Полногеномное секвенирование для диагностики неврологических расстройств повторной экспансии в Великобритании: ретроспективная диагностическая точность и проспективное клиническое валидационное исследование

Чтобы получить больше информации:ali.ma@wecistanche.com

Резюме

Фон

Нарушения экспансии повторов поражают примерно 1 из 3000 человек и представляют собой клинически гетерогенные заболевания, вызванные экспансией коротких тандемных повторов ДНК. Генетическое тестирование часто зависит от локуса, что приводит к гиподиагностике людей с атипичными клиническими проявлениями, особенно у детей без предшествующего положительного семейного анамнеза. Полногеномное секвенирование все чаще используется в качестве теста первой линии для других редких генетических заболеваний, и мы стремились оценить его эффективность в диагностике пациентов сневрологическийповторные нарушения расширения.

Методы

Мы ретроспективно оценили диагностическую точность полногеномного секвенирования для выявления наиболее распространенных локусов повторной экспансии, связанных сневрологическийрезультаты (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT и TBP) с использованием образцов, полученных в Национальной службе здравоохранения Англии от пациентов, у которых подозревалось наличиеневрологическийрасстройства; предыдущие результаты теста ПЦР использовались в качестве эталонного стандарта. Клиническая точность полногеномного секвенирования для обнаружения повторных экспансий была проспективно исследована на ранее генетически проверенных и недиагностированных пациентах, набранных в 2013–2017 годах в рамках проекта 100 000 Genomes в Великобритании, у которых подозревалось генетическое заболевание.неврологическийрасстройства (семейные или ранние формы атаксии, невропатия, спастическая параплегия, деменция, болезнь двигательных нейронов,паркинсонизмдвижениерасстройства, умственная отсталость или нервно-мышечные расстройства). Если повторный вызов экспансии был сделан с использованием полногеномного секвенирования, ПЦР использовалась для подтверждения результата.

Результаты

Диагностическая точность секвенирования всего генома для обнаружения повторных экспансий оценивалась по сравнению с 793 ПЦР-тестами, ранее проведенными в NHS у 4 04 пациентов. Полногеномное секвенирование правильно классифицировало 215 из 221 расширенного аллеля и 1316 из 1321 нерасширенного аллеля, демонстрируя чувствительность 97,3% (95% ДИ 94,2–99,0) и специфичность 99,6% (99,1–99). ·9) по 13 локусам, ассоциированным с заболеванием, по сравнению с результатами ПЦР-теста. В образцах, взятых у 11 631 пациентов в рамках проекта 100 000 Genomes, полногеномное секвенирование выявило 81 повторную экспансию, которые также были проверены с помощью ПЦР: 68 были подтверждены как повторные экспансии в полном патогенном диапазоне, 11 не были -патогенные промежуточные экспансии или пермутации, а два повтора были нерасширенными (16% ложных открытий).

Интерпретация

В нашем исследовании полногеномное секвенирование для обнаружения повторных экспансий показало высокую чувствительность и специфичность, что привело к идентификацииневрологическийповторные нарушения экспансии у ранее не диагностированных пациентов. Эти результаты поддерживают внедрение полногеномного секвенирования в клинических лабораториях для диагностики пациентов сневрологическийПредставление соответствует повторяющемуся расстройству расширения.

Финансирование

Совет по медицинским исследованиям, Департамент здравоохранения и социального обеспечения, Национальная служба здравоохранения Англии, Национальный институт исследований в области здравоохранения и Illumina.

Введение

Несмотря на недавние успехи в понимании генетической основы редкихневрологическийрасстройствами, до 70 процентов пациентов с такими расстройствами остаются генетически недиагностированными.1–3 Отчасти это связано с техническими проблемами тестирования сложных и повторяющихся генетических вариантов, включая повторные экспансии; такие расширения, по оценкам, затрагивают примерно 1 из 3000 человек (приложение стр. 1) и являются основной причиной более чем 40 нейрогенетических расстройств, 4 включая болезнь Гентингтона и синдром ломкой X-хромосомы. Нарушения повторной экспансии клинически и генетически гетерогенны, и повторная экспансия может быть связана с различными заболеваниями. Например, экспансии в C9orf72 могут проявляться либо боковым амиотрофическим склерозом, либо лобно-височной деменцией.5 Повторные экспансии в разных локусах также могут давать сходные фенотипические признаки, что затрудняет их клиническое различение: повторные экспансии по крайней мере в десяти генах спиноцеребеллярной атаксии часто присутствуют у взрослых. Атаксия с началом 6, а также атаки C9orf72 и AR могут вызывать заболевание двигательных нейронов. 7,8

Нарушения повторной экспансии вызываются увеличением количества повторяющихся коротких тандемных последовательностей ДНК, а пороги патогенности для каждого нарушения зависят от локуса. Размер экспансии варьирует от менее чем 30 повторов (например, в CACNA1A) до нескольких тысяч повторяющихся единиц (например, в FMR1, DMPK, C9orf72 и FXN, которые могут достигать размера 5 т.п.н.). Экспансия повторов демонстрирует молекулярную нестабильность, которая может привести к изменениям размера повторов (как правило, увеличению их длины) в разных поколениях и тканях. поколениях. 4 Педиатрическое начало расстройств повторной экспансии может проявляться как мультисистемные синдромы без специфических фенотипических признаков,9 и, следовательно, дети с этими расстройствами с большей вероятностью будут не диагностированы, если в семейном анамнезе расстройство повторной экспансии отсутствует, чем когда оно присутствует.10– 12

Лабораторная оценка повторных экспансий обычно ограничивается целевой молекулярной оценкой отдельного локуса, руководствуясь предполагаемым клиническим диагнозом с использованием методов на основе ПЦР или Саузерн-блоттинга,13 что может быть дорогостоящим и трудоемким. Кроме того, из-за разнообразных и перекрывающихся фенотипических признаков этих нарушений локусы экспансии повторов, связанные с заболеванием, могут оставаться непроверенными.14

Полногеномное секвенирование становится диагностическим инструментом первой линии у пациентов с редкими заболеваниями15, но до недавнего времени считалось, что его возможности для оценки локусов, содержащих повторные экспансии, ограничены.16 Однако достижения в области биоинформатики сделали возможным выявление заболеваний -вызывая повторную экспансию на основе данных секвенирования следующего поколения.17–22 Здесь мы сообщаем о диагностической оценке подхода к полногеномному секвенированию для обнаружения повторной экспансии с использованием ретроспективных данных ПЦР и его клинической валидации у пациентов в рамках проекта «100 000 геномов», которые имел подозрение на неврологическое расстройство, не диагностированное при предыдущем генетическом тестировании.

Методы

Дизайн исследования и участники

Эта оценка секвенирования всего генома для обнаружения повторных экспансий включала как диагностическую, так и клиническую оценки точности. Точность диагностики оценивалась с использованием данных пациентов, которые ранее были протестированы с помощью ПЦР на наличие повторных экспансий, которые, как известно, вызывают неврологическое заболевание.4 Пациенты были идентифицированы из двух источников: Проект 100 000 Genomes и Геномная лаборатория в больницах Кембриджского университета ( Кембридж, Великобритания). Для обеих групп пациентов ПЦР-тестирование было проведено на образцах пациентов в лабораториях Национальной службы здравоохранения (NHS) в рамках обычной клинической оценки: для образцов в рамках проекта «100 000 геномов» ПЦР-тесты проводились до набора в проект со стороны Лаборатория нейрогенетики Университетского колледжа Лондонской больницы (Лондон, Великобритания); образцы с подтвержденной ПЦР экспансией повторов были получены от пациентов, протестированных Геномной лабораторией в Кембридже. Пациенты с ПЦР-положительными и ПЦР-отрицательными результатами теста на повторные расстройства роста были отобраны для включения в наше исследование через системы лабораторных записей; все пациенты дали письменное информированное согласие на использование их образцов для обеспечения качества, а также в исследовательских и учебных целях в рамках оптимизации и проверки клинических услуг.

Полногеномное секвенирование каждого образца было выполнено в одной из двух лабораторий: Genomics England (Хинкстон, Великобритания) для образцов проекта 100 000 геномов (n=254) и в лаборатории клинических услуг Illumina (ICSL; Сан-Диего, Калифорния, США) для образцов, полученных Геномной лабораторией в Кембридже (n=150). В целом, этот набор данных использовался для диагностической части исследования и состоял из данных ПЦР и полногеномного секвенирования 404 пациентов, охватывающих 13 локусов, которые представляют наиболее распространенные неврологические расстройства повторной экспансии: 11 локусов, связанных с атаксией и поздним начальные нейродегенеративные расстройства (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 и FXN), один локус связан с умственной отсталостью (FMR1) и один локус связан с миотонической дистрофией (DMPK). Для каждого локуса данные ПЦР-тестирования были доступны по крайней мере для одного расширенного аллеля (приложение, стр. 24).

Клиническую достоверность оценивали путем изучения соответствия повторяющихся экспансий, выявленных при полногеномном секвенировании, предполагаемому клиническому диагнозу после подтверждения ПЦР у пациентов с подозрением на генетические неврологические расстройства (семейные или ранние формы атаксии, невропатии, спастической параплегии, деменции). , заболевание двигательных нейронов,паркинсонизмдвигательные расстройства, умственная отсталость или нервно-мышечные расстройства), привлеченные к участию в проекте «100 000 геномов» в 2013–2017 годах. Проект 100000 геномов — это британская программа по оценке ценности полногеномного секвенирования у пациентов с неудовлетворенными диагностическими потребностями при редких заболеваниях и раке. После этического одобрения Проекта 100000 геномов Кембриджским комитетом по этике научных исследований Восточной Англии (ссылка 14/EE/1112), в том числе для анализа данных и предоставления результатов диагностики пациентам, эти пациенты были набраны медицинскими работниками и исследователями из 13 Центров геномной медицины в Англии и были включены в проект, если они или их опекун предоставили письменное согласие на использование их образцов и данных в исследованиях, включая это исследование. Пробанды и, если возможно, другие члены семьи были включены в исследование в соответствии с критериями приемлемости, установленными для конкретных редких заболеваний (приложение, стр. 5–11). Пациенты были набраны в проект 100000 геномов после стандартного генетического тестирования в NHS, как указано в критериях приемлемости. Стандартизированные базовые клинические данные были записаны с использованием Онтологии фенотипирования человека (HPO)23 в сравнении с моделями данных по конкретным заболеваниям.24 Также был собран статус заболевания членов семьи по отношению к клиническим показаниям пробанда для тестирования.

Чтобы выявить причинную повторную экспансию у пациентов с генетически невыявленным заболеванием, мы проверили пациентов с подозрением на генетические нарушения, соответствующие болезни повторной экспансии. Пациентов отбирали на основании конкордантности их заболевания и сроков ВПО с повторными нарушениями, связанными с экспансией. Данные полногеномного секвенирования пациентов были проанализированы для поиска расширений в определенных наборах повторов с использованием четырех различных панелей расширения повторов в соответствии с их клиническими характеристиками (приложение, стр. 5). Повторные экспансии, выбранные для включения в эти панели, являются наиболее распространенными локусами повторной экспансии, вызывающими неврологические заболевания. Пациенты с клиническими признаками, потенциально совместимыми с более чем одним расстройством повторной экспансии, были протестированы на нескольких панелях. Если повторный запрос на расширение был сделан с использованием полногеномного секвенирования, выполнялось подтверждающее тестирование с помощью ПЦР.

Для каждого пациента с подтвержденным повторным расширением местный врач был проинформирован о потенциальном диагностическом результате, и оценивался вклад повторного расширения в клинические особенности пациента. Для повторных расширений, которые полностью или частично объясняли клинические особенности пациента, выдавался диагностический отчет в соответствии с местными стандартными процедурами.

Процедуры

Для исторических образцов NHS, используемых в части диагностической точности нашего исследования, повторное расширение ранее было проверено с использованием амплификации ПЦР и анализа фрагментов. Саузерн-блоттинг выполняли для больших экспансий C9orf72. В части клинической точности нашего исследования повторные экспансии, обнаруженные с помощью полногеномного секвенирования у пациентов из проекта 100 000 Genomes, были протестированы с помощью ПЦР в образцах, хранящихся в генетических лабораториях NHS. Дополнительные сведения, включая последовательности праймеров, приведены в приложении (стр. 2–3, 25–26).

ДНК была подготовлена ​​для секвенирования всего генома с использованием подготовки библиотеки TruSeq DNA PCR-Free, а секвенирование спаренных концов длиной 150 или 125 п.н. было выполнено на платформах HiSeq 2000 или HiSeq X в центре высокопроизводительных геномов для Genomics England и в ICSL. . Геномы были секвенированы со средней глубиной 35× (от 31× до 37×; приложение, стр. 27). Генотипирование с короткими тандемными повторами выполняли с использованием программного пакета ExpansionHunter версии 3.1.2.25,26. Вкратце, ExpansionHunter перестраивает чтения секвенирования по предварительно определенному набору коротких тандемных повторов для оценки размера обоих аллелей у индивидуума (приложение, стр. 3).

Выходные данные ExpansionHunter включают оценку количества повторяющихся элементов, общего размера и доверительного интервала для каждого оцениваемого локуса. Руководящие принципы Ассоциации медицинской патологии и Колледжа американских патологоанатомов рекомендуют визуальную проверку вызовов вариантов во время рутинной оценки вариантов высокопроизводительного секвенирования.27

Однако варианты коротких тандемных повторов не могут быть адекватно визуализированы обычными инструментами визуализации, такими как Integrative Genomics Viewer.28 Для изучения данных секвенирования всего генома, лежащих в основе каждого вызова генотипа, был использован инструмент графической визуализации, который позволяет напрямую визуализировать гаплотипы и соответствующие скопления считывания. генотипов ExpansionHunter (приложение стр. 3, 15). Визуальный осмотр графа накопления был выполнен для всех вызовов коротких тандемных повторов секвенирования всего генома, чтобы подтвердить, что предсказание ExpansionHunter для аллелей полностью содержалось в каждом прочтении (т. е. последовательность повторов была меньше, чем длина чтения секвенирования); для подтверждения наличия моноаллельной или биаллельной экспансии; обнаруживать предполагаемые ложноположительные вызовы; и для обнаружения ложноотрицательных аллелей в экспансиях биаллельных повторов, таких как FXN (приложение, стр. 4, 16).

ExpansionHunter оценивает размер повтора по данным полногеномного секвенирования, анализируя чтения секвенирования, которые полностью или частично содержат короткий тандемный повтор. Если аллель короткого тандемного повтора короче длины считывания, ExpansionHunter предсказывает точный размер; если аллель короткого тандемного повтора длиннее, чем длина считывания, ExpansionHunter оценивает размер повтора в КИ в зависимости от состава последовательности локуса, глубины секвенирования и качества секвенирования.

статистический анализ

Мы классифицировали повторы как расширенные с помощью секвенирования всего генома, если размер, предсказанный ExpansionHunter, был выше порога премутации, или нерасширенные, если предсказанный размер был ниже порога (приложение, стр. 28).

Чувствительность и доверительные интервалы для полногеномного секвенирования для обнаружения экспансии повторов рассчитывали как долю аллелей с экспансивными повторами среди ранее подтвержденных ПЦР аллелей с экспансивными повторами. Специфичность оценивали как долю нерасширенных аллелей среди ранее протестированных нерасширенных повторов методом ПЦР. Полное описание статистических формул приведено в приложении (стр. 1).

Чтобы сравнить размеры повторов с помощью ПЦР с оценками размера повторов с помощью секвенирования всего генома, аллели, определенные с помощью ПЦР, сравнивали с размерами повторов, предсказанными ExpansionHunter для аллелей короче длины чтения во всех 13 локусах коротких тандемных повторов. Конкордантность рассчитывалась по проценту размеров повторов, предсказанных ExpansionHunter, которые согласовывались с размером, определенным ПЦР, с учетом ошибки ПЦР плюс или минус один повтор. Статистический анализ проводили с использованием статистического программного обеспечения R версии 3.6.3.

Роль источника финансирования

Дизайн исследования, набор пациентов, сбор данных и секвенирование осуществлялись под руководством сотрудников Genomics England и академических исследователей. Сотрудники Illumina выполнили секвенирование 150 образцов пациентов в качестве запланированного компонента исследования диагностической точности полногеномного секвенирования и разработали ExpansionHunter. Сотрудники Genomics England, академические исследователи и соавторы RTH, ED и MAE провели анализ и интерпретацию повторных экспансий у пациентов, набранных для участия в проекте 100 000 Genomes. Источники финансирования не играли никакой роли в интерпретации данных или написании отчета.

Полученные результаты

Диагностическая точность полногеномного секвенирования для обнаружения экспансии повторов оценивалась по сравнению с 793 тестами ПЦР, ранее проведенными в NHS у 4 04 пациентов (64 пациента были протестированы более чем на один повтор; рисунок 1). Из этих тестов 183 были классифицированы как имеющие расширенный повтор, а 610 - как не имеющие расширенного повтора с помощью ПЦР, что дало в общей сложности 221 расширенный и 1321 нерасширенный индивидуальный аллель в 13 локусах заболевания (приложение, стр. 24, 28). Полногеномное секвенирование правильно классифицировало 215 из 221 расширенного аллеля и 1316 из 1321 нерасширенного аллеля по сравнению с результатами теста ПЦР (приложение, стр. 27, 29), демонстрируя начальную чувствительность 97,3 процента (95 процентов ДИ 94,2–99). ·0) и специфичностью 99,6% (99,1–99,9; табл. 1). После визуальной коррекции всех вызовов на основе качества прочтений чувствительность увеличилась до 99,1% (96,8–99,9), а специфичность до 100% (99,7–100; рис. 2А, таблица 1). Визуализация расширенных аллелей позволила выявить ложноположительные результаты и переклассифицировать все ложноотрицательные аллели в FXN, из которых только один аллель был правильно классифицирован как расширенный в образцах с биаллельными расширениями (приложение, стр. 17, 18).

Длину повторов количественно определяли с помощью ПЦР в 509 ПЦР-тестах, в которых исследовали 945 аллелей в 13 локусах экспансии повторов. Корреляции между ExpansionHunter и ПЦР для размеров повторов короче и больше, чем длина чтения секвенирования (т. е. 150 п.н.), показаны в приложении (приложение, стр. 19). Высокая согласованность наблюдалась для повторов короче, чем длина считывания, с совпадением 92,7% (836 из 902) между ПЦР и ExpansionHunter. Наблюдалась изменчивость локуса с высокой согласованностью между ExpansionHunter и ПЦР для ATXN2, ATXN7, CACNA1A и HTT и низкой согласованностью для DMPK или TBP (приложение, стр. 30). Длины аллелей, превышающие длину считывания, были недооценены ExpansionHunter, что повлияло на точность вызова в DMPK, FMR1 и FXN (рисунок 2B, приложение, стр. 19, 31).

Хотя ExpansionHunter смог правильно идентифицировать большие расширенные аллели в FMR1, DMPK, C9orf72 и FXN (приложение, стр. 29), прогнозируемые оценки размера, как правило, были ниже, чем полученные с помощью ПЦР, поскольку размер повтора увеличивался в пределах патогенного диапазона, что влияло на способность различать большие и малые расширения в DMPK, C9orf72 и FXN или полные расширения и перестановки в FMR1 (приложение, стр. 31). Например, локусы с длиной повтора, оцененной с помощью ПЦР, превышающей 200 повторов в FMR1 и классифицированные как полная мутация, имели средний размер повтора, оцененный ExpansionHunter, равным 92,6 (SD 17,8; приложение, стр. 31).

Чтобы проверить способность обнаружения повторной экспансии с помощью секвенирования всего генома для постановки диагноза ранее протестированных и генетически недиагностированных пациентов, мы протестировали 11 631 пациентов с подозрением на генетическое неврологическое расстройство, набранных для участия в проекте «100 000 геномов» (рис. 1). Данные полногеномного секвенирования оценивали с использованием четырех различных панелей расширения повторов в соответствии с клиническими особенностями пациента. Количество пациентов, протестированных с каждой из четырех панелей, показано в таблице 2.

В целом мы обнаружили и визуально подтвердили повторные расширения в образцах от 105 пациентов (таблица 2, приложение, стр. 20, 33). Из них 81 образец был доступен для подтверждающего тестирования с помощью ПЦР, а 68 были подтверждены как имеющие повторную экспансию (выход 0·6 процентов): 45 (1,2 процента) из 3692 на панели A, восемь ({ {18}}·3 процента ) от 2743 на панели B, пять (0·6 процентов) 860 на панели C и десять (0·1 процент ) от 6731 на панели D. Тринадцать из 81 вызова расширения не были подтверждены как экспансии патогенных повторов (частота ложных открытий 16%). Из них два были нерасширенными аллелями в ATXN1 и ATXN2, четыре были вызовами промежуточного размера FMR1 (приложение, стр. 21) и семь были пермутациями FMR1.

Клинические данные 68 пациентов с повторной экспансией, подтвержденной ПЦР, включая их клинические проявления, выявленную повторную экспансию и вклад повторной экспансии в клинические признаки пациента, представлены в таблице 3; термины HPO, размер повтора, оцененный ExpansionHunter, и был ли выпущен диагностический отчет, перечислены в приложении (стр. 33).

Расширение наблюдалось у пациентов с широким спектром перекрывающихся клинических проявлений, протестированных с помощью панели А (таблица 3, приложение, стр. 22), включая увеличение количества повторов ATXN2 у пациента с болезнью Паркинсона с ранним началом, реагирующей на леводопа, и прогрессирующей мозжечковой атаксией в анамнезе. , и расширение АР у четырех пациентов с клинически диагностированной болезнью Шарко-Мари-Тута, включая одного с генетически подтвержденной демиелинизирующей нейропатией (например, болезнь Шарко-Мари-Тута 1 типа, пациент 42; приложение стр. 33). У пациентов с патогенными повторными разрастаниями наблюдался широкий спектр предшествующих клинических диагнозов.

Например, у семи пациентов с боковым амиотрофическим склерозом или другим заболеванием двигательных нейронов были выявлены расширения в AR (n=4) и C9orf72 (n=3). У пациентов с подозрением на наследственную атаксию мы выявили экспансию в локусах, которые не оценивались в рамках рутинной диагностической работы в NHS на момент набора, включая ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP и HTT. таблицу 3). Мы также обнаружили повторную экспансию у пациентов с клиническими признаками, соответствующими альтернативным нарушениям повторной экспансии, включая экспансию C9orf72 при ранней и семейной болезни Паркинсона (пациент 24, таблица 3) и повторную экспансию в диапазоне сниженной пенетрантности при HTT (38 повторов). у двух сестер с двигательным расстройством, деменцией, депрессией и трудностями речи (пациенты 44 и 45), что подчеркивает диагностическую проблему, связанную с этими повторяющимися расстройствами расширения.

У восьми детей, протестированных с помощью панели B, были обнаружены большие экспансии повторов CAG (рис. 3), семь из которых полностью объясняли клинические особенности пациента. У шести пациентов не было информативного семейного анамнеза, и им не было предложено повторное расширенное тестирование в рамках их клинической оценки на момент набора (пациенты 48–53; таблица 3, приложение, стр. 33). Двое из этих детей несли большие экспансии HTT (90–100 повторов CAG). Следует отметить, что один ребенок унаследовал повтор от здорового родителя без семейного анамнеза болезни Гентингтона. Семейное тестирование продолжается, но в расширенной семье был идентифицирован аллель сниженной пенетрантности, что указывает на расширение повтора более чем на 60 единиц повтора в одном поколении (пациент 52). На момент написания ни у кого из членов семьи не было выявлено никаких признаков болезни Хантингтона, и для родителей продолжаются генетические консультации и тестирование. Двое детей в возрасте до 5 лет имели большие повторные экспансии в ATXN7 и страдали сложным мультисистемным заболеванием. У одного из этих детей (пациент 50) у родителя появились проблемы с походкой через 2 года после включения в проект «100 000 геномов». Аналогичным образом, у девочки в возрасте 10 лет с умственной отсталостью было обнаружено 99-повторное расширение ATXN2, несмотря на то, что оба родителя были признаны незатронутыми, а у девочки в возрасте 18 лет с деменцией было обнаружено 99- {19}}повторное расширение в ATN1 (приложение стр. 33).

Выявлено пять экспансий ДМПК (панель С), в том числе у ребенка и матери с клиническим диагнозом мышечной дистрофии, у двух сибсов с подозрением на дистальную миопатию и у подростка с врожденной миопатией (пациенты 54–58). Экспансия FMR1 (панель D) была обнаружена у девяти мальчиков и одной девочки, а диагноз «синдром ломкой Х-хромосомы» полностью или частично объяснял имеющиеся клинические признаки (пациенты 59–68).

Обсуждение

Диагноз повторных расстройств экспансии является сложной задачей для здравоохранения из-за гетерогенных и перекрывающихся клинических признаков и неспецифических клинических признаков, которые могут усиливаться с возрастом и в каждом последующем поколении. Нарушения повторной экспансии являются одной из наиболее частых причин наследственных неврологических заболеваний.4 Тем не менее, пациенты могут быть неправильно диагностированы либо из-за недостаточного генетического тестирования, либо из-за того, что генетические варианты, вызывающие заболевание, еще не обнаружены. Подходы к тестированию в настоящее время фрагментированы, и у пациентов может быть протестирован неправильный локус экспансии повторов29 или пройти молекулярный тест для другого класса вариантов из-за совпадения клинических признаков с другими неврологическими генетическими расстройствами.30

Полногеномное секвенирование использовалось в различных условиях в качестве диагностического теста первой линии при редких неврологических расстройствах, но ранее считалось, что оно имеет низкую способность обнаруживать повторные экспансии.16 Было разработано несколько инструментов для выявления повторных экспансий в полногеномных секвенирование в исследовательских условиях,31 но ни один из этих подходов не применялся к данным полногеномного секвенирования, собранным у большого числа пациентов в одной службе здравоохранения. Мы представляем доказательства того, что алгоритм, разработанный для обнаружения повторных экспансий на основе полногеномного секвенирования, может надежно оценивать наиболее распространенные болезнетворные повторные экспансии и разрешать ранее генетически не диагностированные случаи в большой группе пациентов с неврологическими расстройствами. Наши результаты показывают, что полногеномное секвенирование может различать нерасширенные и расширенные аллели с высокой чувствительностью и специфичностью по 13 локусам повторной экспансии (что может быть дополнительно улучшено с помощью визуального осмотра), может точно рассчитать размер аллелей, меньших, чем длина считывания. , и может недооценивать размер больших дополнений в FMR1, DMPK, FXN и C9orf72.

Когда обнаружение повторной экспансии с помощью секвенирования всего генома оценивали по положительным и отрицательным результатам, ранее полученным в клинико-диагностических геномных лабораториях с использованием методов золотого стандарта, мы обнаружили минимальную чувствительность 97,3 процента и специфичность 99,6 процента. Кроме того, мы показали, что как специфичность, так и чувствительность могут быть улучшены путем ручного курирования скопления прочтений, что позволяет обнаруживать ложноположительные результаты и реклассифицировать ложноотрицательные аллели в образцах с двуаллельными расширениями. Из 6731 пациента, протестированного на FMR1 (панель D), было предсказано, что 124 вызова будут расширены. Мы смогли исключить 97 с помощью визуального осмотра как вероятные ложные срабатывания. Это указывает на то, что 1 из 54 тестов секвенирования всего генома будет иметь вызов FMR1, который необходимо будет визуально проверить, чтобы отбросить потенциальный ложноположительный вызов. Продолжается работа по улучшению метода генотипирования ExpansionHunter, чтобы уменьшить количество ложноположительных вызовов FMR1.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 повторов) вызывают более тяжелое заболевание, а также спиноцеребеллярную атаксию 36 типа (NOP56), при которой экспансии более 650 повторов считаются патогенными, а размеры повторов 15–650 считаются промежуточными и вариантами неопределенной значимости.

Было идентифицировано более 40 локусов повторной экспансии; многие из этих локусов были идентифицированы совсем недавно и в настоящее время связаны с ранее необъяснимыми состояниями, включая мозжечковую атаксию с невропатией и синдромом вестибулярной арефлексии (RFC1) 32 и миоклоническую эпилепсию (SAMD12) 33 . отобранных для нашего исследования на основании наличия положительных и отрицательных контрольных образцов.

Представленные здесь данные предполагают, что ExpansionHunter должен быть в состоянии точно классифицировать нерасширенные и расширенные аллели в любом локусе повторной экспансии, если нерасширенные аллели меньше, чем длина считывания (т.е. 150 п.н.). Хотя большинство локусов с повторной экспансией имеют аллели размером менее 150 п.н. в неэкспандированном состоянии, некоторые локусы, для которых размер неэкспандированного аллеля близок к 150 п.н. (например, NOTCH2NLC)34, могут быть более трудными для генотипирования с использованием этого подхода. Для локусов, где расширенный повтор значительно больше, чем длина чтения, полногеномное секвенирование может обнаружить патогенные расширения (например, NOP56,35 RFC120,32). Появляющиеся технологии секвенирования с длинным считыванием могут предложить дополнительные подходы при генотипировании больших размножений.36

Оценка повторных экспансий с использованием секвенирования всего генома у 11 631 недиагностированных пациентов, набранных в проект 100 000 Genomes, позволила выявить 68 пациентов с объяснимыми результатами. Пациенты были набраны в проект 100 000 Genomes после стандартного генетического тестирования; следовательно, доля повторных экспансий, выявленных в этой когорте, представляет собой повышение диагностической эффективности стандартного тестирования NHS, которое включает локус-специфическое тестирование на нарушения повторной экспансии, такие как FXN или DMPK. Следует отметить, что некоторые диагнозы не были заподозрены на основании клинических особенностей пациента, в том числе у шести педиатрических пациентов, у которых не было известного семейного анамнеза повторного расстройства экспансии. Средние размеры экспансии повторов, предсказанные полногеномным секвенированием у детей, описанных в этом исследовании, значительно больше, чем средние значения у взрослых, что согласуется с ожиданием того, что более крупные экспансии связаны с более ранним и более тяжелым началом даже у детей. Необходима дальнейшая работа, но эти данные свидетельствуют о том, что оценка патогенности в зависимости от возраста и повторного размера может помочь в педиатрической диагностике за счет снижения потенциальной опасности выявления аллелей риска развития у взрослых, что приводит к нежелательному прогностическому тестированию у детей.

Наши результаты позволяют создать клинический диагностический рабочий процесс для секвенирования всего генома (приложение, стр. 23). Мы предлагаем проводить визуальную проверку всех вызовов, классифицированных как расширенные, для выявления ложноположительных результатов, а также двуаллельных расширений, для которых обнаружен только один расширенный аллель (например, FXN). Мы рекомендуем лабораториям использовать ExpansionHunter для оценки наличия расширения без соблюдения оценки размера и выполнения подтверждающего ПЦР-тестирования в качестве стандартного компонента рабочего процесса тестирования.

Редкие наследственные заболевания включают широкий спектр клинических признаков, что делает локус-специфическое геномное тестирование неэффективным, трудным и дорогостоящим. Мы представляем доказательства того, что секвенирование всего генома клинического уровня с потенциалом для диагностики ряда редких неврологических заболеваний, обычно проявляющихся вариантами с одним основанием, делением или числом копий, теперь может быть расширено для повторных экспансий. Поскольку полногеномное секвенирование обеспечивает единый тест, который может идентифицировать наиболее распространенные экспансии повторов, а также позволяет одновременно тестировать точечные мутации и варианты числа копий в генах, связанных с этими состояниями, оно дает возможность идентифицировать большинство пациентов с этими гетерогенными расстройствами. которые не были диагностированы с помощью локус-специфического тестирования. В эпоху новых методов лечения этих заболеваний раннее выявление может стать решающим.37 Эти результаты поддерживают внедрение полногеномного секвенирования для обнаружения повторных экспансий в клинико-диагностических лабораториях, подход, который уже был включен в Национальную службу геномных исследований NHS England. Test Directory,38 для исследования невыявленных редких неврологических заболеваний.

использованная литература

1 Нго К.Дж., Рексач Дж.Е., Ли Х. и др. Диагностический потолок для секвенирования экзома при мозжечковой атаксии и связанных с ней неврологических расстройствах. Хум Мутат 2020; 41: 487–501.

2 Линч Д.С., Куцис Г., Туччи А. и др. Наследственная спастическая параплегия в Греции: характеристика ранее неисследованной популяции с использованием секвенирования нового поколения. Евр Дж Хам Генет 2016; 24: 857–63.

3 Грациола Ф., Гароне Г., Стрегапед Ф. и др. Диагностический результат целевой генной панели секвенирования следующего поколения для двигательных расстройств, возникающих у детей: 3-годовое когортное исследование. Фронт Жене 2019; 10: 1026.

4 Полсон Х. Заболевания повторной экспансии. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72, лобно-височная деменция и/или боковой амиотрофический склероз. Сиэтл, Вашингтон: Вашингтонский университет, 2015.

6 Клокгетер Т., Мариотти К., Полсон Х.Л. Спиноцеребеллярная атаксия. Nat Rev Dis Primers 2019; 5: 24.

7 Шаккоттай В.Г., Фогель Б.Л. Клиническая нейрогенетика: аутосомно-доминантная спиноцеребеллярная атаксия. Нейрол Клин 2013; 31: 987–1007.

8 Ла Спада А. Спинальная и бульбарная мышечная атрофия. В: Адам М.П., ​​Ардингер Х.Х., Пагон Р.А. и др., ред. GeneReviews. Сиэтл, Вашингтон: Вашингтонский университет, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R и др. Летальная форма спиноцеребеллярной атаксии 7 типа с ранним началом в детском возрасте. Арх Педиатр 2018; 25: 42–44.

10 Ансорж О., Джунти П., Михалик А. и др. Агрегация и убиквитинирование атаксина -7 в инфантильной SCA7 с 180 повторами CAG. Энн Нейрол, 2004 г .; 56: 448-52.

11 Рамоки М.Б., Чапески Л., Макдональд Р.О., Фернандес Ф., Мальфрус А.Д. Спиноцеребеллярная атаксия 2 типа, проявляющаяся когнитивной регрессией в детстве. Джей Чайлд Нейрол 2008; 23: 999–1001.

12 Митчелл Н., Латуш Г.А., Нельсон Б., Фигероа К.П., Уокер Р.Х., Соберинг А.К. Спиноцеребеллярная атаксия 3 в детском возрасте: языковая дистония как раннее проявление. Тремор Другой Гиперкинетический Mov 2019; опубликовано в сети 13 сентября.

13 Птица ТД. Миотоническая дистрофия типа 1. В: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, eds. GeneReviews. Сиэтл, Вашингтон: Вашингтонский университет, 2019.

14 Айдин Г., Декомиен Г., Хоффман С., Гердинг В.М., Эпплен Дж.Т., Арнинг Л. Частота экспансии повторов SCA8, SCA10, SCA12, SCA36, FXTAS и C9orf72 у пациентов с SCA, отрицательных для наиболее распространенных подтипов SCA. БМК Нейрол 2018; 18:3.

15 Турро Э., Эстл В.Дж., Меги К. и др. Полногеномное секвенирование пациентов с редкими заболеваниями в национальной системе здравоохранения. Природа 2020; 583: 96–102.

16 Эшли Э.А. На пути к прецизионной медицине. Нац Рев Жене 2016; 17: 507–22.

17 Лю ХИ, Чжоу Л, Чжэн МЮ и др. Диагностическая и клиническая ценность секвенирования всего генома в когорте недиагностированных китайских семей с редкими заболеваниями. Научный представитель 2019 г .; 9: 19365.

18 Мусави Н., Шлейзер-Бурко С., Яницкий Р., Гимрек М. Профилирование полногеномного ландшафта тандемных повторов. Nucleic Acids Res 2019; 47: е90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Обнаружение экспансии тандемных повторов в когортах, секвенированных с помощью данных секвенирования с коротким считыванием. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Идентификация расширенных повторов на основе биоинформатики: нереференсное расширение интронного пентамера в RFC1 вызывает CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Гросс А.М., Аджай С.С., Раджан В. и др. Варианты числа копий в клиническом секвенировании генома: развертывание и интерпретация редких и недиагностированных заболеваний. Женет Мед 2019; 21: 1121–1130.

22 Трост Б., Энгчуан В., Нгуен К.М. и др. Полногеномное обнаружение тандемных повторов ДНК, которые увеличиваются при аутизме. Природа 2020; 586: 80–86.

23 Робинсон П.Н., Колер С., Бауэр С., Зеелов Д., Хорн Д., Мундлос С. Онтология фенотипов человека: инструмент для аннотирования и анализа наследственных болезней человека. Am J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Геномика Англии. Модели клинических данных при редких заболеваниях. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (по состоянию на 4 августа 2021 г.).

25 Долженко Э., ван Вугт Дж.Дж.Ф.А., Шоу Р.Дж. и др. Обнаружение экспансии длинных повторов по данным полногеномной последовательности без ПЦР. Геном Res 2017; 27: 1895-903.

26 Долженко Э., Дешпанде В., Шлезингер Ф. и др. ExpansionHunter: инструмент на основе графа последовательности для анализа вариаций в областях коротких тандемных повторов. Биоинформатика 2019; 35: 4754–56.

27 Рой С., Колдрен С., Карунамурти А. и др. Стандарты и руководящие принципы для проверки конвейеров биоинформатики секвенирования следующего поколения: совместная рекомендация Ассоциации молекулярной патологии и Колледжа американских патологов. J Мол Диагн 2018; 20: 4–27.

28 Робинсон Дж.Т., Торвальдсдоттир Х., Винклер В. и др. Интегративный просмотрщик геномики. Нац биотехнология 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Фенотипическая однородность симптомов болезни Гентингтона в семье SCA17. Неврология 2006; 67: 1701–03.

30 Шнайдер С.А. Берд Т. Болезнь Хантингтона, подобия болезни Гентингтона и доброкачественная наследственная хорея: что нового? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Бахло М., Беннетт М.Ф., Дегорски П., Танкард Р.М., Делатицкий М.Б., Локхарт П.Дж. Недавние достижения в обнаружении повторных экспансий с помощью секвенирования нового поколения с коротким считыванием. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Кортезе А., Симона Р., Салливан Р. и др. Биаллельная экспансия интронного повтора в RFC1 является частой причиной атаксии с поздним началом. Нат Жене 2019; 51: 649–58.

33 Исиура Х., Дои К., Мицуи Дж. и др. Экспансия интронных повторов TTTCA и TTTTA при доброкачественной семейной миоклонической эпилепсии у взрослых. Нат Жене 2018; 50: 581–90.

34 Ишиура Х., Шибата С., Йошимура Дж. и др. Экспансия некодирующих повторов CGG при болезни внутриядерных включений нейронов, окулофарингодистальной миопатии и перекрывающемся заболевании. Нат Жене 2019; 51: 1222–1232.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et al. Быстрая диагностика спиноцеребеллярной атаксии 36 в семье из трех поколений с использованием данных полногеномного секвенирования с коротким чтением. Мов Беспорядок 2020; 35: 1675–79.

36 Мантере Т., Керстен С., Хойшен А. Секвенирование длинных считываний, появляющееся в медицинской генетике. Фронт Жене 2019; 10: 426.

37 Эллерби Л.М. Нарушения повторной экспансии: механизмы и терапия. Нейротерапия 2019; 16: 924–927.

38 Национальная система здравоохранения. Национальный каталог геномных тестов: критерии тестирования на редкие и наследственные заболевания. Октябрь 2021 г.