов тимуса мыши связано с его стимулированием высвобождения кальция в лимфоцитах тимуса мыши.

Цистанхе(ЦистанхеДезертиколаYC Ma) является редким и ценным китайским лекарственным материалом в моей стране. Он указан как высший сорт в «Материа Медика Шень Нуна».Цистанхеимеет функции питания крови, питания почек и помощи Ян, увлажнения кишечника и замедления старения. Современные фармакологические исследования показывают, чтоЦистанхеполисахаридможет улучшить состояние организмаиммунныйфункция, способствуют синтезу ДНК, укрепляют физическую силу, улучшают интеллект и обладают очевидным омолаживающим эффектом [1]. Автор изучал регуляцию CDPS(цистанхе полисахарид), полисахаридный компонентЦистанхе, наиммунныйфункциялимфоцитов мыши.

Цистанхе Полисахаридпродвижениераспространениелимфоциты

1 Материал и методы

1.1 Реактивы и препараты.

об/мин, I 1640, среда: GIB-CO; ХЕПЕС: ФАРКО; L-глютамин: Фабрика реагентов в Шанхае Dongfeng; Пенициллин и стрептомицин: Северокитайская фармацевтическая фабрика; Конканавалин (ConA), МТТ: компания SIGM A; Фитогемагглютинин (ФГА): Шанхайская медицинская лаборатория; Изопротеренол (ISO): Шанхайская фармацевтическая фабрика Tianfeng; Меркаптоэтанол: компания Fluka; Сыворотка новорожденного теленка: Sijiqing Bioengineering Company; Дексаметазон (DEX) был представлен доктором Ма Ляном, Первой дочерней больницей Медицинской школы Чжэцзянского университета; Фактор супрессора опухоли (TNF) был предоставлен Ю Юэханом, профессором кафедры клеток Школы наук о жизни Чжэцзянского университета; Остальные реактивы все отечественного производства ч.д.а.

1.2 Экспериментальные животные.

Мыши ICR, самцы, в возрасте 68 недель, весом 18-20 г, 22, были приобретены в Центре экспериментальных животных Чжэцзяна.

1.3 Экстракция полисахарида цистанхе [2]:

Цистанхеполисахариддобывается нашей лабораторией! После измельчения сырого препаратаЦистанхе, его погружают в горячий этанол, экстрагируют кипящей водой и осаждают этанолом. Нейтральный фермент в сочетании с методом Sewag для депротеинизации, анионообменной хроматографией DEAE-Sephadex A- 50 и гель-фильтрационной хроматографией Sephacry S-200 для получения одного компонента CDPS (Цистанхе Полисахарид)). Хранить в сухом месте, использовать неполный RPMI1640 для достижения определенной концентрации перед использованием и стерилизовать ультрафильтрацией.

1.4 Получение лимфоцитов селезенки и тимуса [3]:

The mice were sacrificed by neck removal. The spleen or thymus was taken aseptically and sieved through a 200-mesh steel mesh. The Hanks solution containing porridge newborn calf serum was used to prepare a single-cell suspension. After centrifugation at 1500 r/min for 10 min, red blood cells were lysed with 0.01 mol/L Tris-NHCl hypotonic solution for 1 min, and then washed with Hanks liquid centrifugation. Finally, the cells were suspended in RPMI1640 containing 10% fresh calf serum for complete culture Solution (containing 2 mmol/LL glutamine, 100 mmol/L sodium pyruvate, 1 mmol/L mercaptoethanol, add penicillin 100 U/ml and streptomycin 100 μg/ml just before use), trypan blue count, live For cells>93, отрегулируйте концентрацию клеток селезенки до X 10 / мл и концентрацию тимоцитов до × 10 градусов / мл.

1.5 Реакция пролиферации лимфоцитов:По методу Мосмана [4] Улучшение: 96-луночный планшет для культивирования клеток, добавить 10/мл суспензии клеток селезенки или воды 10/мл суспензии тимоцитов 100М1 и разные концентрации препаратов 10041 в каждую лунку. Культивируйте в инкубаторе CO2.37C в течение 72 часов. За 4 часа до окончания культивирования в каждую лунку добавляют 8 мкл МТТ (5 мг/мл). В конце культивирования аспирируйте 150 мкл супернатанта из каждой лунки и добавьте 0,5 н. изопропанола гидрохлорида 150 мкл. Аккуратно встряхните на микрошейкере до полного растворения голубых кристаллов. Измерьте OD570 на считывающем устройстве для микропланшетов. точку в виде трех повторных лунок.

1.6 Определение влияния на клеточный цикл [5]:

{{0}}луночный планшет для культивирования клеток, добавить 4 10 град/мл суспензии тимоцитов по 1 мл в каждую лунку, добавить различные реагенты и раствор полисахарида по 2 мл в сильном CO, 37 инкубаторов. После культивирования в течение 72 ч центрифугировать при 15{14}}0 об/мин в течение 15 мин, отбросить надосадочную жидкость, добавить 7 этанола для фиксации осажденных клеток, хранить при 4°C для тестирования в режиме ожидания, дважды промыть клетки PBS, центрифугировать при 1500 об/мин в течение 15 мин, отбросить надосадочную жидкость и добавить. После расщепления 0,5 мл 0,1 РНКазы А при 4°С в течение 30 мин 50 мкг/мл бромацетата окрашивали в течение 30 мин при 4°С и измеряли интенсивность флуоресценции образцов клеток на проточном цитометре FACScan. 10, 000 клеточных тестовых точек были собраны для каждого образца, и данные были использованы для анализа программного обеспечения Multricycle.

1.7 Определение внутриклеточной концентрации ионов кальция [6]

Возьмите тимоциты мыши таким же образом, как указано выше. Суспендируют в неполной культуральной среде RPMI1640 и доводят концентрацию клеток до × 10’/мл. Добавить в каждую экспериментальную пробирку по 1 мл взвеси тимоцитов и 1 мкМ окрашивающего раствора Fluo-3AM 5 мкл, 2% F{8}} мкл, после инкубации при 37°С в течение 30 мин дважды отмыть неполным RPM1640, 1500р/ мин, центрифугировать в течение 10 мин, отбрасывать супернатант и добавлять различные концентрации полисахаридов и полисахаридов к осажденным клеткам. После ConA измеряли интенсивность флуоресценции на проточном цитометре FACScan. Данные 10 000 клеточных тестовых точек были собраны для каждого образца и проанализированы с помощью программного обеспечения CELLQUEST. 1.8 Статистические методы использовались для дисперсионного анализа, а клеточный цикл и измерение ионов кальция анализировались с помощью программного обеспечения проточного цитометра.

Цистанхе полисахарид из цистанхе пустынной

2 результатов

2.1 Цистанхе Полисахарид in vitro ингибирует пролиферацию лимфоцитов тимуса мыши с помощью ISO DEX TNF

Агонист бета-адренорецепторов изопротеренол (ISO) и класс гормонов коры надпочечников дексаметазон (DEX) ингибируют пролиферацию лимфоцитов CDPS.Цистанхе Полисахарид) в более высокой концентрации (75 125 мкг/мл) может сопротивляться ингибирующему действию ISO DEX на пролиферацию лимфоцитов (P<0.01) as="" shown="" in="" figure="" 1.="" tumor="" necrosis="" factor="" (tnf="" β)="" on="" lymphocytes="" at="" high="" concentration="" cdps="">Цистанхе полисахарид) (125 мкг/мл) при более высокой концентрации может противодействовать ингибирующему действию ФНО и синергически способствовать пролиферации лимфоцитов при низкой концентрации ФНО (рис. 2).

2.2 Цистанхе Регуляция полисахаридами лимфоцитарного цикла тимуса

CDPS (Цистанхеполисахарид) 25 мкг/мл 100 мкг/мл 200 мкг/мл три концентрации воздействовали на лимфоциты тимуса мыши в течение 72 часов, содержание ДНК в клетках измеряли с помощью FACS и рассчитывали индекс пролиферации (PI) в соответствии с формулой. Результаты показывают, что как 100 мкг/мл, так и 200 мкг/мл могут значительно увеличить количество клеток в фазе деления, а индекс пролиферации (68,0%, 56,6) у обоих значительно выше, чем у контрольной группы (44,6), и у 200 мкг/мл. группа немного ниже, чем группа 100 мкг/мл, потому что при концентрации 200 мкг/мл его влияние на пролиферацию клеток имеет тенденцию к снижению [7]. Значение PI (47,5%) в группе 25 мкг/мл было незначительно выше, чем в контрольной группе.

2.3 Влияние полисахарида Цистанхе на концентрацию ионов кальция в тимоцитах мыши

Экспериментальные результаты показывают, что более высокая концентрация (100 мкг/мл) CDPS (Цистанхе Полисахаридд) может значительно способствовать повышению концентрации ионов кальция в тимоцитах мышей. По сравнению с контрольной группой имеется достоверная разница (P<0.01), and="" there="" is="" a="" certain="" effect="" relationship="" with="" the="" action="" time="" (figure="">

3 Обсуждение

Цистанхе, широко известный как"пустынный женьшень", представляет собой сухой, чешуйчатый мясистый стебельЦистанхе.Цистанхеимеет функции питания ян почек, питательной эссенции, крови и кишечника. Он относится к разновидности возбуждения гипофизарно-надпочечниковой коры или оказывает гормоноподобное действие, сходное с корой надпочечников. Ценное китайское лекарство, которое может регулироватьиммунныйфункциятела. Результаты наших предыдущих исследований показывают, что CDPS (Цистанхе Полисахарид) in vitro может способствовать пролиферации Т-лимфоцитов тимуса, которые не были активированы или активированы ConA PHA. В сочетании с ConA PHA существует два типа стимуляторов Т-клеток, мы считаем, что CDPS (Цистанхе Полисахарид) является бадьювантом для Т-клеток, и мы также обнаружили, что CDPS (Цистанхе Полисахарид) может значительно увеличить секрецию лимфоцитов селезенки мыши при более высоких концентрациях [8]

Некоторые исследования показали, что рекомбинантный TNF может вызывать апоптоз нормальных кластеров Т-лимфоцитов мыши и человека in vitro, и этот эффект потенциально может ингибироваться IIL-2 IL-1 IFN и IIL-4 с дексаметазоном (DEX) Он может ингибировать пролиферацию лимфоцитов путем ингибирования экспрессии лимфоцитов и секреции IL-2 и подавления продукции высокоаффинного IL-2R. Этот эксперимент показал, что более высокая концентрация CDPS (Цистанхеполисахарид) может противодействовать воздействию высокой концентрации TN F на пролиферацию лимфоцитов. Ингибирование, синергичное с низкой концентрацией TNF, способствует пролиферации лимфоцитов и может противодействовать ингибирующему эффекту ISQ DEX на пролиферацию лимфоцитов. Эти эффекты именно через CDPS (Цистанхеполисахарид) для стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов и аутокринного действия Т-клеток IL-2 и других цитокинов для завершения.

В последние годы было проведено много исследований иммунофармакологических эффектов растительных полисахаридов, но мало исследований поиммунныймеханизм регуляции полисахаридов, особенно путь передачи сигнала полисахаридов, действующих на лимфоциты с Са2 в качестве вторичного мессенджера. Отчета нет. В этом эксперименте проводились предварительные исследования в этой области. К внутриклеточным сигнальным молекулам относятся цАМ, Р, Са", IP3, ДГ, цГМФ и др., среди которых Са" оказывает чрезвычайно важное физиологическое действие на клетки. Увеличение концентрации внутриклеточного Ca² является важным явлением на ранней стадии активации и пролиферации лимфоцитов. Этот процесс в основном происходит в первые десятки секунд до минут, когда клетки активируются стимуляторами. Классическим способом активации Т-клеток является фосфатидилинозитол (PIB) для метаболизма фосфатидила в мышцах. Метаболит спирта 1,4.5-инозитолтрифосфат (IP3) может способствовать высвобождению Ca, хранящегося во внутренней сетке, путем связывания с рецепторами внутренней сетки, повышая уровень внутриклеточного Ca2 и концентрацию внутриклеточного Ca. * увеличивается.Высокая концентрация может способствовать выработке NF-AT (фактор нуклеиновой кислоты активированных Т-клеток), последний способствует экспрессии гена IIL-2.Экспериментальные результаты показывают, что более высокая концентрация (100 мкг/мл ) ЦДПС (Цистанхеполисахарид) эффективен в течение 5 10 мин. Время оказывает значительное влияние на повышение концентрации Ca* в тимоцитах мыши и имеет синергический эффект с ConA. Поэтому мы предполагаем, что CDPS (Цистанхе Полисахарид) способствует высвобождению кальция в лимфоцитах тимуса мышей для увеличения внутриклеточной концентрации ионов кальция. Увеличение способствует экспрессии гена IL-2 и приводит к пролиферации Т-клеток, что является одной из теоретических основЦистанхеПолисахаридырегулирующее воздействие на организм

Цистанхе Полисахарид

использованная литература

1. И.Н. Сюхин, С.У. Юкэ (Общее положение фармакологических исследований наЦистанхеСка 【J】. Китайские традиционные и травяные лекарства ((Китайская фитотерапия). 1993.24 (10. 550-552 (на китайском языке))

2. ZHANG Weijiee (Биохимическая теория составного полисахарида [M]. Университет Ханчжоу Чжэцзян, издательство Zhejiang University Press, 1994. 16-17 (на китайском языке)

3. М.А. Бо- (Ма Баоли). Методика иммунологии【M1. Издательство Шанхайского медицинского университета (издательство Шанхайского медицинского университета), 1984 188-190. (сущ. Китай))

4. Мосманн Т. Рапилолоимерный анализ для облегчения роста и выживания, применение для предотвращения пролиферации и цитотоксичности [JJ Immun Meth.1983,6 55- 58.

5. WU is-hi, WU shailing, Acai-n, et al (Wu Jiahui, Wu Shuibing. Li Carian и др.), Влияние цина на пролиферацию циклических клеток виммунныйанализ органов с использованием проточной цитометрии [J]. Китайская иммунология (Китайский журнал иммунологии), 1994, 10X5: 278-281. (на китайском языке)

6. ТАО аксин. JIYong-yong, GAO Qi-rong и др. (Tao Jiaxian, Ji Yongpu Gao Qirong и др.). FACS-анализ изменений внутриклеточного C2 во время эактивации[J] Китайский журнал иммунологии (China Journal of Immunology), 1993, 9 (2): 97-10L. (на китайском)

7. ZENGQu-li.MAO Jum-hao, LUsuchiang; Очистка d полисахаридаЦистанхеДезертиколаYC Mfa и его иммуномодулирующее действие на Tellfunction[J].

8. Зарин А., Мишель С. С. Перре А. Х. Цитотоксический эффект ФНО и лимфотоксина на Т-лимфоблаке. J Immunol, 1995, 1553716-3721.