Наночастицы оксида цинка способствуют процессу старения в зависимости от размера

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Абстрактный

Наночастицы оксида цинка (ZnO) обычно используются в косметических товарах, сараях, биосенсорах и при доставке лекарств. В качестве идеальных систем in vitro мезенхимальные стволовые клетки (МСК) используются для проверки острой токсичности. В настоящем исследовании оценивали зависящее от размера цитотоксическое действие НЧ ZnO на МСК. МСК костного мозга и жировой ткани обрабатывали НЧ ZnO со средним размером 10-30 и 35-45 нм. Было обнаружено, что концентрации НЧ ZnO 5 и 10 мкг/мл являются безопасными концентрациями для размеров НЧ 10-30 и 35-45 нм соответственно.преимущества цистанхеАнализ клеточного цикла показал, что малый размер НЧ ZnO оказывает более негативное влияние на процесс вступления клетки в синтез ДНК по сравнению с большим размером. Результаты теста с -галактозидазой показали ускорение процесса старения в клетках, обработанных НЧ ZnO меньшего размера. Было обнаружено, что оба размера NP активируют связанные со старением гены NF-kB и p53 и подавляют антивозрастной ген Nanog. Подводя итог, можно сказать, что меньший размер НЧ ZnO может усиливать процесс старения в клетках.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Введение

В последнее десятилетие индустрия нанотехнологий нуждается в быстром развитии во всем мире. Наночастицы оксида цинка (ZnO) обычно используются в косметических средствах, навесах, биосенсорах, средствах доставки лекарств, биовизуализации, а также в качестве противогрибковых и антибактериальных средств [1-5]. Наноструктуры ZnO обладают несколькими превосходными свойствами, а также стабильностью соединения, большим диапазоном удельной поверхности, высокими показателями электронного соответствия и активностью электросоединения [6]. НЧ ZnO по большей части используются в качестве дополнительного вещества, рассеивающего УФ-свет, в косметических продуктах, таких как солнцезащитные кремы, зубная паста и косметические средства [7, 8]. С широким применением наноструктурированных веществ для коммерческих изделий биобезопасность этих материалов рассматривалась для изучения естественных и токсикологических эффектов аберрантных и немедленных проявлений этих веществ [9]. Из-за их активных форм кислорода (АФК) и нерастворимых ионов металлов наноматериалы, такие как ZnO, оказывают токсическое воздействие на клетки [10,11].цистанхе холестеринПоскольку токсичность НЧ ZnO выше в сверхчистой воде, чем в фосфатно-солевом буфере (PBS) в различных водных средах, токсичность НЧ ZnO в основном соответствует свободным ионам цинка [12]. В то время как комплекс NP цинка со средой вызывает более низкую токсичность, концентрация ионов Zn2 plus значительно снижается. Генерируемый Zn2 плюс нерастворимые НЧ ZnO вызывают некроз и воспаление [13]. Межклеточные АФК, вызываемые НЧ ZnO, вызывают гибель клеток и дисфункцию митохондриального окислительного фосфорилирования [10].

Цистанхе может омолаживать

Несколько экспериментов in vivo показали вредное воздействие НЧ Zn на различные формы жизни, такие как дрозофилы [14], рыбы [15], амфиподы [16], мыши [17], крысы [18] и бактерии [19]. Также сообщалось, что НЧ Zn проявляют токсичность in vitro [20-22]. Несмотря на многие скрытые токсичности, связанные с НЧ ZnO, они широко используются для различных биомедицинских приложений и фармацевтических целей [23]. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования для оценки токсического воздействия этого соединения на клетки. В токсикологических исследованиях МСК используются в качестве идеального моделирования in vivo [24]. Выделение и расширение MSCs в культуре легко, и их дифференциация осуществляется путем надлежащей стимуляции. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (СКМСК) проявляют чувствительность к тестам на цитотоксичность противоопухолевых и некоторых других цитотоксических препаратов [25]. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки жирового происхождения (AMSC) используются для оценки безопасности лекарств и открытия новых лекарств [26]. Поэтому в этом исследовании мы предположили, что AMSC и BMSC, на которые нацелены НЧ ZnO, могут быть подходящими для рассмотрения потенциальных рисков развития старения. Для оценки клеточной токсичности большое значение имеет анализ экспрессии генов – фактора, играющего роль в ранних токсических процессах [26]. Таким образом, в качестве специфического маркера стволовых клеток ген Nanog был использован в настоящем исследовании для прогнозирования токсичности. Nanog выполняет две функции в дифференцировке и самообновлении стволовых клеток [27]. Более того, ген Nanog стимулирует подавление старения за счет подавления экспрессии гена p27KIPI [28].Побочные действия цистанхе пустынногоВ классическом ответе на генотоксичность, чтобы ограничить пролиферацию клеток, p53 в поврежденных геномах вызывает остановку клеточного цикла и гибель клеток. Многочисленные исследования выявили роль каркаса NF-kB в активации стимулирующих изменений в тканях при старении [29]. Поэтому в настоящем исследовании рассматривались анализ клеточного цикла, анализ галактозидазы in situ и уровни мРНК генов NF-kB, p53 и Nanog.

2. Материалы и методы

2.1 Свойства и характеристика наночастиц

Были приобретены НЧ ZnO двух разных размеров (Sigma Aldrich, США) со следующей информацией: один со средним размером 10-30нм, плюс 99-процентная чистота, плотность 5,606 г/см³ и около 20-60м2/ г, а другой со средним размером 35-45 нм, чистотой ＋99%, плотностью 5,606 г/см³ и площадью поверхности около 65 м2/г (рис. 1). Затем путем обработки ультразвуком в течение 3 мин готовили запас 100 мкг/мл суспензии НЧ ZnO в 1 мл PBS.

2.2 Выделение мезенхимальных стволовых клеток

СККМ собирали у самцов крыс {{0}}недельного возраста (200-250 г). Эпифизы удаляли, получали доступ к полостям костного мозга и тотальные пробки костного мозга (КМ) вымывали из большеберцовой и бедренной костей с помощью 10-миллилитрового шприца, содержащего модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM) (Laboratories Inc., Массачусетс, США) плюс 10 мл. процент эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Образцы BM собирали и точно осаждали последовательными иглами 18 и 20 калибра, прикрепленными к аналогичному 10-миллилитровому шприцу. Затем суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. После осаждения клеток их ресуспендировали в среде с 10% FBS. Чтобы воспроизвести счетчик подсчета клеток, 4-процентную уксусную кислоту смешивали с небольшим количеством суспензии для лизиса эритроцитов. Подсчет клеток проводили гемоцитометром. Затем клетки размером 5×10 дюймов помещали в чашку для культивирования диаметром 100 мм, хранили в 5-процентном СО2 при 37°С и заменяли свежей средой каждые 3-4 дней [30]. Используя коллагеназу типа I (0,15 процента массы к объему) в течение 1 часа при 37°С, жировую ткань затем ферментативно отделяли. Для удаления недиссоциированных частиц суспензию фильтровали через фильтр 70-um. Затем добавляли DMEM с 10% (об./об.) FBS и центрифугировали при 700×g в течение 5 мин. Наконец, осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM с 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина и 10% (об./об.) FBS [31].

2.3 Культура клеток

AMSCs и BMSCs культивировали в DMEM (Laboratories Inc., Массачусетс, США) с 1% антибиотиков и 10% FBS в стандартных условиях культивирования (при 37°С, 5% CO2 и 95% влажности) [32].

2.4 Характеристика поверхностных маркеров СККМ и АМССК

СККМ и АМСК собирали в течение 5 минут при 37°С, высевали центрифугированием при 200×g в течение 5 минут и промывали охлажденным PBS. Затем 5 мкл антител, конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), включая CD34-PE, CD90-FITC, CD45-FITC и CD73-FITC (Thermo Fisher Scientific, Германия) добавляли к СККМ и АМСК и затем хранили при комнатной температуре (КТ) в темном месте в течение 20 мин. Образцы оценивали с помощью проточного цитометра (BD FACS Caliber; Сан-Хосе, Калифорния, США) [33, 34].

2.5 Цитотоксичность in vitro

Для тестирования цитотоксичности НПС СККМ и АМСК культивировали в {{0}}луночных планшетах при слиянии 70-80 процентов, все частицы суспендировали в полной DMEM (10-процентно разбавленные НЧ с 90-процентным разбавлением НЧ). DMEM, содержащий PBS) [35]. Обработку ультразвуком в ванне проводили дважды, каждый раз в течение 5 минут, для тонкого смешивания конечных концентраций НЧ ZnO. Поэтому СККМ и АМСК обрабатывали различными концентрациями (0, 3, 5, 10, 25 и 50 мкг/мл) НЧ ZnO в течение 24, 48 и 72 часов. Затем для проверки жизнеспособности обработанных клеток использовали анализ МТТ.доза цистанхеПриготовление исходного раствора МТТ ((3-(4,5-диминиэтилтиазол-2-ил)- 2,5-дифенилтетразолия бромид) проводили путем добавления 1 мл PBS. до 5 мг МТТ (Sigma, США) в темном месте, затем 20 мкл исходного раствора вносили во все экспериментальные лунки (контрольные клетки и НЧ ZnO, обработанные разными концентрациями), встряхивали 10 мин и инкубировали при 37°С в течение 3 ч. Наконец, образцы вынимали из инкубатора и смешивали с ДМСО, при этом на этом этапе был заметен пурпурный цвет.Они проявляли с помощью пипетки и сразу же считывали в присутствии УФ-излучения на длине волны 570 нм.

2.6 Анализ клеточного цикла

СККМ и АМСК высевали в разные 6-луночные планшеты. В то время как наблюдалось 70-процентное слияние клеток, безопасные концентрации НЧ ZnO (были получены 5 и 10 мкг/мл для меньших и больших размеров НЧ ZnO, соответственно) обрабатывали клетки для анализа МТТ и инкубировали в течение 72 часов при 37 градусах (5 процентов). СО2). Среду удаляли с конфокального диска через 72 часа, дважды промывали PBS и центрифугировали. Клетки фиксировали этанолом (70%) при 4°С в течение 2 дней. Затем инкубированные клетки снова промывали PBS и слегка встряхивали, после чего полностью удаляли среду с конфокального диска. Затем добавляли 10 мкл РНКазы и инкубировали в течение 45 мин. Для окрашивания клетки суспендировали в 10 мкл раствора иодида пропидия (Sigma, США). Для оценки ДНК клеток использовали проточный цитометр [36].

2.7 Анализ галактозидазы in situ на клеточное старение

Активность ассоциированной со старением галактозидазы (SA-gal), как общего биомаркера для определения старения в клетках, оценивали с помощью набора для окрашивания SA- -gal (Thermo Fisher Scientific, Германия) так же, как и в предыдущих исследованиях. [37]. Клетки высевали в 24-луночные планшеты и обрабатывали НЧ ZnO двух разных размеров в безопасных концентрациях. Затем их промывали в PBS, фиксировали в смеси фиксаторов G/F (20 % глутарового альдегида + 37 % формальдегида) и инкубировали при комнатной температуре в течение 3-5 мин. Затем клетки окрашивали в свежем растворе для окрашивания (10 мл цитрата Na плюс 250 мкл феррицианида калия + 250 мкл ферроцианида калия + 100 мкл MgCl + 250 мкл NaCl + 200 мкл X-gal) в течение 2 часов в темном месте при 37°С. зеленый цвет визуализировали с помощью инвертированного светового микроскопа.

2.8 ПЦР в реальном времени

СККМ и АМСК с двумя различными размерами НЧ ZnO обрабатывали в оптимальных концентрациях 5 и 10 мкг/мл соответственно. Их собирали через 48 часов, и для выделения тотальной РНК использовали набор для выделения РНК (Bio Basic INC). Первую цепь кДНК синтезировали методом обратной транскрипции с использованием набора SYBR Green qPCR MasterMix 2X, SYBR Degree Premix Ex TaqIM (TaKaRa, Япония). Затем качество и количество синтезированной кДНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Германия).Преимущества экстракта цистанхеЗатем 2 мкл кДНК использовали для амплификации целевого гена. Специфические праймеры были разработаны с помощью программы Primer 3 и использованы для амплификации экспрессии генов p53, NF-kB и Nanog (General Biotech, Корея). Последовательность праймеров представлена ​​в таблице 1.

Уровни экспрессии нормализовали к уровню экспрессии гена GAPDH как гена домашнего хозяйства. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали первый цикл при 95° в течение 3 мин и 40 циклов при 95° в течение 20 с, при 60° в течение 20 с и при 72° в течение 30 с.

2.9 Статистический анализ

Все тесты проводились трижды, и результаты отображались как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Данные были введены в программное обеспечение SPSS (IBM Corp. NY, USA) и проанализированы с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA).

3. Результаты

3.1 Анализ мезенхимальных стволовых клеток методом проточной цитометрии

Мезенхимальные стволовые клетки крысы отделяли от двух источников, включая жировую ткань и костный мозг. Были проверены поверхностные маркеры CD МСК, и большинство AMSC или СККМ (98,18 и 99,62%) были обнаружены для CD90 в качестве положительного поверхностного маркера в МСК (рис. 2А, В). Кроме того, 94,8 0 и 99,76% CD73 в AMSC или BMSC были определенно окрашены соответственно (рис. 2A, B). Более того, ничтожный процент СККМ или АМСК показал экспрессию CD45 ({18}},18 или 0,56 процента) и CD34 (0,71 или 12,65 процента) в СККМ или СККМ соответственно, которые являются маркерами гемопоэтических клонов (рис. .2А, Б). Эти молекулярные профили демонстрируют экстраординарные свойства СККМ и АМСК. Кроме того, они одобряют качественное удаление гемопоэтических клеток и выделение мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и КМ при выделении стромальных клеток.

3.2 Цитотоксичность in vitro

Колориметрический тест цитотоксичности на основе МТТ был применен для исследования жизнеспособности СККМ или АМСК после их обработки 10-30 и 35-45 нм НЧ ZnO в течение 1, 2 и 3 дней (рис. 3). Согласно данным, представленным на рис. 2, эффекты двух различных размеров НЧ ZnO на СККМ или АМСК зависели от дозы и времени. При дозе 5 и 10 мкг/мл 10-30 и 35-45 нм НЧ ZnO показали хорошую жизнеспособность для AMSC и BMSC соответственно (рис. 3). Кроме того, жизнеспособность АМСК и СККМ с 35-45 нм НЧ ZnO снижалась в зависимости от дозы и времени при тех же концентрациях (рис. 3).

3.3 Анализ клеточного цикла

Влияние наночастиц ZnO на распределение СККМ и АМСК в клеточном цикле изучали с помощью окрашивания йодидом пропидия и измеряли с помощью проточной цитометрии. Как показано на рис. 4, AMSC и BMSC, обработанные 10-30нм НЧ ZnO

показали, что соотношение клеток, вступивших в фазу GO/G1, увеличилось (82,2 и 82,01 процента) по сравнению с контрольной группой (81,92 и 78,76 процента соответственно). Когда сигналы, управляющие пролиферацией, подвергаются апоптозу или отсутствуют, клетки имеют тенденцию к увеличению G0/G1 [38].

Кроме того, в AMSCs и BMSCs, обработанных 10-30nm ZnO NPs, фаза G2/M уменьшилась (7,38 и 9,98% рецептивно) по сравнению с контрольной группой (10,04 и 13,47%), что указывает на то, что клетки были остановлены при S клеточного цикла и фазы G2/M и не были активно пролиферирующими (фиг.4). Однако анализ клеточного цикла НЧ ZnO 35-45 нм показал повышенное накопление клеток фазы G2/M в AMSCs и BMSCs (14,19 и 16,18%, рецептивно) по сравнению с контрольной группой G2/M (10,04 и 13,47%). процентов), что свидетельствует о замедлении процесса клеточного цикла (рис. 4). Когда ДНК повреждена, контрольная точка G2 ингибирует митоз клеток и обеспечивает пролиферацию безошибочных дубликатов генома в каждую дочернюю клетку.

3.4 Анализ галактозидазы in situ

Активность фермента бета-галактозидазы была использована в этой работе для проверки влияния 10-30 и 35-45 нм НЧ ZnO на старение СККМ и АМСК. Наши результаты показали, что области клеток с положительным зеленым окрашиванием чаще наблюдались в группе, получавшей ZnO NP, в обоих типах стволовых клеток крыс по сравнению с контрольной группой (рис. 5А, Б).

В нормальных клетках кислые лизосомальные -галактозидазы продуцировались и накапливались в лизосомах, как это наблюдалось в контрольных группах. Но в стареющих клетках лизосомы увеличивались и продуцировали верхний уровень -галактозидазы, названной связанной со старением -галактозидазой (SA{4}}gal), как было обнаружено в клетках, обработанных НЧ ZnO (рис. 5). Положительные клетки SA-gal окрашивались в сине-зеленый цвет при микроскопии в светлом поле. Обе обработанные клетки были положительными по сравнению с контрольными группами. Самый высокий сине-зеленый цвет был получен в AMSC с 10-30 нм НЧ ZnO (рис. 5А).

3.5 ПЦР в реальном времени

Относительную экспрессию генов NF-kB, P53 и Nanog оценивали относительно GAPDH как гена домашнего хозяйства как на СККМ, так и на АМСК, которые подвергались воздействию 5 и 10 мкг/мл НЧ ZnO в 10-30 и 35-45 нм, соответственно, через 48 часов. Результаты экспрессии генов Nanog в клетках, обработанных 10-30 и 35-45 нм НЧ ZnO, показали значительное (P<0.01)lower regulation="" in="" the="" amscs="" (fig.6a)="" and="" bmscs="" in="" comparison="" with="" the="" control="" group="" (fig.="">

Клетки, обработанные 10-30нм НЧ ZnO, показали более низкую экспрессию гена Nanog по сравнению с клетками, обработанными

4. Дискуссия

В этом исследовании оценивалось токсическое воздействие НЧ ZnO двух размеров на СККМ и АМСК: 10-30нм меньшего размера и 35-45нм большего размера. Результаты показали, что меньший размер НЧ ZnO оказывает более токсическое действие, чем их больший размер. Площадь поверхности и размер частиц НЧ являются важными свойствами материала с токсикологической точки зрения. По мере того, как размер частиц уменьшается, их поверхностная область приподнимается и позволяет показать большую часть частиц или атомов на поверхности, а не на внутренней стороне материала [39].

Наноматериалы размером менее 50 нм обладают уникальными физико-химическими свойствами из-за их небольшого размера, большой площади поверхности, низкой стоимости, повышенной реакционной способности и легкого проникновения в делители клеток [40-42]. Согласно результатам нашего МТТ-анализа, оптимальная и безопасная концентрации изучаемых малых и больших размеров НЧ ZnO составляли 5 и 10 мкг/мл соответственно по сравнению с контрольными группами. Наш анализ клеточного цикла показал, что безопасные концентрации НЧ ZnO размером 10-30 нм оказывают токсическое действие на АМСК, уменьшая количество клеток в фазах S и GO/G1, что указывает на остановку процесса клеточного цикла и потерю сигналов пролиферации влечения. НЧ ZnO размером 35-45 нм уменьшали клетки в фазах G2/M и S, что приводило к замедлению процесса клеточного цикла.

Результаты нашего исследования согласуются с результатами других исследований, показавших, что НЧ могут приводить к гибели клетки за счет повреждения ДНК или органелл [43, 44]. Хотя имеется ограниченное количество токсикологических отчетов о воздействии наночастиц ZnO, есть несколько сообщений о цитотоксических эффектах наночастиц ZnO in vitro [45-47]. Исследование показало, что окислительный стресс активировался в клетках TR146 при концентрации НЧ ZnO 10 мкг/мл [48] и в клетках SH-SY5Y при концентрации 15 мкг/мл [49]. Провоспалительный цитокин, высвобождаемый в клетках THP-1 с 17,69 мкг/мл наночастиц ZnO 【20】. Повреждение ДНК было также произведено при концентрации НЧ ZnO 6,4 мкг/мл в клетках карциномы толстой кишки человека [50] и при концентрации 12,5 мкг/мл в эпителиальных клетках почек крысы [51]. Контакт с наноматериалами неизбежен, потому что они становятся частью нашей повседневной жизни; соответственно, токсичность исследований наноматериалов принимается во внимание [52]. Рисунок 9 иллюстрирует взаимодействие НЧ ZnO в клетке млекопитающего. Определение стареющих клеток показало повышенный уровень лизосомальной -галактозидазной активности [53]. Результаты нашего теста SA- -gal показали, что НЧ ZnO как меньшего, так и большего размера (10-30 и 35-45 нм) стимулировали клетки к продукции лизосом. Однако сильный сине-зеленый цвет был вызван высокими лизосомальными уровнями в клетках, подвергшихся воздействию 10-30 нм НЧ ZnO, по сравнению с контрольной группой.

P53 работает как качество продолжительности жизни благодаря своей сильной активности подавления опухоли и контролю старения [54]. р53 может снижать и усиливать окислительный стресс, возможно, из-за его двойного влияния на старение. Наши результаты ПЦР в реальном времени показали значительно повышенную экспрессию генов p53 и NF-kB в клетках, подвергшихся воздействию наночастиц ZnO обоих размеров. Однако самая высокая сверхэкспрессия этих генов была обнаружена в клетках, обработанных меньшим размером (10-30 нм) НЧ. Более того, уровень мРНК гена Nanog считался антивозрастным геном. Для гена Nanog результаты нашего исследования показали значительное снижение обоих изученных размеров НЧ ZnO в обеих обработанных клетках. Однако самое низкое подавление при размере 10-30 нм указывает на то, что НЧ ZnO могут быть более токсичными при меньшем размере, чем при большем размере (35-45 нм).

5. Вывод

НЧ ZnO (10-30 и 35-45 нм) побуждают клетки к процессу старения. Меньший размер НЧ ZnO оказывает более токсическое воздействие на синтез ДНК, чем больший размер. Наибольшее окрашивание -галактозидазы наблюдалось при меньшем размере, чем при большем размере НЧ ZnO. Кроме того, в клетках ZnO NPs, обработанных обоими размерами, была приобретена значительная сверхэкспрессия генов, связанных со старением (NF-kB и p53). Кроме того, в клетках, обработанных наночастицами ZnO, было достигнуто значительное подавление антивозрастного гена (Nanog).

Эта статья взята из Journal of Materials Science: Materials in Medicine (2021) 32:128https://doi.org/10.1007/s10856-021-06602-x